Isolering, kultur, karakterisering, och differentiering av humana muskelstamceller från skelettmuskulaturen biopsi förfarande

Summary

Vi presenterar tekniker för att isolera, odla, karakterisera och differentiera mänskliga primära muskelstamceller (hMPCs) som erhållits från skelettmuskel biopsi vävnad. hmpcs erhålls och kännetecknas genom dessa metoder kan användas för att därefter behandla forskningsfrågor relaterade till mänsklig myogenes och skelettmuskulaturen förnyelse.

Abstract

Användningen av primär mänsklig vävnad och celler är idealisk för utredning av biologiska och fysiologiska processer såsom skelettmuskulaturen regenerativ process. Det finns erkända utmaningar att arbeta med mänskliga primära vuxna stamceller, särskilt humana muskelstamceller (hMPCs) härrör från skelettmuskel biopsier, inklusive låg cell avkastning från insamlade vävnad och en stor grad av givarens heterogenitet av tillväxt och död parametrar bland kulturer. Samtidigt införliva heterogenitet i experimentell design kräver en större urvalsstorlek för att upptäcka betydande effekter, det gör det också möjligt för oss att identifiera mekanismer som ligger bakom variationer i hMPC expansions kapacitet, och därmed ger oss möjlighet att bättre förstå heterogenitet i skelettmuskulaturen förnyelse. Nya mekanismer som skiljer kulturernas expansions förmåga har potential att leda till utveckling av terapier för att förbättra skelettmuskel förnyelse.

Introduction

Skelettmuskulaturen är det största organsystemet i människokroppen, står för 30 − 40% av hela kroppen massa¹. Förutom sin väl erkända roll i Locomotion, skelettmuskulaturen upprätthåller kroppstemperatur och hållning, och spelar en central roll i hela kroppen näringsämnen homeostas. Forskning som involverar mänskliga deltagare, djur och modeller cellkulturer är alla värdefulla för att ta itu med frågor som rör skelettmuskulaturen biologi och förnyelse. Isolering och kultur av mänskliga primära muskelstamceller (hMPCs) ger en robust modell som gör det möjligt för cellkulturer tekniker och manipulationer som skall tillämpas på mänskliga prover. Fördelen med att använda hmpcs är att de behåller den genetiska och metaboliska fenotypen från varje donator^2,3. Underhåll av donatorns fenotyp gör det möjligt för forskarna att undersöka inter-individuell variation i den myogena processen. Till exempel har vi använt vår hMPC karakterisering metod för att identifiera ålder och kön-relaterade skillnader i hMPC populations expansion kapacitet⁴.

Syftet med detta protokoll är att detalj tekniker för att isolera, kultur, karakterisera, och differentiera hMPCs från skelettmuskel biopsi vävnad. Bygger på tidigare arbete som beskrivs hmpcs och identifierade potentiella cell ytan beslutsfattare för HMPC isolering^5,6, detta protokoll fyller ett kritiskt gap i kunskap genom att koppla isoleringen till karakterisering av hmpcs. Vidare, detaljerade steg-för-steg-instruktioner som ingår i detta protokoll gör hMPC isolering och karakterisering tillgänglig för en bred vetenskaplig publik, inklusive de med begränsad tidigare erfarenhet av hMPCs. Vårt protokoll är bland de första som beskriver användningen av en avbildning flödescytometerns för att spåra cellpopulationer. Nydesignade Imaging flödescytometrar är State-of-the-art, hög genomströmning, och Microplate-baserade, möjliggör levande cell avbildning, cellräkning, och flerkanals fluorescens analys av alla celler i varje brunn av ett kultur fartyg inom några minuter. Detta system möjliggör en snabb kvantifiering av dynamiska förändringar i spridningen och livskraften hos en hel cellpopulation med endast minimala störningar i kulturen. Till exempel kan vi utföra objektiva mått av sammanflödet på på varandra följande dagar in vitro för att bestämma tillväxtkinetik av varje kultur som härrör från olika givare. Många protokoll i litteraturen, särskilt de som inbegriper differentiering av MPCs, kräver celler för att nå en definierad nivå av sammanflödet innan du påbörjar differentiering eller behandling⁷. Vår metod möjliggör objektiv bestämning av sammanflödet av varje brunn i ett kultur fartyg som gör det möjligt för forskare att initiera behandling på ett opartisk, icke-subjektivt sätt.

