Immunology and Infection

Reinigung eines hochmolekularen Proteins in Streptococcus mutans

Published: September 14, 2019 doi: 10.3791/59804

Takatoshi Murata¹, Mamiko Yamashita¹, Masao Ishikawa^1,2, Koji Shibuya², Nobuhiro Hanada¹

¹Department of Translational Research, Tsurumi University School of Dental Medicine, ²Laboratory for Oral Health Science

Summary

Beschrieben hier ist eine einfache Methode zur Reinigung eines Genprodukts in Streptococcus mutans. Diese Technik kann bei der Reinigung von Proteinen, insbesondere Membranproteinen und Proteinen mit hoher Molekularmasse, von Vorteil sein und kann mit verschiedenen anderen Bakterienarten verwendet werden.

Abstract

Die Aufklärung der Funktion eines Gens beinhaltet in der Regel den Vergleich von phänotypischen Merkmalen von Wildstämmen und Stämmen, bei denen das Gen von Interesse gestört wurde. Funktionsverlust nach Einer-Störung wird anschließend durch exogene Zugabe des Produkts des gestörten Gens wiederhergestellt. Dies hilft, die Funktion des Gens zu bestimmen. Eine zuvor beschriebene Methode beinhaltet die Erzeugung eines gtfC-Gen-gestörten Streptococcus-Mutans-Stamms. Hier wird eine anspruchslose Methode zur Reinigung des gtfC-Genprodukts aus dem neu erzeugten S. mutans Stamm nach der Genstörung beschrieben. Es beinhaltet die Zugabe einer Polyhistidin-kodierenden Sequenz am 3-Zoll-Ende des Gens von Interesse, die eine einfache Reinigung des Genprodukts mittels immobilisierter Metallaffinitätschromatographie ermöglicht. Für die genetische Veränderung dieser Methode sind keine anderen enzymatischen Reaktionen als PCR erforderlich. Die Wiederherstellung des Genprodukts durch exogene Addition nach Genstörungen ist eine effiziente Methode zur Bestimmung der Genfunktion, die auch an verschiedene Arten angepasst werden kann.

Introduction

Die Analyse der Funktion eines Gens beinhaltet in der Regel den Vergleich von phänotypischen Merkmalen wildartigen Stämmen mit Stämmen, in denen das Gen von Interesse gestört wurde. Sobald der gengestörte Stamm produziert ist, ermöglicht die exogene Zugabe des Genprodukts eine funktionelle Wiederherstellung.

Die häufigste Methode zur Gewinnung gereinigter Genprodukte, die für nachfolgende Restaurationstests erforderlich sind, ist die Durchführung einer heterologen Expression bei Escherichia coli¹. Allerdings ist die Expression von Membranproteinen oder proteinen mit hoher molekularer Masse mit diesem System oft schwierig¹. In diesen Fällen wird das Zielprotein in der Regel aus den Zellen isoliert, die das Protein nativ durch eine komplexe Reihe von Schritten synthetisieren, was zum Verlust des Genprodukts führen kann. Um diese Probleme zu überwinden, wurde ein einfaches Verfahren für die Genproduktreinigung nach einer Genstörungsmethode², PCR-basierte DNA-Spleißmethode³ (als zweistufige Fusion PCR bezeichnet) und Elektroporation für genetische Transformation in Streptococcus mutans. Die Zugabe eines Polyhistidin-Tags (His-tag) zum C-Terminus des Genprodukts erleichtert seine Reinigung durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC).

Um den His-tag-exezierenden Stamm zu isolieren, wird die gesamte genomische DNA des Gens von Interesse (in diesem His-Tag-exezierenden Gen-disrupted Stamm) durch ein antibiotikaresistentes Markergen ersetzt. Das Verfahren zur Erzeugung des His-tag-exzierenden Stammes ist fast identisch mit dem Verfahren zur Erzeugung eines gengestörten Stammes, wie zuvor^{beschrieben 4}^,⁵. Daher sollten die Methoden zur Genstörung und Genproduktisolation als serielle Experimente für die funktionelle Analyse durchgeführt werden.

