Summary
Este protocolo ilustra un método de encapsulación celular mediante la gelación física rápida de alginato para inmovilizar las células. Los microperlas obtenidos permiten la secreción controlada y sostenida de amiloide a lo largo del tiempo y se pueden utilizar para estudiar los efectos de los amiloides secretos en modelos in vitro e in vivo.
Abstract
Según la hipótesis de la cascada amiloide, el principal desencadenante en el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer (AD) es la acumulación de fragmentos tóxicos de amiloide , que eventualmente conducen a las características clásicas de la enfermedad: placas amiloideas, enredos neurofibrilares y pérdida sináptica y neuronal. La falta de modelos preclínicos no transgénicos relevantes que reflejen la progresión de la enfermedad es uno de los principales factores que obstaculizan el descubrimiento de tratamientos farmacológicos eficaces. Con este fin, hemos desarrollado un protocolo para la fabricación de microperlas de alginato que contienen células secretantes de amiloide útiles para el estudio de los efectos de la producción crónica de A.
En este estudio se utilizaron células de ovario de hámster chino previamente transcitadas con un gen APP humano, que segrega a A (es decir, células 7PA2). Un modelo tridimensional (3D) in vitro para la liberación sostenida de A - fue fabricado por encapsulación de células 7PA2 en alginato. El proceso se optimizó para apuntar a un diámetro de perlas de 500-600 m para estudios más in vivo. La optimización de la encapsulación celular 7PA2 en alginato se realizó alterando los parámetros de fabricación, por ejemplo, la concentración de alginato, el caudal de gel, el potencial electrostático, la frecuencia de vibración de la cabeza, la solución de gelificación. Los niveles de A- secretado se analizaron a lo largo del tiempo y se compararon entre las perlas de alginato y los métodos de cultivo celular estándar (hasta 96 h).
Se encontró una concentración de 1,5 x 106 7PA2 células/ml y una concentración de alginato de 2% (p/v) amortiguada con HEPES y gelación posterior en cloruro de calcio de 0,5 M durante 5 min para fabricar los microperlas más estables. Los microperlas fabricados eran 1) de tamaño uniforme, 2) con un diámetro medio de 550 m, 3) que contenían alrededor de 100-150 células por microperla dispensa y 4) capaces de secretar A.
En conclusión, nuestro método optimizado para la producción de microperlas de alginato establequecon células 7PA2 productoras de amiloide podría permitir el modelado de aspectos importantes de la AD tanto in vitro como in vivo.
Introduction
Modelar enfermedades neurodegenerativas es un reto debido a la naturaleza compleja e intrincada del cerebro. En la enfermedad de Alzheimer (AD), se cree que la pérdida progresiva de la función sináptica y la muerte de las neuronas es un efecto posterior de la sobreproducción sostenida y la acumulación de péptidos beta amiloide (A) después del procesamiento anormal del precursor amiloide proteína (APP) según la hipótesis de la cascada amiloide1.
Con el fin de comprender los mecanismos de esta patología inducida por amiloide y ayudar en la identificación de nuevos objetivos de tratamiento, los científicos han desarrollado varios modelos preclínicos in vivo. Una categoría de modelos utiliza una inyección de bolo de un péptido sintético A en el cerebro de la rata2,3,4. La principal limitación de estos modelos es que se basan en un único punto o en tratamientos repetidos con péptidos A en altas concentraciones depositadas de una sola vez. Esto es incompatible con la naturaleza crónica y sostenida de la liberación de A en la enfermedad5. Otra categoría de modelos in vivo son los modelos animales transgénicos que expresan una o más mutaciones genéticas relacionadas con las variaciones familiares de la enfermedad6,7,8,9, 10. Sin embargo, dado que la AD familiar sólo representa menos del 5% de todos los casos de Alzheimer11, la relevancia de estos modelos en la traducción a la AD esporádica en los seres humanos es cuestionable12. Otro inconveniente del enfoque transgénico es la formación acelerada de A desde el nacimiento, que se traduce en déficits en la función cognitiva y cambios patológicos demasiado rápido y agresivo para parecerse a la progresión de la enfermedad en la AD esporádica en pacientes12 . Por ejemplo, el modelo FAD 5x produce placas en tan solo 1,5 meses13.
