Summary
Beskrevet her er en simpel metode til rensning af et genprodukt i Streptococcus mutans. Denne teknik kan være fordelagtig i oprensning af proteiner, især membran proteiner og højmolekylært masse proteiner, og kan anvendes med forskellige andre bakteriearter.
Abstract
Elucidation af et gens funktion indebærer typisk sammenligning af fænotypiske træk af vildtypestammer og stammer, hvor det gen af interesse er blevet forstyrret. Tab af funktion efter genafbrydelse genoprettes efterfølgende ved eksogen tilsætning af produktet af det afbrudte gen. Dette hjælper med at bestemme funktionen af genet. En tidligere beskrevet metode indebærer at generere en Gtfc -gene-forstyrret Streptococcus mutans stamme. Her beskrives en fordringsløs metode til rensning af Gtfc -genproduktet fra den nyligt genererede S. mutans stamme efter genafbrydelsen. Det indebærer tilsætning af en polyhistidin-kodning sekvens på 3 ′ ende af genet af interesse, som giver mulighed for enkel rensning af genproduktet ved hjælp af immobiliseret metalaffinitets kromatografi. Der kræves ingen andre enzymatiske reaktioner end PCR for den genetiske modifikation i denne metode. Gendannelsen af genproduktet ved udefrakommende tilsætning efter genafbrydelse er en effektiv metode til bestemmelse af genfunktion, som også kan tilpasses forskellige arter.
Introduction
Analyse af et gene's funktion indebærer normalt sammenligning af fænotypiske træk af vild-type stammer til stammer, hvor genet af interesse er blevet forstyrret. Når den genforstyrrede stamme produceres, giver eksogen tilsætning af genproduktet mulighed for funktionel restaurering.
Den mest almindelige metode til opnåelse af rensede genprodukter, der kræves til efterfølgende restaurerings undersøgelser, er ved at udføre heterologt udtryk i Escherichia coli1. Men, ekspression af membran proteiner eller høj molekylmasse proteiner er ofte svært ved hjælp af dette system1. I disse tilfælde er målproteinet normalt isoleret fra cellerne, der oprindeligt syntetiserer proteinet gennem en kompleks række trin, hvilket kan føre til tab af genproduktet. For at overvinde disse problemer er der blevet udviklet en enkel procedure for genprodukt rensning efter en genafbrydningsmetode2, PCR-baseret DNA-splejsning-metode3 (udpeget to-trins fusions PCR) og elektro portering for genetiske omdannelse i Streptococcus mutans. Tilsætning af et polyhistidintag (hans-tag) til genproduktets C-endestation letter dets rensning ved immobiliseret metalaffinitets kromatografi (IMAC).
For at isolere hans-tag-udtrykke stamme, er hele genomisk DNA af genet af interesse (i denne hans-tag-udtrykker gene-forstyrret stamme) erstattet med et antibiotikum-resistent markør gen. Proceduren for generering af hans-tag-udtrykker Strainer næsten identisk med, at for at generere en gen-forstyrret stamme som beskrevet tidligere4,5. Metoderne til genafbrydelse og isolering af genproduktet bør derfor udføres som serie eksperimenter for den funktionelle analyse.
I det nuværende arbejde, en polyhistidin-kodning sekvens er knyttet til 3 ′ ende af Gtfc (genbank locus tag SMU_1005) gen, kodning glucosyltransferase-si (GTF-SI) i S. mutans6. Derefter blev der udført udtryks studier i en streptokokart. Opnåelse af heterologe Gtfc udtryk ved E. coli er vanskeligt, sandsynligvis på grund af den høje MOLEKYLÆRE masse af GTF-si. Denne stamme hedder S. mutans His-gtfc. En skematisk illustration, der skildrer organiseringen af gtfc -og Spectinomycin-resistens genkassetten (SPCr)7 loci i vildtype S. mutans (s. mutans WT) og derivater heraf er vist i Figur 1. GTF-si er et sekretorisk protein, der bidrager til udviklingen af kariogene Dental biofilm6. Under tilstedeværelse af saccharose observeres en over vedet biofilm på en glat glasoverflade i WT s. mutans stamme, men ikke i s. mutans gtfc-forstyrret stamme (S. mutans Δgtfc)2,5 . Dannelsen af biofilm er genoprettet i S. mutans Δgtfc ved udefrakommende tilsætning af det rekombinante GTF-si. Stammen, S. mutans hans-gtfc, bruges derefter til at producere den rekombinante GTF-si.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Generation af S. mutans ∆gtfc, hvor hele kodnings området for gtfc -genet erstattes med SPCr, skal være afsluttet, inden disse protokoller udføres. Se den publicerede artikel for detaljer om generation5.
