Summary
We gebruikten opname-en stimulatie elektroden in longitudinale hippocampal hersen schijfjes en longitudinaal geplaatste opname-en stimulatie elektroden in de rugzijde Hippocampus in vivo om extracellulaire postsynaptische potentialen aan te roepen en te demonstreren op lange termijn synaptische plasticiteit langs de longitudinale interlamellar CA1.
Abstract
De studie van synaptische plasticiteit in de hippocampus is gericht op het gebruik van de CA3-CA1 lamellaire netwerk. Er is minder aandacht besteed aan het longitudinale interlamellar CA1-CA1-netwerk. Onlangs echter, een associationele verbinding tussen CA1-CA1 piramidale neuronen is aangetoond. Daarom is er de noodzaak om te onderzoeken of de longitudinale interlamellar CA1-CA1 netwerk van de Hippocampus ondersteunt synaptische plasticiteit.
We ontwierpen een protocol om de aanwezigheid of afwezigheid van synaptische plasticiteit op lange termijn in het interlamellaire hippocampal CA1-netwerk te onderzoeken met behulp van elektrofysiologische veldopnames in vivo en in vitro. Voor in vivo extracellulaire veldopnames, de opname-en stimulatie elektroden werden geplaatst in een septale-temporale as van de dorsale Hippocampus in een langshoek, te roepen veld excitatory postsynaptisch potentials. Voor in vitro extracellulaire veldopnames werden hippocampal longitudinale plakjes parallel aan het septale-temporele vlak gesneden. Opname-en stimulatie elektroden werden geplaatst in de stratum Oriens (S. O) en het stratum radiatum (S. R) van de Hippocampus langs de lengteas. Dit stelde ons in staat om te onderzoeken van de directionele en laag specificiteit van opgeroepen excitatory postsynaptisch potentials. Reeds gevestigde protocollen werden gebruikt voor het opwekken van lange termijn potentiëring (LTP) en lange termijn depressie (LTD) zowel in vivo als in vitro. Onze resultaten toonden aan dat het longitudinale interlamellar CA1-netwerk N-methyl-D-aspartaat (NMDA) receptor afhankelijke lange-termijn potentiëring (LTP) ondersteunt zonder directionele of laag specificiteit. Het interlamellaire netwerk, in tegenstelling tot het transversale lamellaire netwerk, was echter niet aanwezig met een significante lange termijn depressie (LTD).
Introduction
De hippocampus is op grote schaal gebruikt in cognitieve studies1,2,3. De hippocampal lamellaire netwerk in de dwarse as vormt de Tri-synaptic circuits die is opgebouwd uit de getand gyrus, Ca3, en Ca1 regio's. Het lamellaire netwerk wordt beschouwd als een parallelle en onafhankelijke eenheid van4,5. Dit lamellaire gezichtspunt heeft invloed uitgeoefend op het gebruik van dwarse oriëntatie en dwarse segmenten voor zowel in vivo als in vitro elektrofysiologische studies van de hippocampus. In het licht van het opkomende onderzoek wordt de lamellaire hypothese opnieuw geëvalueerd6 en wordt ook aandacht besteed aan het interlamellaire netwerk van de hippocampus. Met betrekking tot de hippocampal interlamellar netwerk, de CA3 regio is al lang onderzocht7,8,9,10, maar de longitudinale Ca1 hippocampal regio heeft ontvangen relatief weinig aandacht tot voor kort. Met betrekking tot de CA1 interlamellar netwerk, de korte termijn synaptische eigenschappen langs de dorsoventral longitudinale de hippocampal CA1 as van ratten is aangetoond dat variëren11. Ook, clusters van hippocampal cellen reageren op de fase en de plaats bleken systematisch te worden gerangschikt langs de lengteas van de hippocampus bij ratten, ondergaat een korte termijn geheugen taak12. Ook, epileptische inbeslagneming activiteiten bleken te worden gesynchroniseerd langs de hele Hippocampus langs de lengteas van de as13.
De meeste studies van de regio longitudinale Ca1 hippocampal, hebben echter input gebruikt van de CA3 naar de Ca1-regio's11,14,15. Met behulp van een uniek protocol om longitudinale hersen segmenten te maken, ons vorige werk toonde de associationele connectiviteit van CA1 piramidale neuronen langs de lengteas en impliceerde haar vermogen om neuronale signalering effectief te verwerken16. Echter, er is een behoefte om te bepalen of de CA1 piramidale neuronen langs de lengteas zonder dwarse ingang lange termijn synaptische plasticiteit kan ondersteunen. Deze bevinding kan een andere hoek toe te voegen aan onderzoeken van neurologische kwesties met betrekking tot de hippocampus.
Het vermogen van neuronen om de werkzaamheid van informatieoverdracht aan te passen staat bekend als synaptische plasticiteit. Synaptische plasticiteit is betrokken als het onderliggende mechanisme voor cognitieve processen zoals leren en geheugen17,18,19,20. Op lange termijn synaptische plasticiteit wordt aangetoond als ofwel op lange termijn potentiëring (LTP), die de versterking van neuronale respons vertegenwoordigt, of langdurige depressie (LTD), die de verzwakking van neuronale respons vertegenwoordigt. Op lange termijn synaptische plasticiteit is bestudeerd in de dwarse as van de hippocampus. Echter, dit is de eerste studie om te demonstreren op lange termijn synaptische plasticiteit in de lengteas van de hippocampal van CA1 piramidale neuronen.
