Neuroscience

इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल फील्ड रिकॉर्डिंग द्वारा इंटरलैमेलर हिप्पोकैम्पस सीए 1 में लंबी अवधि के Synaptic प्लास्टिक की जांच

Published: August 11, 2019 doi: 10.3791/59879

Hannnah Tetteh*¹, Jihwan Lee*¹, Jinho Lee², Jae Geun Kim³, Sunggu Yang²

¹Department of Biomedical Sciences, City University of Hong Kong, ²Department of Nano-Bioengineering, Incheon National University, ³Division of Life Sciences, College of Life Sciences and Bioengineering, Incheon National University

* These authors contributed equally

Summary

हम रिकॉर्डिंग और उत्तेजना इलेक्ट्रोड में अनुदैर्घ्य हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस और longitudinally तैनात रिकॉर्डिंग और उत्तेजना इलेक्ट्रोड vivo में पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस में अतिरिक्त कोशिकीय पदों की क्षमता पैदा करने के लिए और प्रदर्शन किया दीर्घकालिक synaptic प्लास्टिक के साथ अनुदैर्घ्य interlamellar CA1.

Abstract

हिप्पोकैम्पस में synaptic प्लास्टिक के अध्ययन CA3-CA1 पटलिकीय नेटवर्क के उपयोग पर ध्यान केंद्रित किया है. अनुदैर्घ्य interlamellar CA1-CA1 नेटवर्क पर कम ध्यान दिया गया है। हाल ही में हालांकि, CA1-CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स के बीच एक संसाहन संबंध दिखाया गया है. इसलिए, वहाँ की जांच करने की जरूरत है कि क्या हिप्पोकैम्पस के अनुदैर्घ्य interlamellar CA1-CA1 नेटवर्क synaptic plasticity का समर्थन करता है.

हम दोनों विवो में और इन विट्रो में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल क्षेत्र रिकॉर्डिंग का उपयोग कर interlamellar हिप्पोकैम्पस CA1 नेटवर्क में लंबी अवधि के synaptic प्लास्टिक की उपस्थिति या अनुपस्थिति की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल बनाया गया है। विवो extracellular क्षेत्र रिकॉर्डिंग में के लिए, रिकॉर्डिंग और उत्तेजना इलेक्ट्रोड एक अनुदैर्घ्य कोण पर पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस के एक पट-टेम्पोरल अक्ष में रखा गया था, क्षेत्र उत्तेजक पदों ynaptic क्षमता पैदा करने के लिए. इन विट्रो एक्स्ट्रासेलुलर फील्ड रिकॉर्डिंग के लिए, हिप्पोकैम्पस अनुदैर्घ्य स्लाइस को पट-टेम्पोरल तल के समानांतर काट दिया गया था। रेकॉर्डिंग और उत्तेजना इलेक्ट्रोड को अनुदैर्घ्य अक्ष के साथ हिप्पोकैम्पस के स्तर ओरियन्स (एस.ओ)और स्तर रेडिएटम (एस.आर.) में रखा गया था। यह हमें उत्तेजक पदों की दिशात्मक और परत विशिष्टता की जांच करने के लिए सक्षम किया गया. पहले से ही स्थापित प्रोटोकॉल के लिए लंबी अवधि के potentiation (LTP) और दीर्घकालिक अवसाद (LTD) दोनों विवो में और इन विट्रो में प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया. हमारे परिणामों का प्रदर्शन किया है कि अनुदैर्घ्य interlamellar CA1 नेटवर्क का समर्थन करता है एन-मेथिल-डी-एस्पार्टेट (NMDA) रिसेप्टर पर निर्भर दीर्घकालिक potentiation (LTP) कोई दिशात्मक या परत विशिष्टता के साथ. तथापि, अनुप्रस्थ पटलिकीय नेटवर्क के विपरीत अंतर-लामेलर नेटवर्क किसी भी महत्वपूर्ण दीर्घकालिक अवसाद (एलटीडी) के साथ उपस्थित नहीं था।