1. primer design
-
Forbered primere til opførelse af S. mutans hans-gtfc.
Bemærk: De primer-sekvenser, der anvendes i denne protokol, er vist i tabel 1. To-trins fusion PCR metode til generering af S. mutans hans-gtfc er skematisk illustreret i figur 2.- Design primere (gtfc-reverse og SPCr-Forward) til fastgørelse af hans-tag-kodning sekvens, intervenerende mellem gtfc -genet og SPCr (figur 2a).
- Medtag GS linker og hans-kode-kodning sekvens i både Gtfc-reverse og SPCr-Forward Primers, hvor 24 baser i 5 ' regioner er komplementære til hinanden.
Bemærk: den aminosyre sekvens af GS linker og hans-tag (Gly-Gly-Gly-Gly-ser-His-His-His-His-His) er knyttet til C-endestation af GTF-SI gennem genoversættelse. - Design en gtfc-Forward primer for at målrette gtfc -genet i S. mutans WT genom > 1 kb nedstrøms for genet og SPCr-reverse primer for at målrette den efterfølgende ledsage-region af SPCr i S. mutans ∆gtfc. Indstil Smeltetemperaturen8 (Tm) af gtfc-Forward og SPCr-reverse primere til at matche med smelte temperaturerne på gtfc-reverse og SPCr- henholdsvis fremad primere.
- Medtag GS linker og hans-kode-kodning sekvens i både Gtfc-reverse og SPCr-Forward Primers, hvor 24 baser i 5 ' regioner er komplementære til hinanden.
- Design indlejrede primere (indlejret-Forward og indlejret-reverse) for den anden PCR (figur 2b).
- Design primere (Gtfc-Forward og Colony-reverse), der er specifik for transformerende GENOMISK DNA (figur 2c; primere anvendes til koloni PCR).
Bemærk: Amplikoner straddle grænsen mellem gtfc og SPCr. Gtfc-Forward primer kan anvendes som Forward primer. - Design primere (up-Forward og down-reverse) til endelig bekræftelse af genereringen af S. mutans His-gtfc (figur 2c; PCR-produktet FORSTÆRKES af primere anvendes til DNA-sekvensering).
- Design primere (gtfc-reverse og SPCr-Forward) til fastgørelse af hans-tag-kodning sekvens, intervenerende mellem gtfc -genet og SPCr (figur 2a).
2. genomisk DNA-ekstraktion fra S. mutans
Bemærk: Hver S. mutans stamme skal dyrkes i hjernens hjerte infusion (BHI) medium ved 37 °c under anaerobe forhold. De mutante stammer af s. mutans ∆Gtfc og s. mutans His-gtfc dyrkes i BHI suppleret med 100 μg/ml Spectinomycin.
- Række s. mutantes WT og S. mutans ∆gtfc separat på hver af BHI-agar pladerne. Inkubatér dem natten over ved 37 °C.
- Vælg enkelt kolonier af s. mutantes WT eller s. mutans ∆gtfc ved hjælp af et steriliseret tandstikker og inokulere i 1,5 ml BHI bouillon. Inkubatér dem natten over ved 37 °C.
Bemærk: Kolonierne kan anvendes som kilde til skabelon-DNA til den første PCR (trin 3,1). - 1 mL af hver bakteriekultur overføres til et 1,5 mL mikrocentrifuge glas. Centrifuger kulturen i 1 min. ved 15.000 x g.
- Supernatanten fjernes og tilsættes 1 mL Tris-EDTA-buffer (pH 8,0) for at resuspendere celle pellet.