Voortbouwend op een protocol dat door Yang et al.16werd gebruikt, ontwierpen we het protocol om ltp en Ltd te demonstreren in de lengteas van de hippocampal van Ca1 piramidale neuronen. We gebruikten C57BL6 mannelijke muizen met leeftijden variërend tussen 5-9 weken oud voor in vitro experimenten en 6-12 weken oud voor in vivo experimenten. Dit gedetailleerde artikel toont hoe longitudinale hippocampal hersenen segmenten van muizen werden verkregen voor in vitro opnames en hoe in vivo opnames werden geregistreerd in de lengteas. Voor in vitro opnames, we onderzocht directionele specificiteit van longitudinale Ca1 synaptische plasticiteit door targeting van de ventrikel septum en temporele einde van de hippocampus. We hebben ook onderzocht laag specificiteit van de longitudinale CA1 synaptische plasticiteit door opname van de stratum Oriens en stratum radiatum van de hippocampus. Voor in vivo opnames onderzochten we de hoeken die het best overeenkomen met de longitudinale richting van de hippocampus.
Met behulp van zowel in vivo en in vitro extracellulaire veldopnames, we waargenomen dat de lengterichting verbonden Ca1 piramidale neuronen gepresenteerd met ltp, niet Ltd. De dwarse oriëntatie waarbij zowel CA3 als CA1 neuronen worden ondersteund, ondersteunt echter zowel LTP als LTD. Het onderscheid in de synaptische capaciteiten tussen de dwarse en de longitudinale oriëntatie van de Hippocampus kan speculatief duiden op verschillen in hun functionele connectiviteit. Verdere experimenten zijn nodig om te ontcijferen van de verschillen in hun synaptische capaciteiten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dieren werden behandeld in overeenstemming met de richtlijnen en verordeningen van de dierenverzorging en het gebruik van laboratorium van National Institute of Health. Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van de City University of Hong Kong en de nationale universiteit van Incheon.
1. in vivo veld opname
- Voorbereiding van dieren
- Injecteer urethaan (0,06 g per 25 g gewicht) intraperitoneaal om de muis te anesthetiseren. Supplement met intramusculaire injectie van atropine (0,05 mg/kg). Houd de muis in een donkere rustige plek tot volledige anesthesie van kracht.
Let op: urethaan heeft kankerverwekkend potentieel. Behandel het met zorg en Draag beschermende kleding om contact met de blootgestelde huid te voorkomen.
Opmerking: als alternatief kan Isofluraan gebruikt worden als verdoving. - Controleren op diepte van anesthesie met tussenpozen totdat een volledige chirurgische vlak van anesthesie van kracht. Controleer op de diepte van de anesthesie door het uitvoeren van Teen knijpen, oor knijpen, staart knijpen en corneale Touch tests om de reactie van de muis op fysieke stimuli observeren.
Opmerking: een reflex of vrijwillige beweging mag niet worden waargenomen wanneer de muis zich op een volledig chirurgische vlak van anesthesie. - Voor de toe-knijp test, strek je de achtervoet of de voor van de muis uit en knijp je stevig met een paar stompe Tang of vingers. De muis is niet bevestigd voor volledige anesthesie als het het been of schudt lichaam intrekt, heeft een waarneembare toegenomen ademhalingsfrequentie of maakt vocale geluiden.
- Voor de oorknijp test knijp je de uiteinden van de Pinna met een paar stompe Tang of vingers stevig vast. Volledige anesthesie wordt niet bevestigd als de muis beweegt de snorharen naar voren, schudt zijn hoofd, maakt vocale geluiden of heeft een waarneembare toegenomen ademhalingsfrequentie.
- Voor de staart knijp test houdt u de staart van de muis zachtjes en stevig vast met een stompe forcep of vinger. Geen staart beweging, vocale geluid of waargenomen toename van de ademhalingsfrequentie moet worden waargenomen wanneer volledig verdouseerd voor chirurgische ingrepen.
- Voor de corneale Touch test, raak het hoornvlies van de muis zachtjes aan, met een watten lont. Geen ooglid beweging, whisker beweging of waarneembare toename van de ademhalingsfrequentie moet worden waargenomen wanneer volledig verdouseerd voor chirurgie.
- Scheer het haar op de nek en de schedel van de muis.
- Plaats de volledig verdoofd Mouse op een verwarmingspaneel ingesteld op 37 °c en plaats de rectale temperatuursonde in het rectum. Hierdoor kan de warmte die door het verwarmingspaneel wordt geproduceerd, worden aangepast als reactie op veranderingen in de lichaamstemperatuur van de muis.
- Breng Eye gel aan om de ogen van de muis te bevochtigen.
- Trek de tong voorzichtig aan de zijkant van de lippen met behulp van een tang en bevestig de twee voorste tanden in het tweede of derde tandgat van het stereotactische instrument. Bevestig de schedel van de muis stevig met de Eye-Clamp.
Opmerking: als alternatief kan een stereotactische oorklem worden gebruikt. - Observeren onder een Microscoop, scheiden het subcutane weefsel en de spieren aan het einde van het interpariëtale en occipitale bot van de muis met een scalpel om de Cisterna magna bloot. DEP de dura mater droog met een wattenstaafje.
- Prik de Cisterna magna zachtjes door een ondiepe snede te maken met een scherp puntig scalpel blad om de cerebrospinale vloeistof (CSF) af te tappen. Bevestig een wattenstaafje om de CSF te blijven afvoeren.
- Injecteer urethaan (0,06 g per 25 g gewicht) intraperitoneaal om de muis te anesthetiseren. Supplement met intramusculaire injectie van atropine (0,05 mg/kg). Houd de muis in een donkere rustige plek tot volledige anesthesie van kracht.
- Craniotomie
- Houd de huid op de hoofdhuid met een tang, snijd en verwijder de huid met een paar chirurgische schaar. Snijd voldoende huid om de bregma-en Lambda-markeringen op de hoofdhuid bloot te leggen. Houd het blootgestelde gebied droog.