Curiosamente, ambas categorías resultan en cambios en la función cognitiva de relevancia para la investigación AD2,3,4,5,6, y a veces están acompañados por el aparición de señas de identidad patológicas de la enfermedad como placas amiloideas6,8, foro fosforilacióntau 6,7 y/o pérdida sináptica y neuronal7,9, 14. Pero si bien este tipo de modelos pueden darnos una idea de los efectos de los altos niveles de amiloide en el cerebro, que a menudo se asocian con etapas posteriores de ad, no reflejan los cambios anteriores exhibidos en respuesta a la exposición crónica y sostenida a los A péptido12,como la expresión alterada de marcadores sinápticos15 y componentes en la matriz extracelular16. Por lo tanto, todavía queda la necesidad de crear un modelo crónico que ilustre con mayor precisión los efectos de la secreción sostenida de A en la cognición in vivo e ilustre los cambios en la patología.
Para ello, hemos desarrollado un sistema que permite la secreción constante y sostenida de Ade relavidar de forma controlada mediante la inmovilización de células secretoras de amiloide dentro de microperlas de hidrogel, que posteriormente se pueden implantar dentro del cerebro adulto de la rata para modelar aspectos de la AD esporádica.
El alginato fue el biomaterial seleccionado, ya que es biocompatible y no induce ninguna respuesta adversa cuando se implanta in vivo17. La encapsulación celular en hidrogeles de alginato ha estado bien establecida en las últimas cuatro décadas. El primer ejemplo de su traducción a la clínica fue reportado para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 117. El primer informe de encapsulación exitosa de islotes de Langerhans data de 1980. El trasplante de microperlas que contienen células secretoras de insulina revolucionó las opciones de tratamiento para los pacientes diabéticos, ya que restauró la función pancreática, eliminando la necesidad de terapia de inyección de insulina18. Estos trabajos informan sobre cómo la encapsulación celular puede protegerlos de tensiones externas, ya sean mecánicas o químicas. De hecho, las cuentas de alginato actúan como una barrera y aíslan las células del entorno circundante preservando su fenotipo, al tiempo que permiten un acceso suficiente a los medios circundantes para nutrientes y aclaramiento de subproductos celulares19. Además, el uso de alginato permite la coincidencia de las propiedades mecánicas del tejido blando20. Los hidrogeles de alginato se pueden ajustar para tener una rigidez de 1-30 kPa, simplemente variando la concentración de alginato y la densidad de reticulación20,21. Este es un aspecto esencial, no sólo para mantener la expresión fenotípica de las células encapsuladas in vitro, sino también para evitar cualquier efecto inflamatorio después del injerto in vivo22.
En este protocolo, se utilizan células 7PA2 - una línea celular de ovario de hámster chino que está establemente transfectó con un gen mutado APP V717F humano23 - se utilizan. Estas células producen continuamente productos catalíticos de APP, incluyendo A-1-4224,25, y se han utilizado para generar A - como una alternativa a la producción sintética en estudios preclínicos, agudos in vivo26. Describimos un método de fabricación para inmovilizar células 7PA2 dentro de microperlas de alginato 'blando', diseñadas para permitir la secreción sostenida de biomoléculas. Como prueba de concepto, informamos sobre la liberación del péptidoA-1-42 a lo largo del tiempo. El alginato que se utiliza es un alginato de baja viscosidad con un peso molecular de 120.000-190.000 g/mol y una relación mantasanónica a gulurónica de 1,56 (M/G).
En estudios posteriores, estas microperlas se pueden trasplantar de forma segura dentro de regiones del cerebro de rata de relevancia para AD (por ejemplo, el hipocampo) para estudiar los efectos de la secreción crónica de A en el comportamiento in vivo y patología exvivo. Además, este sistema se puede utilizar para estudiar los efectos de la liberación crónica de A en aplicaciones in vitro y ex vivo. Por ejemplo, las microperlas de alginato que contienen 7PA2 se pueden cocultivar in vitro con cultivos neuronales o astrocíticos para evaluar los efectos de la exposición crónica a A en los mecanismos celulares asociados con la AD. Además, este método se puede utilizar para examinar la relación entre la producción crónica de A y la potenciación a largo plazo en la electrofisiología ex vivo.
El punto culminante de este protocolo es la modularidad y flexibilidad del método de fabricación, que permite la fabricación de perlas de alginato con una dimensión de destino mediante el ajuste fino de los parámetros de fabricación. Dependiendo de la aplicación, el protocolo se puede ajustar para obtener objetivos a medida con respecto al tamaño del microperladinario, la densidad de las células encapsuladas y la rigidez del microper. Este protocolo se puede utilizar para la encapsulación de una variedad de tipos de células, desarrollando modelos tridimensionales (3D) in vitro más relevantes para estudiar diferentes patologías. Recientemente informamos sobre cómo las células encapsuladas en alginato se pueden utilizar para modelar las primeras etapas de la progresión del cáncer20.