- Centrifuger suspensionen i 1 min. ved 15.000 x g. Fjern supernatanten. Celle pellet opslæmmes i 50 μL Tris-EDTA buffer (pH 8,0).
- Opvarme suspensionen ved hjælp af en blok inkubator i 5 min ved 95 °C. Centrifuger suspensionen i 5 minutter ved 15.000 x g.
- Supernatanten overføres til et nyt 1,5 mL mikrocentrifuge glas (supernatanten fungerer som skabelon-DNA til den første PCR).
3. PCR amplifikation
Bemærk: Tabel 1, tabel 2, og tabel 3 opsummerer henholdsvis PCR-primere, reagenser og forstærknings cyklusser.
- Udfør den første PCR ved hjælp af s. mutantes WT og s. mutans ∆gtfc genom som PCR-skabeloner. Amplificere de regioner, der harkedeligt den downstream-del af gtfc -genet og de husly SPCr ved hjælp af primere beskrevet i trin 1.1.1.2 (figur 2a).
- Elektro phorese hvert PCR produkt på 1% agopstået gel. Punktafgiftspligtige DNA-fragmenter på ca. 1.000 BP og 2.000 BP. rense fragmenter fra gels ved hjælp silica membran-baserede gel udvinding metode.
Bemærk: De grundlæggende procedurer for PCR9, DNA-gel elektroforese10og DNA-rensning11 er beskrevet andetsteds. - Udfør en anden PCR ved hjælp af produkterne fra den første PCR (ca. equimolar) som PCR-skabeloner med de indlejrede-Forward-og indlejrede-reverse-primere (figur 2b).
- Elektro phorese en tiendedel af PCR-blandingen på agrose gel. Bekræft genereringen af den relevante amplikonen på ca. 3.000 BP.
-
Fremskynde det resterende PCR-produkt.
Bemærk: rensning af PCR-produktet er ikke nødvendig, da ikke-specifikke amplikoner genereret af den anden PCR ikke forstyrrer homologe rekombination.- Tilsæt nuklease frit vand til PCR-blandingen, og Bring det totale volumen til 100 μL efterfulgt af 0,1 volumen (10 μL) 3 M natriumacetat (pH 5,2) og 2,5 volumener (250 μL) absolut ethanol. Bland og opbevar blandingen i 10 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Prøven centrifugeres i 20 minutter ved 15.000 x g ved 4 °c. Kassér supernatanten. Tilsæt 1 mL 70% ethanol for at vaske DNA-pellet.
- Prøven centrifugeres i 5 minutter ved 15.000 x g ved 4 °c. Kassér supernatanten. Lufttørre og opløse DNA-pellet med 10 μL nuklease frit vand.
4. celle transformation
- Forbered den kompetente s. mutantes WT til at introducere det andet PCR-produkt ved at følge trinene beskrevet i den foregående publikation5. Cellerne opbevares ved-80 °C.
Bemærk: Til dette eksperiment er de kompetente s. mutantes WT-celler allerede blevet bevaret i-80 °c for at generere s. mutans ∆gtfc. - 5 μL af det koncentrerede andet PCR-produkt blandes til 50 μL alikvot af iskolde kompetente celler, som er frosset tidligere. Tilsæt blandingen til elektro poration cuvettes. Giv en enkelt elektrisk puls (1,8 kV, 2,5 MS, 600 Ω, 10 μF) til cellerne ved hjælp af elektroporations apparatet.
- Cellerne opslæmmes i 500 μL BHI bouillon. Straks fordeles 10 – 100 μL af suspensionen på BHI-agar-plader, der indeholder Spectinomycin. Pladerne inkubates i 2 – 6 dage ved 37 °C, indtil kolonierne er vokset tilstrækkeligt til at blive afhentet.
5. verifikation af GEnome rekombination og opbevaring
- Udføre koloni PCR, ved hjælp af gtfc-Forward og koloni-reverse primere at screene for rekombination. Electrophorese hver koloni PCR produkt på en agopstået gel. Bekræft DNA-fragmentet på ca. 1.500 BP.