- Pas de geklemde schedel van de muis aan zodat de bregma-en Lambda-punten op een horizontaal niveau van gelijke hoogte kunnen worden uitgelijnd. Vermijd kantelen van het hoofd in de voorste-posterieure positie of de mediale laterale positie.
- Markeer de punten die overeenkomen met de hippocampal regio met behulp van een Vernier remklauw. Gebruik de muis hersenen in een stereotactische coördinaat boek als referentie om te helpen bij het bepalen van de exacte coördinaten.
Opmerking: de locatie om te markeren voor incisie voor de Hippocampus zijn 1 mm x 3 mm op de middellijn aangeduid als anterior-posterior (AP) met behulp van de bregma als referentiepunt, en 3 mm x 3 mm loodrecht op de middenlijn (ML) om de punten op de middenlijn te verbinden. De stereotactische coördinaten worden gegeven als (AP: 1, 3 en ML: 3, 3). - Maak een incisie in de schedel boven de rugstreek van de Hippocampus langs de gemarkeerde punten met behulp van een scalpel of High-speedboor tijdens het observeren onder een microscoop.
Opmerking: na incisie moet een rechthoekige opening met een afmeting van 2 mm x 3 mm worden verkregen. Houd het blootgestelde gebied schoon om letsel aan de hersenen te voorkomen. - Verwijder voorzichtig de losse schedel met een tang om de dura mater bloot te leggen en gebruik een spuit of druppelaar om zachtjes fysiologische zoutoplossing toe te passen om het oppervlak vochtig te houden.
- Verwijder de dura mater voorzichtig met de naald of scherpe puntige punt Tang.
Opmerking: Zorg ervoor dat u geen schade aan het hersenweefsel veroorzaakt tijdens craniotomie. Dit zal leiden tot de zwelling van de hersenen en zal de resultaten beïnvloeden. - Houd het blootgestelde hersenweefsel vochtig door fysiologische zoutoplossing of inerte olie toe te passen met een druppelaar of spuit.
- In vivo opname
- Fixeer en Positioneer de stimulatie-en opname-elektrode stevig in de stereotactische houder. Pas het stereotactische instrument aan volgens de positie van de corresponderende AP en ML coördinaten voor de stimulatie-en opname elektroden boven de CA1 dorsale Hippocampus.
Opmerking: gebruik de muis hersenen in stereotactische coördinaten als een gids bij het lokaliseren van de coördinaten voor de dorsale longitudinale CA1 hippocampal regio. Bijvoorbeeld, een stereotactische coördinaat voor de CA1 hippocampal regio zal zijn (AP 1,5, ML 1,0) voor de opname-elektrode en (AP 1,7, ML 1,5) voor de stimulatie-elektrode. - Lokaliseer de stimulerende elektrode laterale aan de opname-elektrode in lengterichting.
Opmerking: Zorg ervoor dat zowel stimulatie-als opname elektroden schoon zijn voor gebruik. Dit voorkomt de invoering van ruis tijdens het opnemen. - Voor opnames gebruikt u meerkanaals elektroden. Zoek eerst de stereotactische coördinaten voor de regio CA1 hippocampal met behulp van het eerste kanaal. Plaats de overblijvende elektroden zodanig dat de hoek van de stimulatie en de opname elektroden zich in het bereik van 30 ° tot 60 ° ten opzichte van de middenlijn van bregma punt bevinden.
Opmerking: deze hoek komt overeen met de longitudinale oriëntatie van de regio CA1 hippocampal. - Als controle, zoek de opname-elektrode boven de CA1-regio en de stimulatie elektrode boven de CA3 regio van de dorsale Hippocampus. Bijvoorbeeld, met behulp van de muis hersenen in stereotactische coördinaten als een gids, een stereotactische coördinaat voor CA1-CA3 hippocampal regio zal zijn (AP 1,8, ML 1,0) voor de opname-elektrode en (AP 1,5, ML 1,5) voor de stimulatie-elektrode.
Opmerking: deze stap is een alternatieve controle en moet worden uitgevoerd in een afzonderlijk experiment. - Plaats de referentie-elektrode in een distale deel van het blootgestelde hersengebied of onder de huid van de muis.
- Schakel het opnamesysteem in.
- Open de software voor het opnemen en het verzamelen van gegevens.
Opmerking: verschillende laboratoria hebben hun voorkeurs software voor opname en data-acquisitie. - Observeer onder een Microscoop, verlaag de opname-en stimulatie elektroden langzaam met behulp van de micromanipulator totdat het gewoon het oppervlak van de hersenen aanraakt. Markeer het punt als het nulpunt om te beginnen met het berekenen van de nauwkeurige diepte naar de regio hippocampal.
Opmerking: de micromanipulator kan worden gebruikt voor het bewaken van de diepte waarop de elektrode op een bepaald moment wordt ingebracht. Observeer een toename van de impedantie net wanneer de elektrode het hersen oppervlak aanraakt. - Langzaam verlagen van de elektroden aan de geschatte diepte die overeenkomt met de gekozen stereotactische coördinaten voor CA1 Hippocampus.
Opmerking: gebruik de muis hersenen in stereotactische coördinaten als een gids om de geschatte diepte die overeenkomt met de gekozen stereotactische coördinaten te verkrijgen. - Geef stimulatie (100 μs duur, herhaald op 30 s intervallen) en pas de elektrode diepte aan in stappen van 50 μm of minder totdat een stabiel Evoked veld excitatory postsynaptisch potential (fEPSP) wordt waargenomen.
Opmerking: een stimulans van 20 μA is meestal voldoende om een waarneembare reactie op te roepen. - Zorg ervoor dat een stabiele fEPSP is opgeroepen door de intensiteit van de stimulus te variëren. Een opmerkelijke toename van de helling of amplitude van de fEPSP moet worden waargenomen bij elke verhoogde stimulus-intensiteit. Dit wordt aangeduid als de input-output curve. Creëer een input-output (I-O) curve om de maximale stimulus intensiteit te detecteren waarbij de helling van de Evoked fEPSP niet meer toeneemt (Figuur 6).