Introduction

हिप्पोकैम्पस का व्यापक रूप से संज्ञानात्मक अध्ययन¹^,²^,³में प्रयोग किया जाता रहा है . अनुप्रस्थ अक्ष में हिप्पोकैम्पस पटलीय नेटवर्क त्रि-सिनैप्टिक परिपथ का रूप ले जाता है जो दंतिका gyrus, CA3, और CA1 क्षेत्रों से बना है। पटलीय नेटवर्क को समांतर तथा स्वतंत्र एकक⁴^,⁵माना जाता है . इस लेमेलर दृष्टिकोण दोनों विवो में और हिप्पोकैम्पस के इन विट्रो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन के लिए अनुप्रस्थ अभिविन्यास और अनुप्रस्थ स्लाइस के उपयोग को प्रभावित किया है। उभरते हुए अनुसंधान के प्रकाश में, लेमेलर परिकल्पना⁶ reevaluated किया जा रहा है और भी हिप्पोकैम्पस के interlamellar नेटवर्क पर ध्यान दिया जा रहा है. हिप्पोकैम्पस इंटरलामेलर नेटवर्क के संबंध में, CA3 क्षेत्र लंबे समय से 7 ,⁸^,⁹^,¹⁰की^जांचकी गई है , हालांकि अनुदैर्घ्य CA1 हिप्पोकैम्पस क्षेत्र प्राप्त हुआ है हाल ही में जब तक अपेक्षाकृत कम ध्यान. के संबंध में CA1 interlamellar नेटवर्क के संबंध में, चूहों के dorsoventral अनुदैर्घ्य हिप्पोकैम्पस CA1 अक्ष के साथ अल्पकालिक synaptic गुण¹¹भिन्न करने के लिए दिखाया गया है. इसके अलावा, चरण और स्थान का जवाब देने वाले हिप्पोकैम्पस कोशिकाओं के गुच्छों को चूहों में हिप्पोकैम्पस के अनुदैर्घ्य अक्ष के साथ व्यवस्थित रूप से व्यवस्थित किया जाना पाया गया, जो अल्पकालिक स्मृति कार्य¹²से गुजर रहा था। इसके अलावा, मिर्गी जब्ती गतिविधियों को अनुदैर्घ्य अक्ष¹³के साथ पूरे हिप्पोकैम्पस के साथ सिंक्रनाइज़ किया गया।

लेकिन देशांतरीय सीए 1 हिप्पोकैम्पस क्षेत्र के अधिकांश अध्ययनों ने सीए 3 से सीए 3 क्षेत्रों¹¹^,¹⁴^,¹⁵में इनपुट का उपयोग किया है . अनुदैर्घ्य मस्तिष्क स्लाइस बनाने के लिए एक अद्वितीय प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हमारे पिछले काम अनुदैर्घ्य अक्ष के साथ CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स के associational कनेक्टिविटी का प्रदर्शन किया और प्रभावी ढंग से न्यूरॉन संकेतन प्रभावी ढंग से¹⁶प्रक्रिया करने की क्षमता implicated . हालांकि, अनुप्रस्थ इनपुट के बिना अनुदैर्घ्य अक्ष के साथ CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स दीर्घकालिक synaptic plasticity का समर्थन कर सकते हैं कि क्या यह निर्धारित करने के लिए एक की जरूरत है. यह निष्कर्ष हिप्पोकैम्पस से संबंधित स्नायविक मुद्दों की जांच में एक और कोण जोड़ सकता है।

न्यूरॉन्स की क्षमता सूचना हस्तांतरण की प्रभावकारिता अनुकूल करने के लिए synaptic plasticity के रूप में जाना जाता है. संलक्षणी प्लास्टिकता को संज्ञानात्मक प्रक्रियाओं जैसे अधिगम और स्मृति¹⁷^,¹⁸,¹⁹^,²⁰के लिए अंतर्निहित तंत्र के रूप में फंसाया जाता है . दीर्घकालिक synaptic plasticity या तो दीर्घकालिक potentiation के रूप में प्रदर्शन किया है (LTP), जो न्यूरॉन प्रतिक्रिया के मजबूत बनाने का प्रतिनिधित्व करता है, या दीर्घकालिक अवसाद (LTD), जो न्यूरॉन प्रतिक्रिया के कमजोर प्रतिनिधित्व करता है. हिपोकैम्पस के अनुप्रस्थ अक्ष में दीर्घकालिक synaptic plasticity का अध्ययन किया गया है. हालांकि, यह पहला अध्ययन CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स के हिप्पोकैम्पस अनुदैर्घ्य अक्ष में लंबी अवधि के synaptic प्लास्टिक का प्रदर्शन करने के लिए है.