- Vælg en af de positive kolonier ved hjælp af en steriliseret tandstikker og subkultur cellerne natten over i 2 mL BHI bouillon indeholdende Spectinomycin.
- Bland 0,8 mL bakteriekultur med 0,8 mL steril 50% glycerol og bestand ved-80 °C eller-20 °C.
- De resterende 1 mL af cellesuspensionen overføres til et 1,5 mL mikrocentrifuge glas. Gentag trin 2.3 – 2.7 for at udtrække det genomiske DNA fra cellerne.
- Udføre PCR ved hjælp af up-Forward og down-reverse primere og genomisk DNA som en skabelon. Gentag trin 3,2 for at rense det forstærkede DNA-produkt fra geler.
- Bestem DNA-sekvensen af den rensede amplikonen ved DNA-sekvensering.
Bemærk: Sørg for at bekræfte genereringen af S. mutans hans-GTFC ved DNA sekvensering.
6. rensning af Polyhistidin-Tagged GTF-SI
- Streak S. mutans hans-gtfc på en Spectinomycin-holdige BHI agar plade. Inkubatér dem natten over ved 37 °C.
- Pick up en enkelt koloni ved hjælp af en steriliseret tandstikker og subkultur celler i 3 mL BHI bouillon. Inkuber natten over ved 37 °C.
- Forbered to koniske kolber med 1 L BHI bouillon uden Spectinomycin. Inokulere 1 mL af den overnight kultur suspension i 1 L af BHI bouillon. Inkuber natten over ved 37 °C.
- Koncentrer proteiner fra kultur supernatanten ved at udfældningen af ammoniumsulfat.
Bemærk: uddrag fra celle kroppe, hvis et målprotein er intracellulært. De grundlæggende procedurer for udfældning af ammoniumsulfat er nærmere beskrevet andetsteds12.- Den bakterielle kultur suspension centrifugeres i 20 minutter ved 10.000 x g ved 4 °c. Genopret kultur supernatanten i et 3 L glasbæger.
- Tilsæt 1.122 g ammoniumsulfat til 2 L af supernatanten (80% mætning) med kraftig omrøring ved hjælp af en magnetisk omrører. Bundfaldet kan dannes i 4 timer eller mere ved 4 °C ved omrøring.
Bemærk: bund fældens dannelse kan fortsættes natten over. - Den ammoniumsulfat-udfældede opløsning centrifugeres ved 15.000 x g i 20 minutter ved 4 °c. Decant supernatanten.
- Bundfaldet opsamles med en spatel og overføres til et 200 mL glasbæger. Resuspension pellets i 35 mL bindende buffer (50 mM NaH2po4, 300 mm NaCl, 5 mm imidazol, pH 8,0).
- Suspensionen mod 2.500 mL af bindings bufferen ved hjælp af en regenereret cellulose dialyse slange ved 4 °C med omrøring. Udskift dialyse opløsningen efter 2 timer, og Fortsæt dialyse natten over.
- Udskift dialyse opløsningen igen. Fortsæt med at dialysere for yderligere 2 timer.
- Den dialyserede suspension centrifugeres ved 20.000 x g i 10 minutter ved 4 °c. Supernatanten filtreres gennem et membranfilter ved hjælp af sugefiltrerings udstyr. Filtratet overføres til en 75 cm2 kolbe.
- Polyhistidinmærket GTF-SI fraktioneres fra den filtrerede suspension ved immobiliseret metalaffinitets kromatografi (IMAC).
- 2 mL af den ni-ladede IMAC-harpiks gylle (ca. 1 mL harpiks) overføres til en kromatografisk kolonne, hvis udløb er monteret på et silikone rør. Fjern opbevaringsopløsningen ved tyngdekrafts strømmen.
Forsigtig: Lad ikke harpiks tørre ud i hele IMAC. - Tilsæt 3 mL destilleret vand til søjlen for at vaske harpiksen. 5 mL af bindings bufferen tilsættes for at ækvibrere harpiksen.
- Sluk for strømmen med en Hoffmann knivspids pik. Tilsæt 5 mL af den filtrerede suspension fra trin 6,5 for at gøre gyllen.