In der vorliegenden Arbeit wird eine Polyhistidin-Kodierungssequenz am 3-Zoll-Ende des gtfC-Gens (GenBank locus tag SMU_1005) angebracht, die Glucosyltransferase-SI (GTF-SI) in S. mutans⁶kodiert. Dann wurden Expressionsstudien an einer Streptokokkenart durchgeführt. Die Erzielung einer heterologen gtfC-Expression durch E. coli ist schwierig, wahrscheinlich aufgrund der hohen molekularen Masse von GTF-SI. Diese Sorte heißt S. mutans His-gtfC. Eine schematische Abbildung, die die Organisation der gtfC- und Spectinomycin-Resistenz-Genkassette (spc^r)⁷ loci in Wildtyp S. mutans (S. mutans WT) und deren Derivaten darstellt, ist in Abbildung 1. Der GTF-SI ist ein sekretores Protein, das zur Entwicklung des karogenen Dentalbiofilms⁶beiträgt. Unter der Anwesenheit von Saccharose wird ein anhaftender Biofilm auf einer glatten Glasoberfläche in WT S. Mutans Stamm, aber nicht in der S. mutans gtfC-disrupted Stamm (S. mutans 'gtfC)²^,⁵. Die Biofilmbildung wird in S. mutans -gtfC nach exogener Zugabe des rekombinanten GTF-SI wiederhergestellt. Die Sorte, S. mutans His-gtfC, wird dann verwendet, um den rekombinanten GTF-SI zuproduzieren.

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Protocol

HINWEIS: Die Generierung von S. mutans -gtfC, bei der der gesamte Kodierungsbereich des gtfC-Gens durch spc^r ersetzt wird, muss vor der Ausführung dieser Protokolle abgeschlossen werden. Weitere Informationen zu Generation⁵finden Sie im veröffentlichten Artikel .

1. Primer-Design

Bereiten Sie Primer für den Bau von S. mutans His-gtfC.
HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten Primersequenzen sind in Tabelle 1dargestellt. Die zweistufige Fusion PCR-Methode zur Erzeugung von S. mutans His-gtfC ist schematisch in Abbildung 2dargestellt.
1. Designprimer (gtfC-reverse und spc^r-forward) für die Befestigung der His-tag-codierungssequenz, die zwischen dem gtfC-Gen und spc^r (Abbildung 2A) interveniert.
  1. Fügen Sie GS-Linker und His-Tag-Codierungsequenz in gtfC-reverse und spc^r-forward Primer ein, in denen 24 Basen in den 5' Regionen einander ergänzen.
    HINWEIS: Die Aminosäuresequenz des GS-Linkers und his-tags (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-His-) ist durch Genübersetzung an den C-Terminus von GTF-SI angehängt.
  2. Entwerfen Sie einen gtfC-forward Primer, um das gtfC-Gen im S. mutans WT Genom >1 kb flussabwärts des Gens und des spc^r-reverse Primers zu zielen, um den nachgeschalteten flankierenden Bereich von spc^r in den S. mutans .gtfC. Stellen Sie die Schmelztemperatur⁸ (T_m) der gtfC-forward und spc^r-reverse Primer auf die Schmelztemperaturen der gtfC-reverse und spc^r- Vorwärtsprimer.
2. Entwerfen Verschachtelter Primer (geschachtelt vorwärts und verschachtelt-rückwärts) für die zweite PCR (Abbildung 2B).
3. Designprimer (gtfC-forward und colony-reverse) spezifisch für die genomische DNA des Transformants(Abbildung 2C; die Primer werden für Kolonie PCR verwendet).
  HINWEIS: Die Amplicons bewegen sich über den Rahmen zwischen gtfC und spc^r. Der gtfC-forward Primer kann als Vorwärtsprimer angewendet werden.
4. Designprimer (up-forward and down-reverse) zur endgültigen Bestätigung der Generation von S. mutans His-gtfC (Abbildung 2C; das PCR-Produkt, das durch die Primer verstärkt wird, wird für die DNA-Sequenzierung verwendet).

2. Genomische DNA-Extraktion von S. mutans

HINWEIS: Jeder S. Mutansstamm sollte bei einer Hirninfusion (BHI) bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen kultiviert werden. Die mutierten Stämme der S. Mutaner -gtfC und S. mutans His-gtfC werden in BHI kultiviert, ergänzt durch 100 g/ml Spectinomycin.

Streak S. mutans WT und S. mutans -gtfC separat auf jede der BHI-Agarplatten. Inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C.
Wählen Sie einzelne Kolonien von S. mutans WT oder S. mutans -gtfC mit einem sterilisierten Zahnstocher und impfen Sie in 1,5 ml BHI-Brühe. Inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C.
HINWEIS: Die Kolonien können als Quelle der Vorlagen-DNA für die erste PCR (Schritt 3.1) verwendet werden.
Übertragen Sie 1 ml jeder Bakterienkultur in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Zentrifugieren Sie die Kultur für 1 min bei 15.000 x g.
Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml des Tris-EDTA-Puffers (pH 8.0) hinzu, um das Zellpellet wieder aufzuhängen.
Zentrifugieren Sie die Suspension für 1 min bei 15.000 x g. Entfernen Sie den Überstand. Setzen Sie das Zellpellet in 50 l Tris-EDTA-Puffer (pH 8,0) wieder auf.
Erhitzen Sie die Aufhängung mit einem Block-Inkubator für 5 min bei 95 °C. Zentrifugieren Sie die Suspension für 5 min bei 15.000 x g.
Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr (der Überstand dient als Vorlagen-DNA für die erste PCR).