El concepto del proceso de encapsulación se basa en la extrusión de un chorro laminar de células suspendidas en solución de alginato a través de una boquilla. Un cabezal vibratorio interrumpe el chorro con una frecuencia controlada, lo que resulta en gotas basadas en alginato según el mismo tamaño. Un campo eléctrico externo permite la separación de las gotas a base de alginato formadas, que al entrar en contacto con una solución enriquecida en iones divalentes, como los iones de calcio, pueden cruzar rápidamente los enlaces, preservando su forma esférica. La incubación en la solución de gelitación permite la formación de microperlas esféricas que contienen células dentro de un hidrogel físico homogéneo27. El tamaño objetivo de los microperlas y los hidrogeles de alginato permite el intercambio de nutrientes y oxígeno con medios de cultivo celular durante largos períodos de tiempo (semanas). Figura 1 A mostrar una representación esquemática del aparato de encapsulación utilizado (Figura1B).
Figura 1 : El sistema de encapsulación. (A) Representación esquemática del sistema de encapsulación. Una suspensión de células de alginato se carga en una jeringa (2) y se alimenta a través de un depósito a una velocidad de extrusión establecida en la bomba de la jeringa (1). En el depósito, un sombrero de vibración (3) vibra a una frecuencia establecida por un generador de forma de onda (4) para interrumpir la corriente a intervalos iguales, formando gotas de igual tamaño. A medida que la solución se alimenta a través de una boquilla (5) y se forman gotas, se aplica un potencial electrostático a través de un electrodo (7) establecido por un generador de voltaje (6), que carga ligeramente la superficie de las gotas, permitiendo que la corriente se propague como resultado de repeler fuerzas electrostáticas. A medida que las gotas se involucran con el baño de gelación (8), la reticulación impulsada por Ca2+de alginato da como resultado la formación de microperlas esféricas. (B) Fotografía del encapsulador antes de la fabricación de microperlas de alginato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El tamaño del microperla se puede modificar dependiendo del uso previsto. Para controlar el tamaño del microperlador, los diversos parámetros descritos en la Figura 1A y en el protocolo se ajustan en consecuencia. El diámetro interno de la boquilla utilizada tiene un impacto sustancial en el tamaño de las gotas; ajustar aún más los parámetros de encapsulación, a saber, la velocidad de extrusión, la frecuencia de vibración y el voltaje, es clave para lograr una distribución de tamaño consistente. Tabla 1 describe cómo los diferentes parámetros pueden alterar el tamaño de los microperlas logrados con este sistema.
| Parámetro | Tamaño de la boquilla | Frecuencia de vibración | Caudal | Tensión de electrodo |
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| Tamaño del cordón |
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Tabla 1: Parámetros de fabricación y su influencia en el tamaño del microperla. La tabla ilustra cómo cada parámetro puede influir en el tamaño resultante de los microperlas fabricados, independientemente de la boquilla y la viscosidad de la solución utilizada.
Protocol
1. Preparativos
- Prepare 100 ml de solución de calonado de alginato del 4 % (p/v).
- Pesar 4,4 g de sal de alginato de sodio y añadir el polvo seco a 100 ml de solución salina tamponada HEPES (HBS, 20 mM HEPES (0,477 g) con 150 mM de NaCl (0,877 g) en agua desionizada que permite la hidratación.
- Utilice un agitador magnético a 500 revoluciones por minuto (rpm) y caliente hasta 50 oC para permitir una hidratación completa del alginato.
NOTA: El alginato puede necesitar una o dos horas para hidratarse por completo. Para ahorrar tiempo, la solución de alginato puede compensarse con un día de antelación al protocolo de encapsulación y almacenarse a 4 oC hasta el día siguiente. Cuando el alginato se haya refrigerado, caliente suavemente a 37 oC con un baño de agua o una placa caliente y agitar con un agitador magnético inmediatamente antes de su uso. - Filtrar estérilmente la solución de alginato utilizando un filtro de poliétersulfone de poro (PES) de 0,22 m antes de su uso. Se recomienda el filtrado a 37 oC para permitir un flujo fácil de alginato. La viscosidad aumentará si se permite que la temperatura baje.
- Preparar 1.000 mL de 0,5 M CaCl2.
- Pesar 55,49 g de CaCl2 anhidro y disolver en 1.000 ml de HBS (20 mM HEPES y 150 mM de NaCl en 1.000 ml de agua desionizada).
- Filtro estéril con un filtro PES de poro de 0,22 m.
- Preparar 100 ml de mezcla de disolución.