- Tilsæt alle gylle til den resterende filtrerede suspension. Bland blandingen forsigtigt i 30 minutter ved 4 °C.
- Læg blandingen tilbage på søjlen. Fjern suspensionen ved tyngdekrafts strømmen. IMAC-harpiksen vaskes med 20 mL bindings buffer.
Bemærk: Juster strømningshastigheden til ca. 2 mL/min med en Hoffmann knivspids pik i den efterfølgende IMAC. - Elute det rekombinante GTF-SI med 20 mL af elueringsbufferen (50 mM NaH2po4, 300 mM NaCl, 500 mm imidazol, pH 8,0).
Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her. Eluatet skal opbevares ved 4 °C. IMAC-harpiks kan genbruges. Se instruktionerne for IMAC-harpiksen.
- 2 mL af den ni-ladede IMAC-harpiks gylle (ca. 1 mL harpiks) overføres til en kromatografisk kolonne, hvis udløb er monteret på et silikone rør. Fjern opbevaringsopløsningen ved tyngdekrafts strømmen.
- Afmonter elueringsbufferen med lager bufferen (50 mM fosfatbuffer, pH 6,5), og koncentrer den rekombinante GTF-SI-opløsning til ca. 1 mL ved hjælp af en centrifugal ultrafiltreringsenhed. Den rekombinante GTF-SI-opløsning opbevares ved 4 °C.
Bemærk: Bekræft polyhistidine-Tagged GTF-SI rensning ved hjælp af SDS-side13 og Western blotting14 ved at ansætte en peberrod peroxidase-konjugeret anti-polyhistidin monoklonalt antistof. Tilsætning af CHAPS (endelig koncentration, 0,1%) til eluenten kan være nødvendig for at undgå uspecifik adsorptions til enheden, afhængigt af målproteinet.
7. funktionel restaurering ved rekombinant GTF-SI
- Streak hver s. mutantes stamme på en BHI agar plade individuelt. Pladerne inkubates natten over ved 37 °C.
- Ved hjælp af et steriliseret tandstikker, afhente en enkelt koloni til at inokulere i 2 mL BHI bouillon. Inkuber natten over ved 37 °C.
- Brug 20 μL af den overnight kultur af S. mutans ∆gtfc til at inokulere 2 ml BHI bouillon indeholdende 1% saccharose uden antibiotika i et glas testrør. Tilsæt GTF-SI eller en tilsvarende volumen af køretøjet til S. mutans ∆gtfc kultur, og kultur cellerne med røret placeret i en skrå position natten over.
Bemærk: Du skal sterilisere GTF-SI-opløsningen med et sterilt sprøjte filter og bestemme proteinkoncentrationen ved hjælp af en bicinchoninsyre-proteinanalyse15 før brug. - Omrør kultur suspensionerne med en vortex mixer til 10 s. Decant suspensioner. Reagens glassene vaskes med en tilstrækkelig mængde destilleret vand.
- Plette biofilm på rørvæggen med 1 ml 0,25% coomassie Brilliant Blue (CBB).
- Affarvning af Farvningsopløsningen efter 1 min. vask reagens glassene med en tilstrækkelig mængde destilleret vand. Lufttørre reagensglas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 viser størrelsen af hver amplikonen fra den første PCR (figur 3a) og anden PCR (figur 3b). Størrelsen af hver amplikonen svarede til den forventede størrelse, som beskrevet i tabel 1. Figur 4a viser S. mutans kolonier OMDANNET med det andet PCR produkt og belagt på BHI agar plader indeholdende Spectinomycin. Koloni PCR-produkter blev derefter kørt på agrose gel (figur 4b). Hver amplikonen var af den forventede størrelse, som beskrevet i tabel 1. Figur 5 viser billeder af SDS-Page og Western blot. Protein renset med IMAC blev observeret som et enkelt bånd af SDS-PAGE (figur 5a). Western blot blev udført ved hjælp af anti-polyhistidinanti stoffet for at bekræfte, at det observerede bånd var det forventede polyhistidin-mærkede protein (figur 5b) af 160 kDa. Figur 6 viser den saccharose-afledte biofilm-dannelse evne af hver S. mutans stamme. Kun s. mutans WT og s. mutans hans-gtfc kunne danne en overholder biofilm på rørvæggen i nærværelse af 1% saccharose. Dette blev ikke observeret i S. mutans Δgtfc (figur 6a). Tilføjelsen af det rekombinante GTF-SI gengav dog den vedlige biofilm dannelse i S. mutans Δgtfc (figur 6b).