3. PCR-Verstärkung

HINWEIS: Tabelle 1, Tabelle 2und Tabelle 3 fassen die PCR-Primer, Reagenzien bzw. Amplifikationszyklen zusammen.

Führen Sie die erste PCR mit dem S. mutans WT und S. mutans -genom als PCR-Vorlagen durch. Verstärken Sie die Regionen, die den nachgelagerten Teil des gtfC-Gens beherbergen, und die Regionen, die spc^r beherbergen, mit den in Schritt 1.1.1.2 beschriebenen Primern (Abbildung 2A).
Elektrophorese jedes PCR-Produkt auf 1% Agarose-Gel. Verbrauchen Sie die gewünschten DNA-Fragmente von ca. 1.000 bp und 2.000 bp. Reinigen Sie die Fragmente aus den Gelen mit der Kieselsäure-Membran-basierten Gelextraktionsmethode.
HINWEIS: Die grundlegenden Verfahren für PCR⁹, DNA-Gel-Elektrophorese¹⁰und DNA-Reinigung¹¹ sind an anderer Stelle detailliert.
Führen Sie eine zweite PCR mit den Produkten der ersten PCR (ungefähr äquimolar) als PCR-Vorlagen mit den verschachtelten Vorwärts- und Verschachtelten-Reverse-Primern(Abbildung 2B) durch.
Elektrophorese ein Zehntel der PCR-Mischung auf dem Agarose-Gel. Bestätigen Sie die Erzeugung des entsprechenden Amplicons von ca. 3.000 bp.
Das verbleibende PCR-Produkt zu überstürzen.
HINWEIS: Eine Reinigung des PCR-Produkts ist nicht erforderlich, da unspezifische Amplicons, die von der zweiten PCR erzeugt werden, die homologe Rekombination nicht beeinträchtigen.
1. Fügen Sie dem PCR-Gemisch nukleasefreies Wasser hinzu und bringen Sie das Gesamtvolumen auf 100 l, gefolgt von 0,1 Volumen (10 l) 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 2,5 Volumen (250 l) absolutem Ethanol. Mischen und lagern Sie die Mischung für 10 min bei Raumtemperatur (RT).
2. Zentrifugieren Sie die Probe für 20 min bei 15.000 x g bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie 1 ml 70% Ethanol hinzu, um das DNA-Pellet zu waschen.
3. Zentrifugieren Sie die Probe für 5 min bei 15.000 x g bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand. Lufttrocknen und lösen Sie das DNA-Pellet mit 10 l nukleasefreiem Wasser auf.

4. Zelltransformation

Bereiten Sie die zuständige S. mutans WT vor, um das zweite PCR-Produkt einzuführen, indem Sie die in der vorherigen Publikation⁵beschriebenen Schritte befolgen. Bewahren Sie die Zellen bei -80 °C auf.
HINWEIS: Für dieses Experiment wurden die kompetenten S. mutans WT-Zellen bereits in -80 °C konserviert, um S. Mutans zuerzeugen.
Mischen Sie 5 l des konzentrierten zweiten PCR-Produkts mit dem 50-L-Aliquot von eiskalten, kompetenten Zellen, die zuvor eingefroren wurden. Fügen Sie die Mischung in Elektroporationsküvetten. Geben Sie den Zellen mit Hilfe des Elektroporationsgeräts einen einzigen elektrischen Impuls (1,8 kV, 2,5 ms, 600 , 10 °F).
Setzen Sie die Zellen in 500 l BHI-Brühe aus. Sofort 10–100 l der Suspension auf BHI-Agarplatten, die Spektinomycin enthalten, verteilen. Die Platten für 2–6 Tage bei 37 °C bebrüten, bis die Kolonien ausreichend gewachsen sind, um abgeholt zu werden.

