अलगाव, संस्कृति, चरित्र, और कंकाल स्नायु बायोप्सी प्रक्रिया से मानव स्नायु संतति कोशिकाओं के भेदभाव
Summary
हम अलग करने के लिए तकनीक मौजूद, culturing, विशेषता, और मानव प्राथमिक मांसपेशी जनक कोशिकाओं (hMPCs) कंकाल मांसपेशी बायोप्सी ऊतक से प्राप्त differentiating. hMPCs प्राप्त और इन तरीकों के माध्यम से विशेषता बाद में मानव myogenesis और कंकाल मांसपेशी पुनर्जनन से संबंधित अनुसंधान सवालों का पता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
प्राथमिक मानव ऊतक और कोशिकाओं का उपयोग इस तरह के कंकाल मांसपेशी पुनर्योजी प्रक्रिया के रूप में जैविक और शारीरिक प्रक्रियाओं की जांच के लिए आदर्श है। मानव प्राथमिक वयस्क स्टेम कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए मान्यता प्राप्त चुनौतियों, विशेष रूप से मानव मांसपेशी जनक कोशिकाओं (hMPCs) कंकाल की मांसपेशी बायोप्सी से व्युत्पन्न, एकत्र ऊतक से कम सेल उपज और दाता विषमता की एक बड़ी डिग्री सहित विकास और संस्कृतियों के बीच मौत मानकों. प्रयोगात्मक डिजाइन में विषमता को शामिल करते समय महत्वपूर्ण प्रभाव का पता लगाने के लिए एक बड़ा नमूना आकार की आवश्यकता है, यह भी हमें तंत्र है कि hMPC विस्तार क्षमता में variability underlie की पहचान करने के लिए अनुमति देता है, और इस तरह हमें बेहतर समझने के लिए अनुमति देता है कंकाल की मांसपेशी पुनर्जनन में विषमता. उपन्यास तंत्र है कि संस्कृतियों के विस्तार की क्षमता भेद कंकाल मांसपेशी पुनर्जनन में सुधार करने के लिए चिकित्सा के विकास के लिए नेतृत्व करने की क्षमता है.
Introduction
कंकाल की मांसपेशी मानव शरीर में सबसे बड़ा अंग प्रणाली है, पूरे शरीर द्रव्यमान1के 30 $40% के लिए लेखांकन. चलन में अपनी अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त भूमिका के अलावा, कंकाल की मांसपेशी शरीर के तापमान और मुद्रा को बनाए रखता है, और पूरे शरीर पोषक तत्व homeostasis में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है। मानव प्रतिभागियों, जानवरों, और सेल संस्कृति मॉडल शामिल अनुसंधान सभी कंकाल मांसपेशी जीव विज्ञान और पुनर्जनन से संबंधित सवालों का पता करने के लिए मूल्यवान हैं. अलगाव और मानव प्राथमिक मांसपेशी जनक कोशिकाओं की संस्कृति (hMPCs) एक मजबूत मॉडल है कि सेल संस्कृति तकनीक और जोड़तोड़ के लिए मानव नमूने के लिए लागू किया जा करने के लिए अनुमति देता है प्रदान करता है. एचएमपीसी का उपयोग करने का एक लाभ यह है कि वे प्रत्येक दाता2,3से आनुवंशिक और उपापचयी फीनोटाइप को बनाए रखते हैं . दाता phenotype के रखरखाव शोधकर्ताओं myogenic प्रक्रिया में अंतर-व्यक्तिगत भिन्नता की जांच करने के लिए अनुमति देता है. उदाहरण के लिए, हमने एचएमपीसी जनसंख्या विस्तार क्षमता4में आयु और लिंग संबंधी अंतरों की पहचान करने के लिए अपनी एचएमपीसी अभिलक्षण पद्धति का प्रयोग किया है।