Figur 1: organisation af gtfc og SPCr loci i S. mutans UA159 genom og derivater heraf. En skematisk illustration af hans-tag mellem Gtfc og SPCr. Længden af gener og huller er ikke at skalere. Skyggefuld Pentagon: SMU_1004; solid Pentagon: SMU_1006. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: strategi for to-trins FUSIONS PCR. En skematisk illustration af S. mutans Hans-Gtfc byggeri. Længden af gener og huller er ikke at skalere. De primer-bindingssteder i skabelonen er angivet med mønstre. (A) de regioner, der harkedeligt en del af gtfc -genet i s. mutans WT genom og husly SPCr i s. mutans Δgtfc genom blev forstærket ved hjælp af den første PCR. (B) den anden PCR blev udført med indlejrede primere ved hjælp af de to fragmenter, der blev forstærket af den første PCR som skabeloner, og en DNA-konstruktion for homologe rekombination blev opnået. C) den mutante stamme blev genereret ved homologe rekombination i bakterierne. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: agrose gel elektroforese af første og andet PCR-produkt. A) produkter fra den første PCR af en del af gtfc (gtfc; venstre billede) og området husly SPCR (SPCR; højre billede) vises. Det enkelte elektroforetiske billede er opdelt for at mærke markør båndene. B) det andet PCR-produkt, der forstærkes med de indlejrede primere, vises. Hver pilespids angiver den forventede størrelse af hvert PCR-produkt. M = molekyle markør. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: koloni PCR til Screen generation af S. mutans hans-gtfc. A) S. mutans -kolonier, der er omdannet af det andet PCR-produkt, vises. Koloni-ID angives med cirklede tal. B) der er påvist agrose gel elektroforese af koloni PCR-produkterne. Det cirklede vognbane nummer svarer til koloni-id'et i figur 4a. M = molekyle markør. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: bekræftelse af polyhistidin-Tagged GTF-si rensning. (A) det repræsentative SDS-sidebillede vises. B) det repræsentative Western blot-billede vises. En nitrocellulose membran, som GTF-SI blev overført til, blev probed med et peberrod-peroxidase-konjugeret anti-polyhistidinmonoklonalanti stof. Immunoreaktive bånd blev visualiseret ved hjælp af en kemiluminescens reaktion. Pilespidser indikerer den forventede størrelse af det rekombinante GTF-SI. M: molekyle markør; 1 = prøve før IMAC; 2 = prøve fremstillet af IMAC. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: funktionel restaurering ved tilsætning af det rekombinante GTF-si. A) der for hver S. mutans -stamme vises muligheden for dannelse af sakkarose afledt, sammen klædelig biofilm. B) evnen til at danne overtrædende biofilmer blev genoprettet i S. mutans Δgtfc ved tilsætning af REKOMBINANT GTF-si (25 μg). WT = S. mutans WT; Δgtfc = S. mutans Δgtfc; Hans-gtfc = S. mutans hans-gtfc. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Primer par | Sekvens (5 ′ til 3 ′) | Forventet bånd størrelse (BP) | ||
| 1st PCR | ||||
|
Gtfc-Forward Gtfc-reverse A, B |
TAAAGGTTATGTTTATTATTCAACGAGTGGTAACC Atgatgatgatgatgactaccaccacctcc AAATCTAAAGAAATTGTCAA |
1.090 | ||