Opmerking: Gooi gegevens weg en verander de elektrodepositie als de vezel volley verdwijnt tijdens het experiment. - Gebruik de input-output curve om de basis intensiteit in te stellen op 40-50% van het maximum. Gebruik de bijbehorende stimulus-intensiteit voor het opnemen van de baseline.
- Noteer het lokale veld potentieel als een basislijn voor 20-30 min.
- Gebruik dezelfde input-output curve om de stimulus intensiteit in te stellen voor het oproepen van hoogfrequente stimulatie (HFS) of tetanus tot 75% van de maximale intensiteit. Als alternatief, bij het induceren van de lange termijn depressie, handhaven dezelfde stimulans intensiteit gebruikt voor het vastleggen van de baseline bij het oproepen van lage frequentie stimulatie (LFS).
- Breng een tetanische stimulatie van 100 Hz pulsen 4 keer met een 10 s interval voor het opwekken van LTP.
Opmerking: gebruik dit protocol alleen wanneer u werkt op een lange termijn potentiëring experiment. - Breng een lage frequentie stimulatie van 5 Hz (900 stimuli gedurende 3 min), 1 Hz LFS (900 stimuli gedurende 15 min), of 1 Hz gepaarde puls (50 MS gepaarde puls interval, 900 paren van stimuli gedurende 15 min) om LTD te induceren volgens reeds gevestigde protocollen.
Opmerking: gebruik deze protocollen alleen wanneer u werkt op een lange termijn depressie experiment. - Noteer het lokale veld potentieel voor 1 uur na HFS of LFS, als alternatief.
- Exporteer gegevens en analyseer met behulp van de software.
- Controleer de positie van de opname-en stimulatie elektrode door een stimulatie van 10 μA stroom gedurende 30 s te geven om de opgenomen gebieden te laesie. Transcardially parfumeer de muis met 4% Paraformaldehyde en oogst de hersenen voor snijden en kleuring met cresyl Violet volgens.
- Euthanize Mouse door cervicale dislocatie of injectie van dodelijke verdoving dosering na experiment.
- Fixeer en Positioneer de stimulatie-en opname-elektrode stevig in de stereotactische houder. Pas het stereotactische instrument aan volgens de positie van de corresponderende AP en ML coördinaten voor de stimulatie-en opname elektroden boven de CA1 dorsale Hippocampus.
2. opname in vitro veld
- Voorbereiding van zuurstofrijk snijden en kunstmatige cerebrospinale vloeistof (acsf) oplossingen
- Voeg voor 2 L snij oplossing ongeveer 1 L dubbel gedestilleerd water toe in een volumetrische kolf en roer krachtig op een roerder plaat.
- Voeg de volgende snijden Solution componenten (in mm): 87,0 NaCl, 2,5 KCl, 1,3 Nah2po4, 25,0 NaHCO3, 25,0 glucose, 75,0 sucrose, 7,0 MgCl2. 6h2o en 0,5 CACL2∙ 2H2o (tabel 1).
Opmerking: als alternatief kunnen MgCl2∙ 6h2o en CACL2∙ 2H2o in dit stadium worden uitgesloten en later in een gebruiksklaar volume worden toegevoegd. - Top tot 2 L met dubbel gedestilleerd water, terwijl u krachtig roeren.
- Voeg voor 2 L ACSF ongeveer 1 L dubbel gedestilleerd water toe in een volumetrische kolf en roer krachtig op een roerder plaat.
- Voeg de volgende componenten van de ACSF-oplossing toe (in mM): 125,0 NaCl, 2,5 KCl, 1,3 NaH2po4, 25,0 NaHCO3, 25 glucose, 1,0 MgCl2∙ 6h2o en 2,0 CACL2∙ 2H2o (tabel 1).
Opmerking: als alternatief kan MgCl2. 6h2o en CACL2∙ 2H2o in dit stadium worden uitgesloten en later in een gebruiksklaar volume worden toegevoegd. - Top tot 2 L met dubbel gedestilleerd water, terwijl u krachtig roeren.
- Opzet en Brain snijden
- Giet 400 ml reeds bereide snijden oplossing in een afzonderlijke kolf en oxygenaat (95% O2/5% Co2) gedurende ongeveer 20 min.
- Bewaar de rest van de 1,6 L-oplossing in een koelkast van 4 °C. Bewaar de oplossing tot 1 week waarna het moet worden weggegooid als het niet wordt gebruikt om schimmelgroei te voorkomen.
- Giet 200 ml van de zuurstofarm snijden oplossing in de kolf, dek af met Parafilm en breng gedurende ongeveer 20 minuten over in een vriezer van a-80 °c om een slush te maken.
- Giet de resterende 200 ml van de snijden oplossing in een brain slice Holding kamer en bewaar in een water bad van 32 °c met continu borrelen.
- Maak de Bank klaar voor snijden. Plaats papieren handdoeken naar beneden en chirurgische gereedschappen bovenop de Bank. Regel de chirurgische gereedschappen in volgorde van gebruik om een snel en efficiënt proces te vergemakkelijken (Figuur 7).
- Haal de gekoelde snijden oplossing uit de vriezer en giet ongeveer 50 ml in een bekerglas. Giet ongeveer 10 mL in een Petri schaaltje met filtreerpapier om het te bevochtigen. Plaats ze op ijs door het dissectie gebied.
- Giet de rest van de Slushed snijden oplossing in de snij kamer en bevestig deze op de vibratome.