5. Überprüfung der G-Enome-Rekombination und -Lagerung

Führen Sie Kolonie-PCR mit gtfC-forward und Kolonie-Reverse-Primer für die Rekombination. Elektrophorese jedes Kolonie PCR-Produkt auf einem Agarose-Gel. Bestätigen Sie das DNA-Fragment von ca. 1.500 bp.
Wählen Sie eine der positiven Kolonien mit einem sterilisierten Zahnstocher und Subkultur die Zellen über Nacht in 2 ml BHI-Brühe mit Spektinomycin.
0,8 ml Bakterienkultur mit 0,8 ml sterilem 50% Glycerin mischen und bei -80 °C oder -20 °C lagern.
Übertragen Sie die restlichen 1 ml Zellsuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Wiederholen Sie die Schritte 2.3–2.7, um die genomische DNA aus den Zellen zu extrahieren.
Führen Sie PCR mit den Up-Forward- und Down-Reverse-Primern und der genomischen DNA als Vorlage aus. Wiederholen Sie Schritt 3.2, um das verstärkte DNA-Produkt von den Gelen zu reinigen.
Bestimmen Sie die DNA-Sequenz des gereinigten Amplicons durch DNA-Sequenzierung.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Erzeugung von S. mutans His-gtfC durch DNA-Sequenzierung bestätigt wird.

6. Reinigung von Polyhistidin-getaggt enden GTF-SI

Streak S. mutans His-gtfC auf eine spectinomycinhaltige BHI Agarplatte. Inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C.
Nehmen Sie eine einzelne Kolonie mit einem sterilisierten Zahnstocher und Subkulturzellen in 3 ml BHI-Brühe auf. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
Bereiten Sie zwei konische Kolben mit 1 L BHI Brühe ohne Spectinomycin. 1 ml der Nachtkultursuspension in 1 L der BHI-Brühe impfen. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
Konzentratproteine aus dem Kulturüberstand durch Ammoniumsulfatfällung.
HINWEIS: Extrahieren Sie aus Zellkörpern, wenn ein Zielprotein intrazellulär ist. Die grundlegenden Verfahren für Ammoniumsulfat-Fällung sind an anderer Stelle detailliert¹².
1. Zentrifugieren Sie die bakterielle Kultursuspension für 20 min bei 10.000 x g bei 4 °C. Erholen Sie den Kulturüberstand in einem 3 L Glasbecher.
2. 1.122 g Ammoniumsulfat zu 2 L des Überstandes (80% Sättigung) mit kräftigem Rühren mit einem Magnetischen Rührer hinzufügen. Lassen Sie den Niederschlag bei 4 °C unter Rühren 4 h oder mehr bilden.
  HINWEIS: Die Niederschlagsbildung kann über Nacht fortgesetzt werden.
3. Zentrifugieren Sie die ammoniumsulfat-ausgefällte Lösung bei 15.000 x g für 20 min bei 4 °C. Dekant den Überstand.
4. Sammeln Sie den Niederschlag mit einem Spachtel und übertragen Sie in ein 200 ml Glasbecher. Die Pellets in 35 ml Bindungspuffer (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 5 mM Imidazol, pH 8,0) wieder aufsetzen.
5. Dialyse die Suspension gegen 2.500 ml des Bindungspuffers mit einem regenerierten Cellulosedialyseschlauch bei 4 °C unter Rühren dialyzieren. Ersetzen Sie die Dialyselösung nach 2 h und setzen Sie die Dialyse über Nacht fort.
6. Ersetzen Sie die Dialyselösung erneut. Fahren Sie fort, um für weitere 2 h zu dialyze.
Zentrifugieren Sie die Dialyseaufhängung bei 20.000 x g für 10 min bei 4 °C. Filtern Sie den Überstand durch einen Membranfilter mit Saugfiltrationsgeräten. Das Filtrat in einen 75 cm² Kolben überführen.
Fraktionieren Sie den mit Polyhistidin markierten GTF-SI aus der filtrierten Suspension durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC).
1. 2 ml der Ni-geladenen IMAC-Harzschlämme (ca. 1 ml Harz) auf eine chromatographische Säule übertragen, deren Auslass an einem Silikonrohr angebracht ist. Entfernen Sie die Speicherlösung durch den Schwerkraftfluss.
  ACHTUNG: Lassen Sie das Harz nicht im gesamten IMAC austrocknen.
2. Fügen Sie 3 ml destilliertes Wasser in die Säule, um das Harz zu waschen. Fügen Sie 5 ml des Bindungspuffers hinzu, um das Harz auszueinemt.
3. Schließen Sie den Fluss mit einem Hoffmann-Pinch-Hahn ab. Fügen Sie 5 ml der gefilterten Suspension aus Schritt 6.5 hinzu, um die Gülle herzustellen.
4. Fügen Sie die gesamte Gülle der verbleibenden gefilterten Aufhängung hinzu. Die Mischung 30 min bei 4 °C vorsichtig verwirbeln.
5. Laden Sie die Mischung wieder auf die Spalte. Entfernen Sie die Suspension durch den Schwerkraftfluss. Waschen Sie das IMAC-Harz mit 20 ml Bindungspuffer.
  HINWEIS: Stellen Sie den Durchfluss während des nachfolgenden IMAC mit einem Hoffmann-Pinch-Hahn auf ca. 2 ml/min ein.
6. Elute den rekombinanten GTF-SI mit 20 ml des Elutionspuffers (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 500 mM Imidazol, pH 8.0).
  HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Das Eluat sollte bei 4 °C gelagert werden. IMAC-Harz kann wiederverwendet werden. Beachten Sie die Anweisungen für das IMAC-Harz.
Ersetzen Sie den Elutionspuffer durch den Speicherpuffer (50 mM Phosphatpuffer, pH 6,5) und konzentrieren Sie die rekombinante GTF-SI-Lösung mit einer Zentrifugal-Ultrafiltrationseinheit auf ca. 1 ml. Bewahren Sie die rekombinante GTF-SI-Lösung bei 4 °C auf.
HINWEIS: Bestätigen Sie die mit Polyhistidin gekennzeichnete GTF-SI-Reinigung mit SDS-PAGE¹³ und Western Blotting^14, indem Sie einen mit Meerrettich peroxidase konjugierten monoklonalen Antipolyhistidin-Antikörper verwenden. Zugabe von CHAPS (Endkonzentration, 0,1%) je nach Zielprotein kann erforderlich sein, um eine unspezifische Adsorption an die Einheit zu vermeiden.