|
SPCr-Forward A, C SPCr-reverse |
Ggtggtagtcatcatcatcatcat Kat TAAATCGATTTTCGTTCGTGAAT TTAAGAGCAAGTTTAAGATAGAACATGTTACTCAC |
2.232 | ||
| 2. PCR | ||||
| Indlejret-fremad Indlejret-omvendt |
TGGTATTATTTCGATAATAACGGTTATATGGTCAC GCCATACTTAGAGAAATTTCTTTGCTAAATTCTTG |
3.179 | ||
| Verifikation af rekombination | ||||
| Colony PCR | ||||
|
Gtfc-Forward Koloni-reverse |
TAAAGGTTATGTTTATTATTCAACGAGTGGTAACC CCACTCTCAACTCCTGATCCAAACATGTAAGTACC |
1.482 | ||
| Afsluttende verifikation | ||||
| Up-Forward Nedadvendt |
TACGGCCGTATCAGTTATTACGATGCTAACTCTGG TTGTCCACTTTGAAGTCAACGTCTTGCAAGGCATG |
6.173 | ||
Tabel 1: primere anvendt i protokollen. En stor De understregede sekvenser af ' gtfC-reverse og SPCr-Forward ' er komplementære, og den fed-skrevne Sequencescode for His-tag (gtfc-reverse; ATGATGATGATGATG, SPCr-Forward; CATCATCATCATCATCAT) og GS linker (Gtfc-reverse; ACTACCACCACCTCC, SPCr-Forward; GGTGGTAGT). B DNA stop codon af Gtfc er blevet fjernet. C En DNA stop codon (TAA) er blevet tilføjet umiddelbart efter polyhistidinkodning sekvenser.
| Reagens | Koncentration af stamopløsning | Volumen | Endelig koncentration |
| DNA-Polymerase-premix | 2x | 25 μL | 1x |
| Fremad primer | 5 μM | 2 μL | 0,2 μM |
| Omvendt primer | 5 μM | 2 μL | 0,2 μM |
| Template DNA | Variabel | Variabel | Variabel |
| Deioniseret vand | - | Op til 50 μL | - |
Tabel 2: PCR-reagenser: For den første PCR blev 2 μL af DNA-skabelonen tilføjet. For den anden PCR blev 0,5-2 μl af første PCR amplikonen føjet til reaktionsblandingen. For koloni PCR blev bakterieceller direkte føjet til reaktionsblandingen.
| Trin | Temperatur | Tid | Antal cyklusser |
| Indledende denaturering | 98 °C | 2 min | 1 |
| Denaturering Udglødning Udvidelse |
98 °C 50 °C 72 °C |
10 s 5 s Amplicon-afhængig (1 min/1 KBP) |
35 |
| Endelig udvidelse | 72 °C | Amplicon-afhængig (1 min/1 KBP) |
1 |
Tabel 3: PCR-amplifikationscyklusser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Design af primere er det mest kritiske skridt i protokollen. Sekvenserne af gtfc-reverse og SPCr-Forward primere blev automatisk fastlagt ud fra sekvenserne af både 3 ′ end-regionen gtfc og 5 ′ end-regionen i SPCr. Hver primer indeholder 24 komplementære baser, der indkoder en GS linker og en hans-tag-kodning sekvens i deres 5 ' regioner. Afbrydelse af de oprindelige lovgivningsmæssige sekvenser placeret i upstream ledsage regioner kan undgås ved tilsætning af hans-tag-kodning sekvenser til 3 ′ ende. DNA-stop codon skal fjernes fra Gtfc-reverse primer og tilsættes til SPCr-Forward primer. Desuden bør gtfc-Forward og SPCr-reverse udformes med henblik på at forstærke ledsage-regioner på ca. 1 kb opstrøms og nedstrøms for målområdet for homologe rekombination i S. mutans WT Genome, Henholdsvis. Tilsætning af lange ledsage sekvenser forbedrer effektiviteten af homologe rekombination. De indlejrede primere blev designet til at blive brugt i stedet for det yderste primer-par (Gtfc-Forward og SPCr-reverse) i denne protokol. Medtagelse af indlejrede primere er nødvendig for den anden PCR, som beskrevet andetsteds5.