- Anesthetiseer de muis met Isofluraan met behulp van richtlijnen en verordeningen inzake Dierverzorging en het gebruik van laboratorium van National Institute of Health, en de goedgekeurde methoden van institutionele dieren gebruik en zorg Comité van de stad Universiteit van Hong Kong en Incheon National Universiteit.
- Ontharde de verdoofd Mouse met een schaar en plaats het hoofd op tissuepapier. Snijd de huid die de schedel van de muis bedekt en snijd door de cutane spieren met een schaar. Snijd de schedel platen langs de middenlijn naar het occipitale bot met behulp van een chirurgische schaar.
- Open de schedel met botte tang om de hersenen bloot te leggen. Schep de hersenen voorzichtig uit met een spatel en plaats in de gekoelde snijden oplossing in het bekerglas. Wacht ongeveer 30 sec.
- Neem de hersenen met behulp van de lepel en plaats deze voorzichtig op het eerder bevochtigde filterpapier in de Petri schaal.
- Scheid de twee hersenhelften langs de middenlijn met een scalpel blad. Isoleer de Hippocampus door deze voorzichtig los te laten van de cortex met een spatel en plaats deze voorzichtig op het bevochtigde filtreerpapier. Knip de ventrikel septum en temporele einde van de geïsoleerde Hippocampus met behulp van de scalpel.
- Pak de geïsoleerde Hippocampus met behulp van een stompe spatel en borstel. DEP de spatel voorzichtig op een tissuepapier om overtollig water te verwijderen.
- Breng een kleine hoeveelheid lijm aan op de snijplaat van de vibratome.
- Voor een longitudinale Ca1 hippocampal slice, bevestig de CA3 regio van de Hippocampus aan de snijden plaat met de lijm. Snel maar voorzichtig plaatsen in de snijden kamer van de vibratome met de gekoelde zuurstofhoudende snijden oplossing.
- Voor de dwarsdoorsnede die als controle zal dienen, bevestig het ventrale uiteinde van de Hippocampus aan de snijplaat van de vibratome. Snel maar voorzichtig plaatsen in de snijden kamer met de gekoelde zuurstof oplossing.
Opmerking: deze stap is een alternatief voor de stap hierboven en moet afzonderlijk worden uitgevoerd. - Plaats de Blade hoek op 90 °. Stel de trillatome-parameters in op een snelheid van 0,05 mm/s, een amplitude van 1,20 mm en een snijdikte van 400 μm.
- Snijd de bijgevoegde Hippocampus met de vibratome.
Opmerking: een goede longitudinale Ca1 hippocampal brain slice zal hebben een laag van Ca1 en 2 lagen van getand gyrus. Er kunnen maximaal 2 goede hippocampal schijfjes worden verkregen. Als alternatief, een dwarse hippocampal hersen segment zal de getand gyrus, CA3 en Ca1 regio's intact. - Breng de hersen schijfjes in longitudinale hippocampal van de vibratome met een pipet over en inbroed deze in de kamer van de hersen slice in het waterbad.
- Inincubatie van plakjes in het waterbad gedurende 20 minuten bij een temperatuur van 32 °C en tot kamertemperatuur brengen gedurende 30 minuten herstel.
Opmerking: als alternatief u de hersen slice overbrengen wanneer u uit het waterbad komt en deze voorzichtig in de opname kamer plaatsen met stromende zuurhoudende ACSF bij een temperatuur van 32 °C gedurende 30 minuten herstel. - Terwijl u in het waterbad inbroed, giet dan 400 mL ACSF-oplossing in een afzonderlijke kolf en oxygenaat (95% O2/5% Co2) gedurende ongeveer 20-30 min voordat de hersen slice in de opname kamer wordt overgebracht. De ACSF continu in de opname kamer met een snelheid van 2 mL/min.
- Zet de temperatuurregelaar aan om de vloeiende ACSF tot 32 °C te verwarmen.
- Bewaar de rest van de 1,6 L-oplossing in een koelkast van 4 °C. Bewaar de oplossing tot een week waarna het moet worden weggegooid als het niet wordt gebruikt om schimmelgroei te voorkomen.
- In-vitro opname
- Stel een opname platform in door alle benodigde hardware in te schakelen.
- Breng het hersen segment over van de segment kamer in de opname kamer. Pas de positie van de hersen slice aan met de Blunt Tang en houd hem op zijn plaats met een harp. Laat de ACSF minstens 20 minuten draaien. Hierdoor kan de hersen slice stabiel zijn voordat de opname wordt opgenomen.
- Vul de opname pipet met ACSF als een interne oplossing.
- Controleer de weerstand van de opname pipet met de aangewezen software. De opname pipet weerstand moet binnen het bereik van 3-5 MΩ liggen.
- Schakel de software in voor het verzamelen van gegevens. Deze software moet vergelijkbare functies hebben die het verzamelen van gegevens op een vergelijkbare manier mogelijk maken als de in vivo-opnames die eerder zijn weergegeven.
- Bevestig de opname en de stimulatie elektroden stevig in de stereotactische instrument houder. Plaats de referentie-elektrode in de ACSF in de opname kamer.
- Plaats voor longitudinale segmenten de stimulatie-en opname-elektrode in de stratum Oriens (S.O.). Houd de afstand tussen de elektroden tot ongeveer 300 tot 500 μm. plaats de stimulatie elektrode op de septale of temporale kant van de hersen slice en neem deze op uit dezelfde laag (Figuur 8).
- U ook de stimulatie-en opname-elektrode in het stratum radiatum (S.R.) positioneren. Plaats de stimulatie elektrode op de septale of temporale kant van de hersen slice.
- Voor dwarse segmenten als controle, Positioneer de stimulerende elektrode op de CA3 (Schaffer collateral Pathway) regio en de opname-elektrode op de CA1-regio (Figuur 9).