Tidigare var en stor begränsning av att använda primära hMPCs låg avkastning som begränsar antalet celler som är tillgängliga för experiment. Vi och andra har visat avkastningen av MPCs från skelettmuskel biopsi vävnad är 1 − 15 MPCs per milligram vävnad (figur 1)⁸. Eftersom vårt protokoll tillåter fyra passager av cellerna före rening med fluorescens aktiverad cell sortering (FACS), våra nedfrysta HMPC avkastning, som härrör från små mängder av biopsi vävnad (50 − 100 mg), är tillräckliga för att ta itu med forskningsmål där Det krävs flera experiment. Vår FACS-protokollet ger en ~ 80% ren (Pax7 positiv) MPC population, vilket vårt protokoll är optimerad för både avkastning och renhet.

Protocol

Detta protokoll godkändes av den institutionella Granskningsnämnden vid Cornell University. Alla deltagare screenades för underliggande hälsotillstånd och gav informerat samtycke. 1. få mänsklig muskelvävnad via skelettmuskulaturen biopsi Identifiera vastus lateralis muskeln via palpation, anatomiska landmärken och aktiv sammandragning av muskeln. Palpate den vastus lateralis genom att ha deltagaren skärpa sina quadriceps muskler och hitta magen av muskeln, om 1/3…

Representative Results

Representativa flödescytometri resultat av hMPC-isolering från mänsklig muskelvävnad kan ses i figur 1. hMPCs kan identifieras genom första gating händelser baserat på sidan scatter och framåt scatter för att eliminera döda celler eller skräp, följt av att välja endast celler som är negativa för 7-AAD och därför är livskraftiga. Val av celler positiva för både cell ytan markörer CD56 och CD29 representerar hMPC populationen. En biopsi av …

Discussion

Primära hMPCs är en viktig forskningsmodell som används för att förstå skelettmuskulaturen biologi och regenerativ process. Dessutom, hMPCs har potential att användas för behandling. Emellertid, det finns erkända utmaningar i att använda primära hMPCs för både forskning och terapi, inklusive begränsad förståelse av celler som härrör från människor¹⁰. Det finns också en stor grad av variation i expansions kapaciteten bland givar kulturer, vilket begränsar potentialen för anv?…

Materials

0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-Cl	Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels
10 cm cell culture plate	VWR	664160	Plates used for culturing hMPCs
15 mL Falcon tube	Falcon	352196	15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols
24 well cell culture plate	Grenier Bio-One	662 160	Plates used for culturing hMPCs
7-AAD Viability Staining Solution	eBioscience	00-6993-50	Viability stain for identifying living cells during FACS sorting
Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16	BioLegend	303016	Conjugated antibody for FACS
Black 96-well cell culture plate	Grenier Bio-One	655079	96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S
Celigo S	Nexcelcom Bioscience		Imaging cytometer used to track hMPC cultures
Cell Strainer	VWR	352350	Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing
Collagen Type I (Rat Tail)	Corning	354236	Collagen for coating cell culture plates
Collagenase D	Roche	11 088 882 001	Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue
Dimethyl Sulfoxide	VWR	WN182	Used for cryopreservation of hMPCs
Dispase II	Sigma Life Sciences	D4693	A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue
Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder	Gibco	31600-034	Low glucose DMEM for muscle biopsy processing
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	21600-010	PBS for muscle biopsy processing
EDTA Disodium Salt Dihydrate	J.T. Baker	4040-01	Required for FACS buffer
Fetal Bovine Serum	VWR	89510-186	Fetal bovine serum used for hMPC growth media
Ham's F12	Gibco	21700-026	Base media for hMPCs
Heat Inactivated Equine Serum	Gibco	26-050-070	Horse serum used to make hMPC differentiation media
Hemocytometer	iNCyto	DHC-N0105	Used to count cells
Hibernate A	Gibco	A1247501	Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate	Life Technologies	H21492	DNA stain for identifying all cells using the Celigo S
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P-4	Used for controlled rate freezing of hMPCs
Moxi buffer	Orflo	MXA006	Buffer for automated cell counter
Moxi Cassettes	Orflo	MXC002	Cassesttes for automated cell counter
Moxi z Mini Automated Cell Counter	Orflo		Automated cell counter
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	Commerically available controlled rate cell freezing container
Normal Goat Serum (10%)	Thermo Fisher Scientific	50062Z	Goat serum used in FACS buffer
PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159	BD Pharmingen	557747	Conjugated antibody for FACS
Penicillin/Streptomycin 100X Solution	Corning	30-002-CI	Antibiotics added to culture media
Propidium iodide	Thermo Fisher Scientific	P3566	DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S
Recombinant Human basic fibroblast growth factor	Promega	G5071	Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Gibco	12648-010	Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-3	Added to Ham's F12
Sterile Round Bottom 5 mL tubes	VWR	60818-565	Tubes used for FACS
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42	Compensation beads fort calibrating flow FACS settings