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य अलग करने के लिए तकनीक विस्तार करने के लिए है, संस्कृति, विशेषता, और कंकाल की मांसपेशी बायोप्सी ऊतक से hMPCs अंतर. पिछले काम है कि hMPCs वर्णित पर बिल्डिंग और hMPC अलगाव5,6के लिए संभावित सेल सतह निर्माताओं की पहचान की, इस प्रोटोकॉल hMPCs की विशेषता के लिए अलगाव को जोड़ने के द्वारा ज्ञान में एक महत्वपूर्ण अंतर भरता है. इसके अलावा, विस्तृत कदम दर कदम निर्देश इस प्रोटोकॉल में शामिल hMPC अलगाव और विशेषता एक व्यापक वैज्ञानिक दर्शकों के लिए सुलभ बनाने, hMPCs के साथ सीमित पूर्व अनुभव के साथ उन सहित. हमारे प्रोटोकॉल सेल आबादी को ट्रैक करने के लिए एक इमेजिंग साइटोमीटर के उपयोग का वर्णन करने के लिए पहले के बीच है। नव डिजाइन इमेजिंग cytometers राज्य के-the-कला, उच्च-थ्रूपुट, और microplate आधारित हैं, सक्षम करने लाइव सेल इमेजिंग, सेल गिनती, और multichannel फ्लोरोसेंट विश्लेषण मिनट के भीतर एक संस्कृति पोत के प्रत्येक में सभी कोशिकाओं के. इस प्रणाली के प्रसार और संस्कृति के लिए केवल कम से कम व्यवधान के साथ एक पूरे सेल आबादी की व्यवहार्यता में गतिशील परिवर्तन के तेजी से परिमाणीकरण के लिए अनुमति देता है. उदाहरण के लिए, हम विभिन्न दाताओं से व्युत्पन्न प्रत्येक संस्कृति के विकास गतिकी निर्धारित करने के लिए इन विट्रो में क्रमिक दिनों पर संगम के उद्देश्य उपाय करने में सक्षम हैं। साहित्य में कई प्रोटोकॉल, विशेष रूप से एमपीसी के भेदभाव से जुड़े लोगों के लिए कोशिकाओं को भेदभाव या उपचार7की शुरुआत करने से पहले संगम के एक परिभाषित स्तर तक पहुंचने की आवश्यकता होती है। हमारी विधि शोधकर्ताओं को एक निष्पक्ष, गैर-विषयक तरीके से उपचार शुरू करने की अनुमति देने वाले एक संस्कृति पोत में प्रत्येक कुएं के संगम के उद्देश्य निर्धारण की अनुमति देती है।
अतीत में, प्राथमिक hMPCs का उपयोग करने की एक प्रमुख सीमा कम पैदावार है कि प्रयोगों के लिए उपलब्ध कोशिकाओं की संख्या को सीमित किया गया था. हम और अन्य कंकाल मांसपेशी बायोप्सी ऊतक से एमपीसी की उपज से पता चला है 1 डिग्री 15 MPCs ऊतक के मिलीग्राम प्रति है (चित्र 1)8. क्योंकि हमारे प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई के साथ शुद्धि से पहले कोशिकाओं के चार अंश के लिए अनुमति देता है (FACS), हमारे cryopreserved hMPC पैदावार, बायोप्सी ऊतक की छोटी मात्रा से व्युत्पन्न (50 डिग्री 100 मिलीग्राम), अनुसंधान लक्ष्य ों को संबोधित करने के लिए पर्याप्त हैं जहां कई प्रयोगों की आवश्यकता है. हमारे FACS प्रोटोकॉल एक $ 80% शुद्ध (Pax7 सकारात्मक) एमपीसी आबादी का उत्पादन, इस प्रकार हमारे प्रोटोकॉल दोनों उपज और शुद्धता के लिए अनुकूलित है.