Opmerking: dit is een alternatieve controlestap en moet worden uitgevoerd in een afzonderlijk experiment. - Schakel de geïsoleerde stimulus generator en geven stimulatie (100 μs duur, herhaald op 30 s intervallen). Pas de opname elektrode diepte en/of positie aan tot een stabiel opgeroepen excitatory postsynaptisch Field potentiaal wordt waargenomen.
- Zorg ervoor dat een stabiele fEPSP is opgeroepen door de intensiteit van de stimulus te variëren. Een opmerkelijke verandering in de helling van de fEPSP moet worden waargenomen bij elke verandering van de intensiteit van de stimulus. Dit wordt aangeduid als de input-output curve. Maak een I-O-curve (input-output) om de maximale stimulus-intensiteit te detecteren waarbij de helling van de FEPSP niet meer toeneemt (Figuur 6).
Opmerking: Gooi gegevens weg en verander de elektrodepositie als de vezel volley verdwijnt tijdens het experiment. - Gebruik de input-output curve om de stimulus-intensiteit in te stellen voor Baseline Recording en voor het oproepen van hoogfrequente stimulatie (HFS) of tetanus tot 30-40% van het maximale opgeroepen fEPSP.
- U ook voor experimenten met LTD, de input-output curve gebruiken om de basislijn intensiteit in te stellen voor basislijn opname en voor het oproepen van lage frequentie stimulatie (LFS) tot 70% van het maximale opgeroepen fEPSP.
- Noteer het lokale veld potentieel als de basislijn voor 20-30 min.
- Breng HFS van 100 Hz pulsen tweemaal met een 30 s interval aan om LTP te induceren.
- Als alternatief, voor LTD experimenten, toepassen lage frequentie stimulatie van 5 Hz (900 stimuli gedurende 3 min) of 1 Hz LFS (900 stimuli gedurende 15 min) of 1 Hz gepaarde puls (50 MS gepaarde puls interval, 900 paren van stimuli gedurende 15 min) te induceren LTD volgens reeds vastgesteld protocol.
- Noteer het lokale veld potentieel voor 1 uur na HFS of LFS.
- Exporteer gegevens en analyseer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We verkenden op lange termijn synaptische plasticiteit van longitudinale Ca1 piramidale neuronen van de Hippocampus met behulp van extracellulaire veldopnames zowel in vivo en in vitro. LTP en LTD zijn facetten van lange termijn synaptische plasticiteit die zijn aangetoond in de dwarse as van de Hippocampus om unidirectioneel.
We toonden hier dat het gebruik van longitudinale hippocampal hersenen plakjes, er is LTP in de as van de CA1 lengteas van de hippocampus. We bereidden langsschijfjes van de Hippocampus langs de septotemporale as, die loodrecht staat op de dwarse segmenten (Figuur 1). Met behulp van opnames uit de CA1-regio van de hippocampus, we toonden de aanwezigheid van LTP dat was niet richting specifiek. Er waren geen statistisch significante verschillen in de opnames van de septale of temporale (Figuur 2) zijde van de hippocampal hersen segment. We toonden ook de aanwezigheid van LTP die niet laag specifiek was; Zo toonden opnames van zowel stratum radiatum als stratum Oriens (Figuur 2) met succes de ltp in de longitudinale hersen slice. We gebruikten D-AP5, een NMDAR-antagonist om aan te tonen dat de geïnduceerde LTP afhankelijk was van NMDA-receptoren (Figuur 3). Wat er in vitro gebeurt, weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs in vivo condities, dus onderzochten we LTP in vivo. Figuur 4 a toont een schematisch diagram van de stimulatie-en opname-elektrode gepositioneerd in de rugzijde Hippocampus langs de lengteas van Ca1 regio in vivo. De positie van de elektroden die voor de opname en stimulatie worden gebruikt, werd geverifieerd door laesie markeringen en kristalviolet kleuring (Figuur 4a). We toonden de aanwezigheid van LTP in vivo in de longitudinale CA1-regio (Figuur 4b).
Met behulp van reeds gevestigde protocollen voor inducerende Ltd, we niet in geslaagd om te induceren Ltd zowel in vivo en in vitro (Figuur 5).
Figuur 1 . Een schematische tekening van dwarse en longitudinale hippocampal hersen plakjes. Dit cijfer is aangepast en aangepast van Sun et al. 201821. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 . LTP in langsschijfjes. Synaptische responsen op S.R. (a) of S.O. (b) in longitudinale plakjes zijn versterkt direct na tetanus stimulatie met zowel temporale als septale inputs (S.R./temporale (n = 12, c), S.R./septaal (n = 12, c), S.O./temporale (n = 10, d), S.O./septaal (n = 9, d).