- Preparar una solución HEPES de 100 mM (23,83 g) y citrato trisódico de 500 mM dihidrato (147,05 g) en solución salina tamponada con fosfato.
- Ajuste al pH 7.4 usando NaOH o HCl.
2. Configuración del sistema de encapsulación
- Limpie la campana de flujo laminar.
- Esterilice la campana de flujo laminar que contiene el encapsulador utilizando la exposición UV seguida de la pulverización con una solución de etanol al 70% v/v.
- Enjuague el sistema del encapsulador con 10 ml de solución de etanol 70% v/v seguida de 10 ml de agua desionizada estéril.
- Fije la boquilla de 300 m y repita el paso 2.1.2.
- Rocíe el frasco que contenga la solución de alginato filtrada, el frasco que contenga solución de cloruro de calcio filtrada y cualquier herramienta, equipo y placas de cultivo vacías que se utilizarán con una solución de etanol del 70% v/v y colóquelas en la campana de flujo laminar. Antes de usar, vuelva a encender una luz UV durante 30 minutos para esterilizar a fondo.
- Preparar un vaso de precipitados de desecho lleno de una solución desinfectante de grado biológico y colocar el vaso de precipitados en la capucha.
- Llene un vaso de precipitados con 100 ml de solución estéril CaCl2 (acuosa) y agregue un agitador magnético. Ajuste la velocidad de agitación a 100 rpm. Coloque el vaso de precipitados sobre una plataforma magnética a una altura de 18 cm de la punta de la boquilla. Este vaso de precipitados se utilizará para recoger cuentas de alginato y permitir su gelación.
- Prepare las células para la encapsulación.
- Retire las células de la incubadora y desprendalas del matraz casi confluente usando una solución de tripina-EDTA al 0,25% e incubaa a 37oC durante 5-10 min.
- Aísle una muestra para la estimación de la densidad celular y luego centrifugar las células restantes a 1.000 rpm durante 5 minutos para obtener un pellet celular.
- Resuspender el pellet en HBS (20 mM HEPES y 150 mM NaCl) para duplicar la concentración celular deseada final (por ejemplo, para una concentración final de 1,5 x 106 células/ml, resuspenda las células en HBS para lograr una concentración de 3 x 106 células/ml).
- En un tubo de centrífuga de 50 ml, mezcle la suspensión celular en una proporción de 1:1 con una solución de alginato de -4% (p/v) para obtener una suspensión final que contenga la concentración celular deseada (por ejemplo, 1,5 x 106 células/ml) en una solución de alginato de 2% (p/v).
- Establezca los parámetros de encapsulación.
- Ajuste la velocidad de la máquina encapsuladora a la velocidad máxima de extrusión (8,9 ml/min), la tensión a 1,0 kV y la frecuencia a 5.500 Hz.
NOTA: Estos parámetros se optimizaron previamente para obtener microperlas de 550 m de diámetro.
- Ajuste la velocidad de la máquina encapsuladora a la velocidad máxima de extrusión (8,9 ml/min), la tensión a 1,0 kV y la frecuencia a 5.500 Hz.
3. Fabricación
- Fabrica los microperlas.
- En una jeringa de 20 ml, cargue 5 ml de la suspensión de células y alginatos y conecte una jeringa al encapsulador.
- Inicie el encapsulador activando el flujo que empujará la suspensión de cell-alginate a través del alimentador. Una corriente de gotas será extruida a través de la boquilla.
- Recoger el primer 1 ml en el vaso de precipitados de residuos para anular la corriente inicial no uniforme.
- Continúe ejecutando los 4 ml restantes permitiendo que las gotas caigan en el baño de gelación CaCl 2. Cada mililitro se puede ejecutar por separado (pero sucesivamente) y recogerse en cuatro baños de gelidación diferentes si es necesario.
NOTA: Al entrar en contacto con el baño de gelidación, el alginato en las gotas se cruzará instantáneamente con los iones de calcio en el baño de gelación y formará microperlas esféricas. - Después de un minuto, retire el vaso de gelión de la plataforma magnética y deje que las microperlas se sitúen durante otros 4 minutos sin agitación (tiempo necesario para permitir la gelación completa a través de los microperlas a temperatura ambiente).
- Recuperar microperlas.
- Retire los restos de alginato grandes o artefactos usando un par de pinzas estériles, y luego use una pipeta de plástico estéril para transferir a un filtro de malla de 74 m para recuperar los microperlas del baño de gelación.
- Transfiera los microperlas en un tubo de centrífuga utilizando el medio de cultivo adecuado y permita equilibrar durante 5 minutos en el medio de cultivo celular.