यांग एट अल 16 द्वाराइस्तेमाल किया एक प्रोटोकॉल से बिल्डिंग, हम प्रोटोकॉल डिजाइन करने के लिए CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स के हिप्पोकैम्पस देशांतर अक्ष में LTP और लिमिटेड प्रदर्शित करते हैं. हम इन विट्रो प्रयोगों के लिए 5-9 सप्ताह पुराने और विवो प्रयोगों में 6-12 सप्ताह के बीच लेकर उम्र के साथ C57BL6 पुरुष चूहों का इस्तेमाल किया. इस विस्तृत लेख से पता चलता है कि कैसे चूहों से अनुदैर्घ्य हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस इन विट्रो रिकॉर्डिंग के लिए प्राप्त किए गए थे और कैसे विवो रिकॉर्डिंग में अनुदैर्घ्य अक्ष में दर्ज किए गए थे। इन विट्रो रिकॉर्डिंग के लिए, हम हिप्पोकैम्पस के पट और लौकिक अंत को लक्षित करके अनुदैर्घ्य CA1 synaptic प्लास्टिक की दिशात्मक विशिष्टता की जांच की. हम भी स्तर oriens और हिप्पोकैम्पस के स्तर radiatum से रिकॉर्डिंग द्वारा अनुदैर्घ्य CA1 synaptic प्लास्टिक की परत विशिष्टता की जांच की. विवो रिकॉर्डिंग में के लिए, हम कोण है कि सबसे अच्छा हिप्पोकैम्पस की अनुदैर्घ्य दिशा के अनुरूप जांच की.

दोनों विवो में और इन विट्रो extracellular क्षेत्र रिकॉर्डिंग में का उपयोग करना, हमने देखा कि longitudinally जुड़ा CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स LTP के साथ प्रस्तुत, नहीं लिमिटेड. दोनों CA3 और CA1 न्यूरॉन्स शामिल अनुप्रस्थ अभिविन्यास, तथापि, दोनों LTP और लिमिटेड का समर्थन करता है. अनुप्रस्थ और हिप्पोकैम्पस के अनुदैर्घ्य अभिविन्यास के बीच synaptic क्षमताओं में अंतर सट्टा उनके कार्यात्मक कनेक्टिविटी में मतभेद को दर्शाता सकता है. आगे प्रयोगों के लिए उनके synaptic क्षमताओं में मतभेद को समझने की जरूरत है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी जानवरों के दिशा निर्देशों और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान की प्रयोगशाला के उपयोग से दिशा निर्देशों और विनियमों के अनुसार इलाज किया गया. यहाँ वर्णित सभी तरीकों को हांगकांग और इंचियोन राष्ट्रीय विश्वविद्यालय के सिटी विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. विवो क्षेत्र रिकॉर्डिंग में