7. Funktionelle Wiederherstellung durch rekombinantes GTF-SI

Streichen Sie jede S. mutans Belastung auf eine BHI AgarPlatte einzeln. Die Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren.
Mit einem sterilisierten Zahnstocher, nehmen Sie eine einzelne Kolonie auf, um in 2 ml BHI-Brühe zu impfen. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
Verwenden Sie 20 l der Nachtkultur von S. Mutans -gtfC, um 2 ml BHI-Brühe zu impfen, die 1% Saccharose ohne Antibiotika in einem Glas-Reagenzglas enthält. Fügen Sie den GTF-SI oder ein gleichwertiges Volumen des Fahrzeugs zur S. mutans-gtfC-Kultur hinzu und kulturieren Sie die Zellen mit der Röhre, die über Nacht in eine geneigte Position gebracht wird.
HINWEIS: Sterilisieren Sie die GTF-SI-Lösung mit einem sterilen Spritzenfilter und bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem Bicinchoninsäure-Protein-Assay¹⁵ vor der Anwendung.
Rühren Sie die Kulturaufhängungen mit einem Wirbelmischer für 10 s. Decant die Suspensionen. Waschen Sie die Reagenzgläser mit einer ausreichenden Menge destilliertem Wasser.
Die Biofilme an der Rohrwand mit 1 ml 0,25% Coomassie brillantblau (CBB) beflecken.
Die Färbelösung nach 1 min dekantieren. Die Reagenzgläser mit ausreichend destilliertem Wasser waschen. Die Reagenzgläser lufttrocknen.

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Representative Results

Abbildung 3 zeigt die Größe jedes Amplicons aus der ersten PCR (Abbildung 3A) und der zweiten PCR (Abbildung 3B). Die Größe jedes Amplicons entsprach der vorhergesagten Größe, wie in Tabelle 1beschrieben. Abbildung 4A zeigt S. Mutane-Kolonien, die mit dem zweiten PCR-Produkt transformiert und auf den BHI-Agarplatten mit Spektinomycin plattiert sind. Colony PCR Produkte wurden dann auf dem Agarose-Gel ausgeführt (Abbildung 4B). Jedes Amplicon hatte die vorhergesagte Größe, wie in Tabelle 1beschrieben. Abbildung 5 zeigt Bilder von SDS-PAGE und Western Blot. Protein, das mit IMAC gereinigt wurde, wurde als einzelband von SDS-PAGE beobachtet (Abbildung 5A). Western Blot wurde mit dem Anti-Polyhistidin-Antikörper durchgeführt, um zu bestätigen, dass das beobachtete Band das erwartete Polyhistidin-markierte Protein war (Abbildung 5B) von 160 kDa. Abbildung 6 zeigt die von Saccharose abgeleitete Biofilm-Bildformfähigkeit jedes S. Mutansstamms. Nur S. mutans WT und S. mutans His-gtfC konnte in Gegenwart von 1% Saccharose einen haftenden Biofilm an der Rohrwand bilden. Dies wurde bei S. mutans ngtfC (Abbildung 6A) nicht beobachtet. Die Zugabe des rekombinanten GTF-SI stellte jedoch die haftende Biofilmbildungsfähigkeit in S. mutans wieder her (Abbildung 6B).