- Pasar a un matraz, plato o plato Petri para la incubación y más experimentos.
NOTA: El baño de gelación no debe reutilizarse.
4. Prueba y uso de microperlas
- Pruebe la calidad del microperla.
- Para evaluar la viabilidad celular (u otras lecturas biológicas) después de la encapsulación y el cultivo, interrumpa suavemente los microperlas para liberar las células encapsuladas utilizando la mezcla de disolución.
NOTA: El volumen requerido de la mezcla de disolución depende del número de microperlas utilizadas por prueba. Una ración sugerida es 4 mL de mezcla de disolución a cada 1 mL de células encapsuladas. Este paso solo debe realizarse en una sola muestra para cada población de microperlas. - Incubar las células en una incubadora de cultivo celular suplementada con 5% de CO2a 37 oC durante 10 min.
- Estimar la viabilidad celular de las células ahora en solución como de costumbre mediante la tinción de células con trippan azul y el uso de una cámara hemocitómetro.
NOTA: Si se utilizan contadores de células automatizados para estimaciones de viabilidad celular, se debe tener cuidado para evitar que los artefactos de alginato sinfiente sinten en los recuentos. En esos casos, se recomienda el recuento de células náuticas. - Para evaluar la estabilidad de los microperlas, mida el diámetro medio de una muestra de cada población de microperlas en un curso de tiempo utilizando un microscopio y un software de imágenes. Las variaciones posteriores dramáticas en el diámetro pueden ser indicativas de la degradación del alginato.
- Para evaluar la viabilidad celular (u otras lecturas biológicas) después de la encapsulación y el cultivo, interrumpa suavemente los microperlas para liberar las células encapsuladas utilizando la mezcla de disolución.
- Utilice microperlas para la detección de A secretado.
- Muestrea los medios de cultivo celular de células 7PA2 cultivadas en condiciones estándar (2D) a intervalos de 24 h y guárdelas a -20 oC para su posterior análisis.
- Muestre los medios de cultivo celular a partir de células 7PA2 encapsuladas cultivadas en condiciones estándar (3D) a intervalos de 24 h y almacenen a -20 oC para su posterior análisis.
- Detectar la secreción de Células A de 7PA2 en medios acondicionados recogidos mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) (Figura 4).
- Utilice los microperlas para su estudio posterior en aplicaciones relevantes.
NOTA: Las células 7PA2 encapsuladas se pueden utilizar para evaluar los efectos de la secreción sostenida de A en cualquiera o modelo.- Para el injerto de microperlas dentro del hipocampo de rata en el cerebro, genere secciones coronales de 1 mm de espesor del cerebro de la rata y utilice herramientas quirúrgicas para insertar microperlas en el área deseada (Figura5).
- Encapsular diferentes tipos de células en microperlas de alginato siguiendo los protocolos descritos para evaluar la liberación sostenida de las biomoléculas de interés. Se pueden modelar más a fondo los sistemas in vitro e in vivo pertinentes.
- Detectar la expresión de marcadores de membrana de células encapsuladas utilizando citometría de flujo y/o inmunofluorescencia.
NOTA: Rios 20describe un ejemplo del uso de un método similar para la fabricación de microperlas que modelan las primeras etapas del crecimiento de masa tumoral y la expresión de biomarcadores.
Representative Results
Las células 7PA2 se encapsulan con éxito en microperlas de alginato
Después de la preparación, microperlas de alginato uniformes y esféricas se generan con éxito utilizando este protocolo. Las imágenes de la Figura 2A a continuación muestran un ejemplo de cómo la alteración de uno de los parámetros (es decir, voltaje) cambia el flujo y la dispersión de la corriente de gotas de alginato. Figura 2 B muestra un ejemplo de cuentas de alginato obtenidas inmediatamente después del proceso de gelidación.
Figura 2 : Optimización del método de fabricación. (A) Fotografías que muestran cambios en la dispersión de la corriente. (B) Imagen de campo brillante que muestra microperlas esféricas de alginato inmediatamente después de la fabricación. (C) Ejemplo de paso de optimización: ajuste de los parámetros de fabricación seleccionados para lograr el tamaño de microperla objetivo. Gráficos seleccionados para ilustrar la relación entre cada parámetro y el tamaño de los microperlas resultantes (distribución de tamaño de al menos n a 100 microperlas). Tenga en cuenta que el diámetro interno de la boquilla, la viscosidad de la solución expulsada y las condiciones de gelificante también pueden influir en el tamaño de las cuentas fabricadas. Las barras de error representan S.D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El protocolo descrito es flexible y permite la fabricación de diferentes tamaños de microperlas basadas en alginato, variando en composición según la aplicación. En la Figura 2C,informamos de la influencia del caudal de alginato, el voltaje y la frecuencia en el tamaño del microperla utilizando una solución de alginato del 2% (p/v) en HEPES (pH 7.2) extruido a través de una boquilla de 300 m.
