Aislamiento, cultivo, caracterización y diferenciación de células progenitoras musculares humanas del procedimiento de biopsia muscular esquelética
Summary
Presentamos técnicas para aislar, cultivar, caracterizar y diferenciar las células progenitoras musculares primarias humanas (hMPC) obtenidas del tejido de biopsia muscular esquelética. los hMPC obtenidos y caracterizados a través de estos métodos se pueden utilizar para abordar posteriormente cuestiones de investigación relacionadas con la miogénesis humana y la regeneración muscular esquelética.
Abstract
El uso de tejido humano primario y células es ideal para la investigación de procesos biológicos y fisiológicos como el proceso regenerativo del músculo esquelético. Existen desafíos reconocidos para trabajar con células madre adultas primarias humanas, particularmente células progenitoras musculares humanas (hMPC) derivadas de biopsias del músculo esquelético, incluyendo bajo rendimiento celular del tejido recogido y un gran grado de heterogeneidad de los donantes de parámetros de crecimiento y muerte entre las culturas. Si bien la incorporación de la heterogeneidad en el diseño experimental requiere un tamaño de muestra mayor para detectar efectos significativos, también nos permite identificar mecanismos que subyacen a la variabilidad en la capacidad de expansión de hMPC, y por lo tanto nos permite entender mejor heterogeneidad en la regeneración muscular esquelética. Nuevos mecanismos que distinguen la capacidad de expansión de los cultivos tienen el potencial de conducir al desarrollo de terapias para mejorar la regeneración muscular esquelética.
Introduction
El músculo esquelético es el sistema de órganos más grande del cuerpo humano, representando entre el 30 y el 40 % de la masa corporal entera1. Además de su papel bien reconocido en la locomoción, el músculo esquelético mantiene la temperatura corporal y la postura, y juega un papel central en la homeostasis de nutrientes de todo el cuerpo. La investigación en la que participan participantes humanos, animales y modelos de cultivo celular son valiosos para abordar cuestiones relacionadas con la biología y la regeneración del músculo esquelético. El aislamiento y el cultivo de células progenitoras musculares primarias humanas (hMPC) proporcionan un modelo robusto que permite aplicar técnicas de cultivo celular y manipulaciones a muestras humanas. Una ventaja de usar hMPCs es que conservan el fenotipo genético y metabólico de cada donante2,3. El mantenimiento del fenotipo del donante permite a los investigadores examinar la variación interindividual en el proceso miogénico. Por ejemplo, hemos empleado nuestro método de caracterización hMPC para identificar diferencias relacionadas con la edad y el sexo en la capacidad de expansión de la población de hMPC4.
El propósito de este protocolo es detallar técnicas para aislar, cultivar, caracterizar y diferenciar los hMPC del tejido de biopsia muscular esquelética. Basándose en trabajos anteriores que describieron hMPCs e identificaron posibles fabricantes de superficies celulares para el aislamiento hMPC5,6, este protocolo llena una brecha crítica en el conocimiento al vincular el aislamiento con la caracterización de los hMPC. Además, las instrucciones detalladas paso a paso incluidas en este protocolo hacen que el aislamiento y la caracterización de hMPC sean accesibles para un amplio público científico, incluidas aquellas con experiencia previa limitada con hMPCs. Nuestro protocolo es uno de los primeros en describir el uso de un citómetro de imágenes para rastrear las poblaciones celulares. Los citómetros de imágenes de nuevo diseño son de última generación, de alto rendimiento y basados en microplacas, lo que permite imágenes de células vivas, recuento celular y análisis de fluorescencia multicanal de todas las células en cada pozo de un recipiente de cultivo en cuestión de minutos. Este sistema permite una rápida cuantificación de los cambios dinámicos en la proliferación y viabilidad de toda una población celular con una interrupción mínima de la cultura. Por ejemplo, somos capaces de realizar medidas objetivas de confluencia en días sucesivos in vitro para determinar la cinética de crecimiento de cada cultivo derivada de diferentes donantes. Muchos protocolos en la literatura, particularmente los que implican la diferenciación de los MMP, requieren que las células alcancen un nivel definido de confluencia antes de iniciar la diferenciación o el tratamiento7. Nuestro método permite la determinación objetiva de la confluencia de cada pozo en un recipiente de cultivo permitiendo a los investigadores iniciar el tratamiento de una manera imparcial y no subjetiva.