De n staat voor het aantal sneetjes. Foutbalken representeren SE. Dit cijfer is aangepast en aangepast van Sun et al. 201821. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 . NMDAR-afhankelijke LTP in langssegmenten. (a,b) Ltp-inductie in temporele en septale richting wordt geblokkeerd door 50 μM D-AP5 (temporale, n = 6, a) (ventrikel septum, n = 5, b). (c,d) LTP-inductie in temporale en septale richting wordt ook geblokkeerd door D-AP5. De n staat voor plakjes. Foutbalken representeren SE. Dit cijfer is aangepast en aangepast van Sun et al. 201821. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 . In vivo LTP in het interlamellar-netwerk. a) eenschematische tekening van de opname-en stimulatie elektroden in verdoofd dieren. De loci van opname (op de ventrikel septum kant van Ca1) en stimulerende elektroden (op de temporele kant van Ca1) werden geïdentificeerd door laesie merken. (b) ltp wordt geïnduceerd in de interlamellaire verbinding door een hoge frequentie stimulatie van 100 Hz (HFS) (n = 10 muizen). Kleur sporen: voor (zwart) en na (rood) HFS. Foutbalken representeren SE. Dit cijfer is aangepast en aangepast van Sun et al. 201821. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 . Afwezigheid van in vivo en in vitro LTD in het Interlamellar CA1-netwerk. a) 1 Hz-PP lfs induceert niet in vivo Ltd. (b) 1 Hz PP-ltp, (c) 5 Hz lfs, en (d) 1 Hz lfs produceren geen Ltd op de temporale of septale zijden van de longitudinale hersen slice. terwijl Ltd wordt geïnduceerd door 1 Hz PP-lfs in dwars segmenten: temporale (n = 8), ventrikel septum (n = 11) en dwarse (n = 6) met 1 Hz PP-lfs; temporale (n = 3) en septaal (n = 3) met 5 Hz LFS; temporale (n = 3) en ventrikel septum (n = 3) met 1 Hz lfs. De n staat voor plakjes. Foutbalken representeren SE. Dit cijfer is aangepast en aangepast van Sun et al. 201821. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6 . Input-output curve presenteren fEPSP helling in reactie op de verhoging van de stimulus input in hippocampal hersenen slice. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7 . Chirurgische hulpmiddelen gebruikt voor hippocampal isolatie tijdens in vitro Brain slicing. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8 . Een longitudinaal hersen segment klaar voor opname. Stimulatie elektrode en de opname pipet worden in het stratum radiatum ingevoegd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 9 . Een dwarse hippocampal brain slice klaar voor opname. Stimulatie elektrode wordt ingevoegd bij Schaffer collateral CA3 Region en opname pippette wordt ingevoegd in de CA1-regio. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Samengestelde | Slicing Solution (mM) | ACSF (mM) |
| CaCl2. 2H2O | 0,5 | 2 |
| Glucose | 25 | 25 |
| Kcl | 2,5 | 2,5 |
| MgCl2. 6h2O | 7 | 1 |
| Nacl | 87 | 125 |
| NaH2po4 | 1,3 | 1,3 |
| NaHCO3 | 25 | 25 |
| Sacharose | 75 |
Tabel 1: concentraties van verbindingen in hersenen slice en kunstmatige cerebrospinale vloeistof oplossingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol demonstreert de methode voor het opwekken van lange termijn synaptische plasticiteit in vivo en van hersen sneden in de longitudinale CA1-CA1-as van de Hippocampus in vitro. De stappen die worden beschreven geven genoeg Details voor een experiteur om LTP en LTD in een longitudinale hippocampal CA1-CA1-verbinding te onderzoeken. Praktijk is nodig om de vaardigheden die nodig zijn om succesvol te registreren veld excitatory potentials scherpen.
Naast de behoefte aan praktijk, zijn er verschillende kritische stappen die essentieel zijn voor het verkrijgen van goede resultaten. Ten eerste, het werd eerder aangetoond dat de hoek waar de hersenen segmenten werden gemaakt kan ofwel afkappen of behouden van de longitudinale projecties van de piramidevormige neuronen in de CA1-CA1-regio van de Hippocampus16. De piramidevormige neuronen projecteer van de transversale neuronen onder een hoek die bijna loodrecht is. Als de CA1 neuronen propageren in verschillende hoeken binnen de hippocampus, de longitudinale verbinding tussen hen legt langs de dorsoventral as van de hippocampus. Dus, voor in vitro opname, de experimenteerder moet dit in gedachten houden om nauwkeurig te richten de CA1-CA1 hippocampal neuronen langs de lengteas door het snijden van de geïsoleerde Hippocampus weefsel langs de dorsale-ventrale as. Ook voor in vivo opnames bepaalt de hoek waarbij de stimulatie en de opname elektroden worden gepositioneerd of de verkregen resultaten representatief zijn voor de lengteas of een mengsel van zowel de dwars-als de lengteas. Verder onderzoek met behulp van CRISPR Cas9 kan worden gedaan om te bevestigen of de Evoked reactie is uitsluitend van de CA1-regio, omdat het een mengsel van reacties van zowel de CA1 en de CA3 regio's zou kunnen zijn.
Ten tweede, voor in vitro experimenten moet de experimentant ervoor zorgen dat de Brain snijden Solution, acsf, werkbank en alle apparatuur of instrumenten die in contact komen met de hersen slice vrij zijn van verontreinigingen. Elke vorm van besmetting zal leiden tot de verslechtering van de integriteit of de dood van de hersen slice. Het onderhouden van een schoon elektrode oppervlak zorgt voor goede en stabiele opnames voor zowel in vitro als in vivo experimenten.
We hebben laten zien dat het in de lengte van hippocampal CA1 netwerk NMDAR afhankelijke LTPs vertoont, maar niet LTDs. Het trisynaptische circuit presenteert echter zowel ltp als Ltd22,23. Dit impliceert dat het longitudinale CA1-netwerk en de Tri-synaptic circuits unieke kenmerken hebben. Ons protocol maakt gebruik van alleen elektrofysiologische opnames en is daarom beperkt in het vinden van het verschil tussen deze twee netwerken.