Abbildung 1: Organisation von gtfC und spc^r loci im S. mutans UA159 Genom und seinen Derivaten. Eine schematische Darstellung des His-Tags zwischen gtfC und spc^r. Die Längen der Gene und Lücken sind nicht zu skalieren. Schattiertes Fünfeck: SMU_1004; solides Fünfeck: SMU_1006. Diese Zahl wurde gegenüber einer früheren Veröffentlichung²geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Strategie für zweistufige Fusion PCR. Eine schematische Darstellung von S. mutans Seine-gtfC-Konstruktion. Die Längen der Gene und Lücken sind nicht zu skalieren. Die Primerbindungssites in der Vorlage werden durch Muster angezeigt. (A) Die Regionen, die einen Teil des gtfC-Gens im S. mutans WT-Genom beherbergen und spc^r in den S. mutans -gtfC-Genom beherbergen, wurden mit der ersten PCR verstärkt. (B) Die zweite PCR wurde mit verschachtelten Primern mit den beiden Fragmenten durchgeführt, die durch die erste PCR als Vorlagen verstärkt wurden, und es wurde ein DNA-Konstrukt für die homologe Rekombination erhalten. (C) Der mutierte Stamm wurde bei homologe Rekombination in den Bakterien erzeugt. Diese Zahl wurde gegenüber einer früheren Veröffentlichung²geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Agarose-Gel-Elektrophorese erster und zweiter PCR-Produkte. (A) Produkte der ersten PCR eines Teils von gtfC (gtfC; linkes Bild) und der Region, die Spcr (Spcr; rechtes Bild) beherbergt, werden angezeigt. Das einzelne elektrophoretische Bild wird geteilt, um die Markerbänder zu beschriften. (B) Die zweiten PCR-Produkte, die mit den verschachtelten Primern verstärkt werden, werden angezeigt. Jede Pfeilspitze gibt die vorhergesagte Größe jedes PCR-Produkts an. M = molekularer Marker. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Kolonie PCR zur Bildschirmgenerierung von S. mutans His-gtfC. (A) S. mutans Kolonien, die durch das zweite PCR-Produkt transformiert werden, werden angezeigt. Die Kolonie-ID wird durch eingekreiste Zahlen angezeigt. (B) Agarose-Gel-Elektrophorese der Kolonie PCR-Produkte wird gezeigt. Die kreisrunde Spurnummer entspricht der Kolonie-ID in Abbildung 4A. M = molekularer Marker. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Bestätigung der mit Polyhistidin gekennzeichneten GTF-SI-Reinigung. (A) Repräsentatives SDS-PAGE-Bild wird angezeigt. (B) Repräsentatives westliches Blotbild wird angezeigt. Eine Nitrocellulosemembran, auf die GTF-SI übertragen wurde, wurde mit einem mit Meerrettich peroxidase konjugierten monoklonalen Antipolyhistidin-Antikörper untersucht. Immunreaktive Bänder wurden mit einer Chemilumineszenzreaktion visualisiert. Die Pfeilspitzen geben die vorhergesagte Größe des rekombinanten GTF-SI an. M: molekularer Marker; 1 = Probe vor IMAC; 2 = von IMAC erhaltene Probe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Funktionelle Wiederherstellung durch Zugabe des rekombinanten GTF-SI. (A) Die Fähigkeit der saccharoseabgeleiteten haftierten Biofilmbildung wird für jeden S. Mutansstamm gezeigt. (B) Die Fähigkeit, haftende Biofilme zu bilden, wurde in S. mutans -gtfC durch Zugabe von rekombinanten GTF-SI (25 g) wiederhergestellt. WT = S. mutans WT; -gtfC =S. mutans -gtfC; His-gtfC =S. mutans His-gtfC. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Primerpaare	Sequenz (5 bis 3))	Erwartete Bandgröße (bp)
1. PCR
gtfC-vorwärts gtfC-reverse ^A,B	TAAAGGTTATTTATTATTCAACGAGTGGTAACC ATGATGATGATGACTACCACCACCTCC AAATCTAAAGAAATTGTCAA	1,090
spc^r-vorwärts ^A,C spc^r-reverse	GGTGGTAGTCATCATCATCATCAT CAT TAAATCGATTTTCGTTCGTGAAT TTAAGAGCAAGTTTAAGATAGAKATACATGTTACTCAC	2,232
2. PCR
Nested-forward Nested-Reverse	TGGTATTATTTCGATAATAACGGTTATATGGTCAC GCCATACTTAGAGAAATTTCTGCTAAATTCTTG	3,179
Überprüfung der Rekombination
Kolonie PCR
gtfC-vorwärts Kolonie-Reverse	TAAAGGTTATTTATTATTCAACGAGTGGTAACC CCACTCTCAACTCCTGATCCAAACATGTAAGTACC	1,482
Endgültige Überprüfung
Up-Forward Down-Reverse	TACGGCCGTATCAGTTATTACGATGCTAACTCTGG TTGTCCACTTTGAAGTCAACCTTGCAAGGCATG	6,173