Como el alcance de este estudio fue producir microperlas que se pueden incrustar en el cerebro de la rata, ajustamos los parámetros de fabricación para obtener un diámetro promedio de microperlas en el rango de 500-600 m. A efectos de control de calidad, el método se optimizó para tener una variabilidad mínima en toda la población de cuentas fabricadas (es decir, distribución de tamaño estrecho). Tenga en cuenta que (1) las perlas producidas se pueden inyectar en el cerebro de la rata utilizando una jeringa Hamilton equipada con una aguja de 20G; y (2) un hemisferio de cerebro de rata puede alojar hasta dos o tres cuentas de este tamaño.
Después de la optimización, encapsular células 7PA2 a una concentración de 1,5 x 106 células/ml suspendidas en una solución de alginato del 2% (p/v) tamponado con HEPES y caída en un baño de gelación de cloruro de calcio de 0,5 M produjo los microperlas deseados. Figura 3 A continuación se muestran las células 7PA2 encapsuladas distribuidas uniformemente en microperlas después de un día en condiciones de cultivo celular estándar. La proliferación celular 7PA2 se probó utilizando un ensayo MTS según el protocolo del fabricante. No hubo diferencia significativa entre el comportamiento de las células 7PA2 cultivadas con o sin alginato durante un período de siete días (Figura3B). Al incubar células encapsuladas en condiciones de cultivo estándar, se espera que las células continúen proliferando durante la duración del experimento, y se pueden esperar pequeños grados de escape celular como resultado, como se informó en otras obras28. Los efectos de esto se pueden mitigar encapsulando a una densidad celular más pequeña o reduciendo la concentración sérica en la que se incuban los microperlas.
Figura 3 : Células 7PA2 encapsuladas. (A) Imagen de campo brillante de células 7PA2 encapsuladas que muestran una distribución celular uniforme a lo largo del microperlador de alginato. Los parámetros de fabricación se establecieron para obtener 150 celdas de 7PA2 por cordón. No se observó ninguna variación significativa en las cuentas de alginato durante 7 días de cultivo. (B) No se observó diferencia entre la proliferación general de células 7PA2 incubadas con alginato frente a células incubadas sin alginato. Las células 7PA2 crecen y migran a través del volumen de las cuentas de alginato; reducción de la concentración sérica se puede considerar para ralentizar el crecimiento celular. Las barras de error representan S.D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los microperlas de alginato que encapsulan las células 7PA2 son estables con el tiempo
Para investigar el tamaño y la forma de los microperlas de alginato obtenidos, se realizó un análisis por microscopio después de la fabricación y la gelificación. El diámetro medio de los microperlas obtenidos mediante el protocolo seleccionado es de 550 a 2 m.
Teóricamente, el número de células esperadas en un microperla de 550 m de diámetro se puede calcular de la siguiente manera:
donde V - volumen y r - radio. El volumen de un solo microperladines es de V a 8,8 x 10-5 ml; por lo tanto, el número de células por microperladinense en el momento de la encapsulación á (1,5 x 106) x (8,8 x 10-5) a 130 células.
Experimentalmente, contamos el número de células encapsuladas inmediatamente después de la fabricación. Las perlas de alginato se interrumpieron suavemente con la mezcla de disolución y las células se teñían con solución azul trypan. La estimación de la viabilidad y el recuento de células se realizaron utilizando un hemocitómetro; los resultados obtenidos mostraron un promedio de 116 a 17 células vivas por microperla (n a 5, datos no notificados). Como era de esperar, se observó una diferencia menor entre el recuento de células teóricas y experimentales inmediatamente después de la encapsulación. Para algunas aplicaciones, y en particular para determinar la cantidad de A liberado a lo largo del tiempo, es importante predecir el número de células encapsuladas en cada cordón de alginato.
Curiosamente, el proceso de encapsulación no tiene un impacto significativo en la viabilidad de la célula. Los resultados se informan en un trabajo anterior, en el que las células cancerosas colorrectales (es decir, HCT-116) se encapsularon utilizando un método similar, sin diferencias en la viabilidad celular en microperlas de alginato en comparación con los controles 2D20.
Para medir la estabilidad del alginato utilizado en el proceso de encapsulación, medimos los diámetros de microperlas durante un período de 14 días (n a 100). No se observaron cambios en el diámetro promedio 14 días después de la encapsulación en comparación con inmediatamente después de la encapsulación (datos no notificados).