Protocol
Representative Results
Discussion
प्राथमिक hMPCs एक महत्वपूर्ण अनुसंधान मॉडल कंकाल मांसपेशी जीव विज्ञान और पुनर्योजी प्रक्रिया को समझने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. इसके अतिरिक्त, hMPCs चिकित्सा के लिए इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है. तथा?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को कॉर्नेल विश्वविद्यालय, जैव प्रौद्योगिकी संसाधन केंद्र इमेजिंग सुविधा फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई के साथ उनकी मदद के लिए धन्यवाद. हम भी भागीदार भर्ती और एरिका शराबी कंकाल मांसपेशी बायोप्सी के संचालन के लिए के साथ उसकी मदद के लिए मौली Gheller धन्यवाद. अंत में, हम अपने समय और अध्ययन में भाग लेने के लिए प्रतिभागियों को धन्यवाद. यह काम पुरस्कार संख्या R01AG058630 के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों की उम्र बढ़ने पर राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था (B.D.C. और A.E.T. करने के लिए), चिकित्सा अनुसंधान के लिए एक ग्लेन फाउंडेशन और जूनियर संकाय के लिए उम्र बढ़ने अनुसंधान अनुदान के लिए अमेरिकी संघ द्वारा (बी करने के लिए . डीसी, और कॉर्नेल महिलाओं के लिए राष्ट्रपति परिषद द्वारा (ए.ई.टी.) के लिए.
Materials
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-Cl | Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels |
| 10 cm cell culture plate | VWR | 664160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 15 mL Falcon tube | Falcon | 352196 | 15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols |
| 24 well cell culture plate | Grenier Bio-One | 662 160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | Viability stain for identifying living cells during FACS sorting |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16 | BioLegend | 303016 | Conjugated antibody for FACS |
| Black 96-well cell culture plate | Grenier Bio-One | 655079 | 96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S |
| Celigo S | Nexcelcom Bioscience | Imaging cytometer used to track hMPC cultures | |
| Cell Strainer | VWR | 352350 | Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing |
| Collagen Type I (Rat Tail) | Corning | 354236 | Collagen for coating cell culture plates |
| Collagenase D | Roche | 11 088 882 001 | Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue |
| Dimethyl Sulfoxide | VWR | WN182 | Used for cryopreservation of hMPCs |
| Dispase II | Sigma Life Sciences | D4693 | A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder | Gibco | 31600-034 | Low glucose DMEM for muscle biopsy processing |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 21600-010 | PBS for muscle biopsy processing |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | J.T. Baker | 4040-01 | Required for FACS buffer |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 89510-186 | Fetal bovine serum used for hMPC growth media |
| Ham's F12 | Gibco | 21700-026 | Base media for hMPCs |
| Heat Inactivated Equine Serum | Gibco | 26-050-070 | Horse serum used to make hMPC differentiation media |
| Hemocytometer | iNCyto | DHC-N0105 | Used to count cells |
| Hibernate A | Gibco | A1247501 | Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue |
| Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Life Technologies | H21492 | DNA stain for identifying all cells using the Celigo S |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P-4 | Used for controlled rate freezing of hMPCs |
| Moxi buffer | Orflo | MXA006 | Buffer for automated cell counter |
| Moxi Cassettes | Orflo | MXC002 | Cassesttes for automated cell counter |
| Moxi z Mini Automated Cell Counter | Orflo | Automated cell counter | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | Commerically available controlled rate cell freezing container |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Goat serum used in FACS buffer |
| PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159 | BD Pharmingen | 557747 | Conjugated antibody for FACS |
| Penicillin/Streptomycin 100X Solution | Corning | 30-002-CI | Antibiotics added to culture media |
| Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S |
| Recombinant Human basic fibroblast growth factor | Promega | G5071 | Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Gibco | 12648-010 | Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | Added to Ham's F12 |
| Sterile Round Bottom 5 mL tubes | VWR | 60818-565 | Tubes used for FACS |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | Compensation beads fort calibrating flow FACS settings |
References
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