De zoektocht naar een remedie tegen hersenziekten zoals schizofrenie gaat door. Daling of misvorming van Ca1 hippocampal subregio's zijn verbonden met een aantal schizofreen symptomen24,25. De toepassing van ons protocol, hoewel Basic, heeft een unieke synaptische vermogen van de CA1 longitudinale hippocampal subregio aan het licht gebracht. Deze kennis is nuttig bij het ontwerpen van experimenten die deze debiliterende hersenziekte verder kunnen onderzoeken langs de as-as van de hippocampus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Incheon National University (International Cooperative) Research Grant. We willen MS. gona Choi bedanken voor het helpen bij het verzamelen van gegevens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atropine Sulphate salt monohydrate, ≥97% (TLC), crystalline | Sigma-Aldrich | 5908-99-6 | Stored in Dessicator |
| Axon Digidata 1550B | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| Clampex 10.7 | |||
| D-(+)-Glucose ≥ 99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Eyegel | Dechra | ||
| Isoflurane | RWD Life Sciences | R510-22 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, BioXtra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
| Matrix electrodes, Tungsten | FHC | 18305 | |
| Multiclamp 700B Amplifier | |||
| Potassium chloride, BioXtra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous ≥99% | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | Stored in Dessicator |
| Pump | Longer precision pump Co., Ltd | T-S113&JY10-14 | |
| Silicone oil | Sigma-Aldrich | 63148-62-9 | |
| Sodium Bicarbonate, BioXtra, 99.5-100.5% | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | |
| Sodium Chloride, BioXtra, ≥99.5% (AT) | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic, powder | Sigma-Aldrich | 7558-80-7 | |
| Sucrose, ≥ 99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | 57-50-1 | |
| Temperature controller | Warner Instruments | TC-324C | |
| Tungsten microelectrodes | FHC | 20843 | |
| Urethane, ≥99% | Sigma-Aldrich | 51-79-6 | |
| Vibratome | Leica | VT-1200S | |
| Water bath | Grant Instruments | SAP12 |
References
- Levy, W. B. A sequence predicting CA3 is a flexible associator that learns and uses context to solve hippocampal-like tasks. Hippocampus. 6 (6), 579-590 (1996).
- Eldridge, L. L., Knowlton, B. J., Furmanski, C. S., Bookheimer, S. Y., Engel, S. A. Remembering episodes: A selective role for the hippocampus during retrieval. Nature Neuroscience. 3 (11), 1149-1152 (2000).
- Sullivan Giovanello, K., Schnyer, D. M., Verfaellie, M. A critical role for the anterior hippocampus in relational memory: evidence from an fMRI study comparing associative and item recognition. Hippocampus. 14 (1), 5-8 (2004).
- Andersen, P., Bland, B., Dudar, J. D.
- Andersen, P., Bliss, T. V. P., Skrede, K. K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways. Experimental Brain Research. 13 (2), 222-238 (1971).
- Sloviter, R., Lømo, T. Updating the Lamellar Hypothesis of Hippocampal Organization. Frontiers in Neural Circuits. 6 (102), (2012).
- Ishizuka, N., Weber, J., Amaral, D. G. Organization of intrahippocampal projections originating from CA3 pyramidal cells in the rat. Journal of Comparative Neurology. 295 (4), 580-623 (1990).
- Tamamaki, N., Nojyo, Y. Crossing fiber arrays in the rat hippocampus as demonstrated by three-dimensional reconstruction. Journal of Comparative Neurology. 303 (3), 435-442 (1991).
- Swanson, L., Wyss, J., Cowan, W. An autoradiographic study of the organization of intrahippocampal association pathways in the rat. Journal of Comparative Neurology. 181 (4), 681-715 (1978).
- Rebola, N., Carta, M., Mulle, C. Operation and plasticity of hippocampal CA3 circuits: implications for memory encoding. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 208 (2017).
- Papaleonidopoulos, V., Trompoukis, G., Koutsoumpa, A., Papatheodoropoulos, C. A gradient of frequency-dependent synaptic properties along the longitudinal hippocampal axis. BMC Neuroscience. 18 (1), 79 (2017).
- Hampson, R. E., Simeral, J. D., Deadwyler, S. A. Distribution of spatial and nonspatial information in dorsal hippocampus. Nature. 402, 610 (1999).
- Umeoka, S. C., Lüders, H. O., Turnbull, J. P., Koubeissi, M. Z., Maciunas, R. J. Requirement of longitudinal synchrony of epileptiform discharges in the hippocampus for seizure generation: a pilot study. Journal of Neurosurgery. 116 (3), 513-524 (2012).
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65, (2010).
- Milior, G., et al. Electrophysiological properties of CA1 pyramidal neurons along the longitudinal axis of the mouse hippocampus. Scientific Reports. 6, (2016).
- Yang, S., et al.
- Tsien, J. Z., Huerta, P. T., Tonegawa, S. The Essential Role of Hippocampal CA1 NMDA Receptor–Dependent Synaptic Plasticity in Spatial Memory. Cell. 87 (7), 1327-1338 (1996).
- Bliss, T., Collingridge, G. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361, 31-39 (1993).
- Roman, F., Staubli, U., Lynch, G. Evidence for synaptic potentiation in a cortical network during learning. Brain Research. 418 (2), 221-226 (1987).
- McNaughton, B., Barnes, C., Rao, G., Baldwin, J., Rasmussen, M. Long-term enhancement of hippocampal synaptic transmission and the acquisition of spatial information. Journal of Neuroscience. 6 (2), 563-571 (1986).
- Sun, D. -g, et al. Long term potentiation, but not depression, in interlamellar hippocampus CA1. Scientific Reports. 8 (1), 5187 (2018).
- Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).
- Milner, A. J., Cummings, D. M., Spencer, J. P., Murphy, K. P. Bi-directional plasticity and age-dependent long-term depression at mouse CA3-CA1 hippocampal synapses. Neuroscience Letters. 367 (1), 1-5 (2004).
- Bogerts, B., et al. Hippocampal CA1 deformity is related to symptom severity and antipsychotic dosage in schizophrenia. Brain. 136 (3), 804-814 (2013).
- Ho, N. F., et al. Progressive Decline in Hippocampal CA1 Volume in Individuals at Ultra-High-Risk for Psychosis Who Do Not Remit: Findings from the Longitudinal Youth at Risk Study. Neuropsychopharmacology. 42, 1361 (2017).