Las células 7PA2 encapsuladas liberan A- con el tiempo
Los medios acondicionados analizados a partir de cultivos 2D y 3D de células 7PA2 revelan un aumento constante en los niveles deA-1-42. Los medios de cultivo celular se muestreaban cada 24 horas, y hasta cuatro días, y se analizaban con ELISA. Nuestros datos muestran que la tasa de liberación de A-1-42 de microperlas (3D) es similar en perfil a la liberada de la referencia cultural 2D (Figura4).
Figura 4 : Tasa de secreción deA-1-42 a partir de células 7PA2. (A) La liberación de A (% normalizada después de 4 días) de los modelos 2D y 3D in vitro tiene un perfil similar. Ambos modelos muestran un aumento constante de los niveles de A- durante el período de cuatro días y, como se esperaba, no se alcanza una concentración constante. (B) Concentración deA-1-42 normalizada al número de célula inicial, mostrando una secreción similar deA-1-42 a lo largo del tiempo, independientemente de los métodos de cultivo. Ni la presencia de alginato ni el proceso de encapsulación (modelo 3D in vitro) alteran la secreción deA-1-42. Las barras de error representan S.D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Posible aplicación de células 7PA2 encapsuladas
Informamos que las células 7PA2 encapsuladas en microperlas de alginato se pueden utilizar eficazmente para la liberación sostenida deA-1-42,y por lo tanto se utilizan para probar el efecto de la secreción crónica de A en cualquier modelo preclínico. En la Figura 5 a continuación, mostramos las ventajas del uso de microperlas de alginato que se pueden inyectar fácilmente y se encuentran dentro del cerebro de una rata. Las secciones ex vivo se utilizan aquí con fines ilustrativos, comparando un perla de alginato milimétrico frente a microperlas de alginato fabricados.
Figura 5 : Uso de microperlas para aplicaciones preclínicas relevantes. Los microperlas para el injerto en el cerebro de la rata deben ser lo suficientemente pequeños como para ser incrustados sin crear una lesión demasiado grande para evitar el daño al parénquima cerebral y afectar negativamente la función normal del cerebro. La imagen (A) muestra una comparación de tamaño entre un cordón a escala milimétrica y un cordón a escala de micrómetro uno al lado del otro. (B) La implantación de una perla a escala milimétrica en el cerebro para fines in vivo no funcionaría. La imagen (C) muestra un microcordócal fabricado con este protocolo. El tamaño es adecuado para la inserción dentro del hipocampo de la rata sin tener un efecto perjudicial sobre la fisiología normal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las imágenes anteriores resaltan la importancia de controlar el tamaño del microperladinés para tales estudios. Aquí, demostramos la ventaja de utilizar microperlas de diámetros inferiores a 600 m. Esto permite el uso de una inyección mínimamente invasiva (por ejemplo, jeringa de Hamilton) para controlar mejor la ubicación de las perlas inyectadas en el cerebro.
En resumen, encapsular células 7PA2 da control sobre el tamaño de los microperlas, el número de células encapsuladas y la predicción de A - secretada de los microperlas (por ejemplo, concentración, perfil de liberación). Controlar el tamaño de las microperlas es esencial por dos razones: 1) para permitir un control preciso sobre la concentración de A ( liberado, y 2) para permitir la implantación en una región controlada del cerebro de la rata. Los resultados obtenidos aquí describen la fácil afinación de microperlas de alginato y destacan las posibles aplicaciones para estudios posteriores.
Discussion
El método descrito en este artículo es útil para encapsular células logrando una distribución de tamaño estrecho de microperlas de alginato27. También ofrece la ventaja de cultivar células en un ambiente inmunoaislado17,19,protegiéndolas del estrés externo. Además, la encapsulación de células en alginato imita más de cerca las condiciones fisiológicas, específicamente con respecto a las interacciones de célula a célula y la rigidez de la matriz20. Estos factores son todos particularmente cruciales para su uso posterior en aplicaciones relevantes, como el injerto in vivo, excluyendo posibles reacciones inmunitarias en el tejido circundante17. Además, una de las principales ventajas de este protocolo es la fácil afinación según la aplicación de interés: es posible modificar el protocolo y optimizar los parámetros para la fabricación de cuentas más grandes o más pequeñas, y más suaves o rígidas. El método descrito se utiliza para fabricar cuentas lo suficientemente pequeñas como para ser inyectadas con métodos mínimamente invasivos, y lo suficientemente grande como para albergar una serie de células y proporcionar una liberación suficiente de A - para dar lugar a efectos conductuales y patológicos observables previa inyección en modelos animales.