En el pasado, una limitación importante del uso de hMPC primarios era rendimientos bajos que limitan el número de celdas disponibles para los experimentos. Nosotros y otros hemos demostrado que el rendimiento de los MMP del tejido de biopsia de músculo esquelético es de 1 a 15 MMP por miligramo de tejido (Figura1)8. Debido a que nuestro protocolo permite cuatro pasajes de las células antes de la purificación con clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), nuestros rendimientos crioconservados de hMPC, derivados de pequeñas cantidades de tejido de biopsia (50-100 mg), son suficientes para abordar los objetivos de investigación donde los objetivos de investigación donde se requieren múltiples experimentos. Nuestro protocolo FACS produce una población MPC pura (Pax7 positiva) del 80 %, por lo que nuestro protocolo está optimizado tanto para el rendimiento como para la pureza.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los hMPC primarios son un modelo de investigación importante utilizado para entender la biología muscular esquelética y el proceso regenerativo. Además, los hMPCs tienen el potencial de ser utilizados para la terapia. Sin embargo, hay desafíos reconocidos en el uso de hMPCprimarios primarios para la investigación y la terapia, incluyendo la comprensión limitada de las células derivadas de los seres humanos10. También hay un gran grado de variación en la capacidad de expansión entre los …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a la Universidad de Cornell, Biotechnology Resource Center Imaging Facility por su ayuda con la clasificación celular activada por fluorescencia. También agradecemos a Molly Gheller por su ayuda con el reclutamiento de participantes y Erica Bender por llevar a cabo las biopsias del músculo esquelético. Por último, agradecemos a los participantes su tiempo y participación en el estudio. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Número de Premio R01AG058630 (a B.D.C. y A.E.T.), por una Glenn Foundation for Medical Research y American Federation for Aging Research Grant for Junior Faculty (a B . D.C.), y por el Consejo Presidente para las Mujeres de Cornell (a A.E.T.).
Materials
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-Cl | Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels |
| 10 cm cell culture plate | VWR | 664160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 15 mL Falcon tube | Falcon | 352196 | 15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols |
| 24 well cell culture plate | Grenier Bio-One | 662 160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | Viability stain for identifying living cells during FACS sorting |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16 | BioLegend | 303016 | Conjugated antibody for FACS |
| Black 96-well cell culture plate | Grenier Bio-One | 655079 | 96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S |
| Celigo S | Nexcelcom Bioscience | Imaging cytometer used to track hMPC cultures | |
| Cell Strainer | VWR | 352350 | Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing |
| Collagen Type I (Rat Tail) | Corning | 354236 | Collagen for coating cell culture plates |
| Collagenase D | Roche | 11 088 882 001 | Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue |
| Dimethyl Sulfoxide | VWR | WN182 | Used for cryopreservation of hMPCs |
| Dispase II | Sigma Life Sciences | D4693 | A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder | Gibco | 31600-034 | Low glucose DMEM for muscle biopsy processing |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 21600-010 | PBS for muscle biopsy processing |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | J.T. Baker | 4040-01 | Required for FACS buffer |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 89510-186 | Fetal bovine serum used for hMPC growth media |
| Ham's F12 | Gibco | 21700-026 | Base media for hMPCs |
| Heat Inactivated Equine Serum | Gibco | 26-050-070 | Horse serum used to make hMPC differentiation media |
| Hemocytometer | iNCyto | DHC-N0105 | Used to count cells |
| Hibernate A | Gibco | A1247501 | Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue |
| Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Life Technologies | H21492 | DNA stain for identifying all cells using the Celigo S |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P-4 | Used for controlled rate freezing of hMPCs |
| Moxi buffer | Orflo | MXA006 | Buffer for automated cell counter |
| Moxi Cassettes | Orflo | MXC002 | Cassesttes for automated cell counter |
| Moxi z Mini Automated Cell Counter | Orflo | Automated cell counter | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | Commerically available controlled rate cell freezing container |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Goat serum used in FACS buffer |
| PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159 | BD Pharmingen | 557747 | Conjugated antibody for FACS |
| Penicillin/Streptomycin 100X Solution | Corning | 30-002-CI | Antibiotics added to culture media |
| Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S |
| Recombinant Human basic fibroblast growth factor | Promega | G5071 | Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Gibco | 12648-010 | Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | Added to Ham's F12 |
| Sterile Round Bottom 5 mL tubes | VWR | 60818-565 | Tubes used for FACS |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | Compensation beads fort calibrating flow FACS settings |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- D’Souza, D. M., et al. Decreased satellite cell number and function in humans and mice with type 1 diabetes is the result of altered notch signaling. Diabetes. 65 (10), 3053-3061 (2016).
- Scheele, C., et al. Satellite cells derived from Obese humans with type 2 diabetes and differentiated into Myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).
- Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. E. Expansion capacity of human muscle progenitor cells differs by age, sex, and metabolic fuel preference. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 315 (5), C643-C652 (2018).
- Charville, G. W., et al. Ex vivo expansion and in vivo self-renewal of human muscle stem cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
- Alexander, M. S., et al. CD82 Is a Marker for Prospective Isolation of Human Muscle Satellite Cells and Is Linked to Muscular Dystrophies. Cell Stem Cell. 19 (6), 800-807 (2016).
- Thalacker-Mercer, A., et al. Cluster analysis reveals differential transcript profiles associated with resistance training-induced human skeletal muscle hypertrophy. Physiological Genomics. 45 (12), 499-507 (2013).
- Garcia, S. M., et al. High-Yield Purification, Preservation, and Serial Transplantation of Human Satellite Cells. Stem Cell Reports. 10 (3), 1160-1174 (2018).
- Yokoyama, W. M., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. Cryopreservation and thawing of cells. Current Protocols in Immunology. , (2012).
- Bareja, A., Billin, A. N. Satellite cell therapy – from mice to men. Skeletal Muscle. 3 (1), 2 (2013).
- Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. Transcript profile distinguishes variability in human myogenic progenitor cell expansion capacity. Physiological Genomics. 50 (10), 817-827 (2018).
- Xu, X., et al. Human Satellite Cell Transplantation and Regeneration from Diverse Skeletal Muscles. Stem Cell Reports. 5 (3), 419-434 (2015).