Tabelle 1: Im Protokoll verwendete Primer. ^A Die unterstrichenen Sequenzen von 'gtfC-reverse und spc^r-forward' ergänzen sich, und der fettformatierte Sequenzcode für das His-Tag (gtfC-reverse; ATGATGATGATGATG, spc^r-forward; CATCATCATCATCATCATCAT) und GS-Linker (gtfC-reverse; ACTACCACCACCTCC, spc^r-forward; GGTGGTAGT). ^B Das DNA-Stopp-Codon von gtfC wurde entfernt. ^C Unmittelbar nach den Polyhistidin-Kodierungssequenzen wurde ein DNA-Stopp-Codon (TAA) hinzugefügt.

Reagenz	Konzentration der Lagerlösung	Volumen	Endgültige Konzentration
DNA-Polymerase-Premix	2x	25 l	1x
Vorwärtsgrundierung	5 m	2 l	0,2 m
Reverse Primer	5 m	2 l	0,2 m
Template-DNA	veränderlich	veränderlich	veränderlich
Deionisiertes Wasser	-	Bis zu 50 l	-

Tabelle 2: PCR-Reagenzien: Für die erste PCR wurden 2 l der DNA-Vorlage hinzugefügt. Für die zweite PCR wurde dem Reaktionsgemisch 0,5-2 l des ersten PCR-Amplicons zugesetzt. Für Kolonie PCR wurden dem Reaktionsgemisch direkt Bakterienzellen zugesetzt.

schritt	temperatur	zeit	Anzahl der Zyklen
Anfängliche Denaturierung	98 °C	2 Min.	1
Denaturierung Glühen anbau	98 °C 50 °C 72 °C	10 s 5 s Amplicon-abhängig (1 min/1 kbp)	35
Endgültige Verlängerung	72 °C	Amplicon-abhängig (1 min/1 kbp)	1

Tabelle 3: PCR-Verstärkungszyklen.

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Discussion

Das Design von Primern ist der kritischste Schritt im Protokoll. Die Sequenzen der gtfC-reverse und spc^r-forward Primer wurden automatisch bestimmt, basierend auf den Sequenzen sowohl des 3-Zoll-Endbereichs von gtfC als auch des 5-Zoll-Endbereichs von spc^r. Jeder Primer enthält 24 komplementäre Basen, die einen GS-Linker und eine His-Tag-Codierungssequenz in ihren 5' Regionen kodieren. Eine Störung der nativen regulatorischen Sequenzen in den vorgelagerten Flankenregionen kann durch das Hinzufügen von His-Tag-Codierungssequenzen am 3-Zoll-Ende vermieden werden. Das DNA-Stopp-Codon muss aus dem gtfC-Reverse Primer entfernt und dem spc^r-forward Primer hinzugefügt werden. Darüber hinaus sollte der gtfC-forward und spc^r-reverse so konzipiert sein, dass flankierende Bereiche von ca. 1 kb strom- und flussabwärts der Zielregion der homologen Rekombination im S. mutans WT Genom, in dieser reihenfolge. Die Zugabe langer Flankensequenzen verbessert die Effizienz der homologen Rekombination. Die verschachtelten Primer wurden für die Verwendung anstelle des äußersten Primerpaares(gtfC-forward und spc^r-reverse) in diesem Protokoll entwickelt. Die Einbeziehung von verschachtelten Primern ist für die zweite PCR erforderlich, wie^ananderer Stelle 5 beschrieben.

Transformation durch Elektroporation ist effizient¹ und Verfahren für eine kompetente Zellvorbereitung vor der Elektroporation sind auch viel einfacher im Vergleich zu den alternativen Methoden¹⁶^,¹⁷^,¹⁸, obwohl ein Elektroporationsgerät erforderlich ist. Es wird dringend empfohlen, bei fehlenden Kolonien auf der Platte nach der Elektroporation die kompetente S. mutans WT neu vorzubereiten. Obwohl die Inkubation für ein paar Stunden nach der Elektroporation die Transformationseffizienz verbessern kann, hat die zusätzliche Inkubation keinen Einfluss auf den Erfolg der Transformation. Zellen in der Logwachstumsphase sollten für die kompetente Zellvorbereitung verwendet werden, wie zuvor^{beschrieben 5}.