El éxito de este protocolo depende de una serie de pasos críticos. El manejo cuidadoso de las células y las técnicas óptimas de cultivo celular son importantes para mantener la viabilidad celular y la función20,28. El uso de condiciones de cultivo estándar garantiza la conservación del funcionamiento normal de las células 7PA2, como se observa. Esto permite un perfil de la versión similar para elA-1-42 de las células encapsuladas cuando se compara con los cultivos 2D. Además, para que el protocolo funcione de forma óptima, una solución de alginato de baja viscosidad garantiza mejores resultados en comparación con una solución de alginato de alta viscosidad. Esto garantiza que un chorro laminar homogéneo se extruya a través de la boquilla y una distribución uniforme de las células dentro de la matriz de las cuentas fabricadas27. Los materiales utilizados para encapsular las células deben tener un mecanismo de gelión muy rápido, lo que permite la retención de la forma.
Otro paso crítico en este protocolo es el manejo de microperlas fabricadas después de la gelación. Aquí, mostramos la recuperación de microperlas mediante el uso de una pipeta de plástico de gran apertura para transferir las cuentas. Alternativamente, verter la solución de cloruro de calcio que contiene las microperlas en un filtro de malla se puede utilizar para la recuperación de cuentas. Se puede utilizar una pipeta serológica grande (5, 10 o 25 ml) para elaborar los microperlas y luego lavarse a través del filtro de malla en lugar de verter. La ventaja de esto es una mayor confianza en la esterilidad del procedimiento en comparación con el vertido. Sin embargo, de las limitaciones es que algunas cuentas pueden ser distorsionadas si son comprimidas por la pipeta, además de arriesgarse a un menor rendimiento si una gran proporción de microperlas no son rescatadas.
Este enfoque se ha utilizado para encapsular diferentes líneas celulares para modelar y estudiar diferentes enfermedades (por ejemplo, liberación de insulina de islotes pancreáticos encapsulados). La novedad de nuestro enfoque es el injerto de las microperlas generadas utilizando este protocolo como un método útil en el modelado de aspectos importantes de la enfermedad de Alzheimer in vivo. Al comparar el perfil de liberación de A - de las células encapsuladas (Figura4) con los niveles de A - generados por una inyección de bolo (como la señalada en otros estudios3,26), una liberación más crónica y sostenida de A - puede ser Esperado. La Figura 6 ilustra la tendencia pronosticada que se puede lograr. El uso de este sistema para el modelado in vivo es más relevante para la forma en que la enfermedad progresa y puede ser más útil en el descubrimiento y desarrollo de fármacos.
Figura 6 : Predijo el perfil de liberación deA-1-42 a partir de células 7PA2 encapsuladas en comparación con una inyección de bolo. El perfil de la liberación de A a partir de microperlas que contienen 7PA2 injertados permite el ensayo de los efectos de la A crónica y sostenida en un modelo animal de relevancia para la AD. Por el contrario, una inyección de bolo crearía un pico en los niveles de A- durante un corto período de tiempo, seguido de un rápido aclaramiento de A - del cerebro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores quieren dar las gracias al Sr. Kajen Suresparan, al Dr. Jonathan Wubetu, al Sr. Dominik Grudzinski, a la Sra. Chen Zhao y al Dr. Thierry Pilot por su ayuda en la optimización de la fabricación de micropers de alginato, el cultivo celular y la detección de A, y la Discusiones.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µManager software | Vale Lab, UCSF, USA | v.1.46 | |
| 0.22 um PES filter | Merck, UK | SLGP033RS | |
| 15mm Netwell insert 74 um mesh filter | Constar, usa | #3477 | |
| Alginic acid sodium salt from brown algae | Sigma-Aldrich,uk | A0682 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich,uk | C1016 | |
| CellTiter96 AQueous One Solution cell proliferation assay | Promega, USA | G3580 | |
| Encapsulator | Inotech | IE-50 | serial no. 05.002.01-2005 |
| HEPES | Sigma-Aldrich,uk | H4024 | |
| Hu Aβ 1-42 ELISA | ThermoFisher, UK | KHB3441 | |
| ImageJ software | ImageJ | v1.49p | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX41 | |
| Leica microscope | Leica microsystems, UK | DMI6000B | |
| Neo sCMOS Camera | Ander, UK | 5.5 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich,uk | D1408 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich,uk | 433209 | |
| Trispdium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich,uk | W302600-K | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich,uk | T4049 |
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