Transformation ved elektro portering er effektiv1 og procedurer for kompetent celle forberedelse forud for elektro portering er også meget enklere i forhold til de alternative metoder16,17,18, selv om der kræves et elektro porations apparat. Det anbefales kraftigt at tilberede kompetente s. mutantes WT på ny i tilfælde af manglende kolonier på pladen efter elektroporation. Selv om inkubation i et par timer efter elektroporation kan forbedre transformation effektivitet, den ekstra inkubation påvirker ikke succes af omdannelsen. Celler i loggen vækstfase bør anvendes til den kompetente celle præparat, som beskrevet tidligere5.
Da mængden af rekombinant protein afhænger af det indfødte udtryk af genet, kan det være nødvendigt at opskalere kulturen i tilfælde af proteiner med lavere ekspression. Den metode, der præsenteres her, er begrænset af anvendelsen af den funktionelle restaurering analyse. Tilsætning af gen af interesse kan ikke anvendes på intracellulære proteiner eksogent. Den udviklede metode giver imidlertid betydelige fordele med hensyn til facilitet, effektivitet og omkostninger (f. eks. ingen enzymatiske reaktioner bortset fra PCR), når der arbejdes med det ekstracellulære målprotein. Desuden kan oprensning af det rekombinante protein og bekræftelse af det faktiske genekspression udføres blot ved hjælp af almindeligt hans-tag applikationer, som vist i figur 5.
Den nuværende metode, herunder genafbrydelse og isolation af genprodukt, kan tilpasses til fremtidig anvendelse i andre arter som serie eksperimenter til funktionel analyse af et gen af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Japan Society for fremme af videnskab (JSPS) (Grant numre 16K15860 og 19K10471 til T. M., 17K12032 til M. I. og 18K09926 til N. H.) og SECOM Science and Technology Foundation (SECOM) (tilskudsnummer 2018.09.10 nr. 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Nippon Genetics | NE-AG02 | For agarose gel electrophoresis |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Anti-His-Tag monoclonal antibody | MBL | D291-7 | HRP-conjugated |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Measurement of protein concentration |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture medium |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
| Centrifugal ultrafiltration unit | Sartorius | VS2032 | Buffer replacement and protein concentration |
| Centrifuge | Kubota | 7780II | |
| Chromatographic column | Bio-Rad | 7321010 | For IMAC |
| Dialysis membrane clamp | Fisher brand | 21-153-100 | |
| Dialysis tubing | As One | 2-316-06 | |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| DNA sequencing | Eurofins Genomics | ||
| ECL substrate | Bio-Rad | 170-5060 | For western blotting |
| EDTA (0.5 M pH 8.0) | Wako | 311-90075 | Tris-EDTA buffer preparation |
| Electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | 0.2 cm gap |
| Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| EtBr solution | Nippon Gene | 315-90051 | For agarose gel electrophoresis |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Imager | GE Healthcare | 29083461 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Imidazole | Wako | 095-00015 | Binding buffer and elution buffer preparation |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | EZ-022 | Temperature setting: 4 °C |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | LH-100-RDS | Temperature setting: 37 °C |
| Membrane filter | Merck Millipore | JGWP04700 | 0.2 µm diameter |
| Microcentrifuge | Kubota | 3740 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaH2PO4·2H2O | Wako | 192-02815 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| (NH4)2SO4 | Wako | 015-06737 | Ammonium sulfate precipitation |
| Ni-charged resin | Bio-Rad | 1560133 | For IMAC |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | |
| Protein standard | Bio-Rad | 161-0381 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Solvent filtration apparatus | As One | FH-1G | |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics; use at 100 μg/mL |
| Sterile syringe filter | Merckmillipore | SLGV004SL | 0.22 µm diameter |
| Streptococus mutans ΔgtfC | Stock strain in the lab. | gtfC replaced with spcr | |
| Streptococus mutans UA159 | Stock strain in the lab. | S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| TAE (50 × ) | Nippon Gene | 313-90035 | For agarose gel electrophoresis |
| Thermal cycler | Bio-Rad | PTC-200 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Wako | 314-90065 | Tris-EDTA buffer preparation |
References
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
- Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).
- Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Wingfield, P. T.
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Smith, P. K., et al.
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