Da die Menge des rekombinanten Proteins von der nativen Expression des Gens abhängt, kann eine Scale-up-Kultur bei Proteinen mit geringerer Expression erforderlich sein. Die hier vorgestellte Methode wird durch die Anwendung des funktionellen Restaurations-Assays eingeschränkt. Die Zugabe von Gen von Interesse kann nicht auf intrazelluläre Proteine exogen angewendet werden. Die entwickelte Methode bietet jedoch erhebliche Vorteile in Bezug auf Einrichtung, Effizienz und Kosten (z. B. keine enzymatischen Reaktionen außer PCR) bei der Arbeit mit dem extrazellulären Zielprotein. Zusätzlich können die Reinigung des rekombinanten Proteins und die Bestätigung der tatsächlichen Genexpression einfach mit gängigen His-Tag-Anwendungen durchgeführt werden, wie in Abbildung 5dargestellt.

Die vorliegende Methode, einschließlich Genstörungen und Genproduktisolation, kann für die zukünftige Verwendung in anderen Arten als serielle Experimente zur funktionellen Analyse eines Gens von Interesse angepasst werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (Grant-Nummern 16K15860 und 19K10471 bis T. M., 17K12032 bis M. I., und 18K09926 an N. H.) und der SECOM Science and Technology Foundation (SECOM) (Grant-Nummer 2018.09.10 Nr. 1) unterstützt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Nippon Genetics	NE-AG02	For agarose gel electrophoresis
Anaeropack	Mitsubishi Gas Chemical	A-03	Anaerobic culture system
Anti-His-Tag monoclonal antibody	MBL	D291-7	HRP-conjugated
BCA protein assay kit	Thermo Fisher Scientific	23227	Measurement of protein concentration
Brain heart infusion broth	Becton, Dickinson	237500	Bacterial culture medium
CBB R-250	Wako	031-17922	For biofilm staining
Centrifugal ultrafiltration unit	Sartorius	VS2032	Buffer replacement and protein concentration
Centrifuge	Kubota	7780II
Chromatographic column	Bio-Rad	7321010	For IMAC
Dialysis membrane clamp	Fisher brand	21-153-100
Dialysis tubing	As One	2-316-06
DNA polymerase	Takara	R045A	High-fidelity DNA polymerase
DNA sequencing	Eurofins Genomics
ECL substrate	Bio-Rad	170-5060	For western blotting
EDTA (0.5 M pH 8.0)	Wako	311-90075	Tris-EDTA buffer preparation
Electroporation cuvette	Bio-Rad	1652086	0.2 cm gap
Electroporator	Bio-Rad	1652100
EtBr solution	Nippon Gene	315-90051	For agarose gel electrophoresis
Gel band cutter	Nippon Genetics	FG-830
Gel extraction kit	Nippon Genetics	FG-91202	DNA extraction from agarose gel
Imager	GE Healthcare	29083461	For SDS-PAGE and western blotting
Imidazole	Wako	095-00015	Binding buffer and elution buffer preparation
Incubator	Nippon Medical & Chemical Instruments	EZ-022	Temperature setting: 4 °C
Incubator	Nippon Medical & Chemical Instruments	LH-100-RDS	Temperature setting: 37 °C
Membrane filter	Merck Millipore	JGWP04700	0.2 µm diameter
Microcentrifuge	Kubota	3740
NaCl	Wako	191-01665	Preparation of binding buffer and elution buffer
NaH₂PO₄·2H₂O	Wako	192-02815	Preparation of binding buffer and elution buffer
NaOH	Wako	198-13765	Preparation of binding buffer and elution buffer
(NH₄)₂SO₄	Wako	015-06737	Ammonium sulfate precipitation
Ni-charged resin	Bio-Rad	1560133	For IMAC
PCR primers	Eurofins Genomics	Custom-ordered
Protein standard	Bio-Rad	161-0381	For SDS-PAGE and western blotting
Solvent filtration apparatus	As One	FH-1G
Spectinomycin	Wako	195-11531	Antibiotics; use at 100 μg/mL
Sterile syringe filter	Merckmillipore	SLGV004SL	0.22 µm diameter
Streptococus mutans ΔgtfC	Stock strain in the lab.		gtfC replaced with spc^r
Streptococus mutans UA159	Stock strain in the lab.		S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain
Sucrose	Wako	196-00015	For biofilm development
TAE (50 × )	Nippon Gene	313-90035	For agarose gel electrophoresis
Thermal cycler	Bio-Rad	PTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8.0)	Wako	314-90065	Tris-EDTA buffer preparation

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References

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