पशु तैयारी
1. यूरेथेन (0.06 ग्राम प्रति 25 ग्राम वजन) को एनेस्थेटाइज माउस के लिए अंतरापरिवेत। एट्रोपीन के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के साथ पूरक (0.05 मिलीग्राम/ एक अंधेरे शांत जगह में माउस रखें जब तक पूर्ण संज्ञाहरण प्रभाव लेता है.
  चेतावनी: यूरेथेन में कैंसरकारी क्षमता होती है। यह देखभाल के साथ संभाल और उजागर त्वचा के साथ संपर्क से बचने के लिए सुरक्षात्मक कपड़े पहनते हैं।
  नोट: वैकल्पिक रूप से, आइसोफ्लुरेन संज्ञाहरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
2. संज्ञाहरण की एक पूर्ण शल्य विमान प्रभाव लेता है जब तक आवर्तक रूप संज्ञाहरण की गहराई के लिए जाँच करें। शारीरिक उत्तेजनाओं के लिए माउस की प्रतिक्रिया का निरीक्षण करने के लिए टो चुटकी, कान चुटकी, पूंछ चुटकी और कॉर्निया स्पर्श परीक्षण प्रदर्शन करके संज्ञाहरण की गहराई के लिए जाँच करें।
  नोट: एक पलटा या स्वैच्छिक आंदोलन नहीं देखा जाना चाहिए जब माउस संज्ञाहरण की एक पूर्ण शल्य चिकित्सा विमान में है.
3. पैर की अंगुली चुटकी परीक्षण के लिए, या तो माउस के पीछे या फोरलेग का विस्तार और कुंद forceps या उंगलियों की एक जोड़ी के साथ मजबूती से चुटकी. माउस पूर्ण संज्ञाहरण के लिए पुष्टि नहीं की है अगर यह पैर वापस ले लेता है या शरीर हिलाता है, एक observable वृद्धि हुई श्वसन दर है या मुखर लगता है.
4. कान चुटकी परीक्षण के लिए, कुंद forceps या उंगलियों की एक जोड़ी मजबूती से के साथ पिन्ना के सिरों चुटकी. पूर्ण संज्ञाहरण की पुष्टि नहीं है अगर माउस आगे whiskers ले जाता है, उसके सिर हिलाता है, मुखर लगता है बनाता है या एक observable वृद्धि हुई श्वसन दर है.
5. पूंछ चुटकी परीक्षण के लिए, माउस की पूंछ धीरे पकड़ और मजबूती से एक कुंद बल या उंगली के साथ चुटकी. कोई पूंछ आंदोलन, मुखर ध्वनि या श्वसन दर में मनाया वृद्धि मनाया जाना चाहिए जब पूरी तरह से शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के लिए एनेस्थेटाइज़ किया.
6. कॉर्निया स्पर्श परीक्षण के लिए, माउस की कॉर्निया को धीरे से, कपास की बाती के साथ स्पर्श करें। सर्जरी के लिए पूरी तरह से एनेस्थेटाइज़ किए जाने पर कोई पलक आंदोलन, व्हिस्की आंदोलन या श्वसन दर में अवलोकनीय वृद्धि नहीं देखी जानी चाहिए।
7. गर्दन और माउस की खोपड़ी पर बाल दाढ़ी.
8. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक हीटिंग पैड पर पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड माउस रखें और मलाशय में मलाशय के तापमान की जांच डालें। यह हीटिंग पैड द्वारा उत्पादित गर्मी माउस के शरीर के तापमान के परिवर्तन के जवाब में समायोजित करने के लिए सक्षम बनाता है।
9. माउस की आंखों को गीला करने के लिए आई जेल लगाएं।
10. जीभ को धीरे से संदंश का उपयोग करके होंठों के पक्ष में खींचें और स्टीरियोटेक्टिक उपकरण के दूसरे या तीसरे दांतों के छेद में दो सामने दांतों को ठीक करें। आंख-क्लैम्प का उपयोग करके माउस की खोपड़ी को मजबूती से ठीक करें।
  नोट: वैकल्पिक रूप से, एक स्टीरियोटेक्टिक कान दबाना इस्तेमाल किया जा सकता है।
11. एक माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन, एक खोपड़ी के साथ माउस के interparietal और पश्चकपाल हड्डी के अंत में subcutaneous ऊतक और मांसपेशियों को अलग करने के लिए cisterna मैग्ना का पर्दाफाश. एक कपास झाड़ू के साथ ड्यूरा मेटर सूखी ब्लॉट.
12. मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) को निकालने के लिए एक तेज नुकीले स्केलपेल ब्लेड के साथ एक उथले कटौती करके सिस्टर्ना मैग्ना को धीरे से पंचर करें। सीएसएफ draining रखने के लिए एक कपास झाड़ू संलग्न करें।
क्रैनिओटॉमी
1. संदंश के साथ खोपड़ी पर त्वचा पकड़े, कटौती और शल्य कैंची की एक जोड़ी के साथ त्वचा को हटा दें. खोपड़ी पर ब्रीग्मा और लैम्ब्डा के निशान को उजागर करने के लिए पर्याप्त त्वचा को काटें। उजागर क्षेत्र को सूखा रखें।
2. इसी तरह की ऊंचाई के एक क्षैतिज स्तर में गठबंधन किया जा करने के लिए bregma और Lambda अंक सक्षम करने के लिए माउस की clamped खोपड़ी समायोजित करें। या तो पूर्वकाल-पश्च स्थिति या मध्य पार्श्व स्थिति में सिर के झुकाव से बचें।
3. एक वर्नियर कैलिपर की सहायता का उपयोग करके हिप्पोकैम्पस क्षेत्र से संबंधित बिंदुओं को चिह्नित करें। सटीक निर्देशांक निर्धारित करने में मदद करने के लिए एक संदर्भ के रूप में एक स्टीरियोटेक्टिक समन्वय पुस्तक में माउस मस्तिष्क का प्रयोग करें।
  नोट: हिप्पोकैम्पस के लिए चीरा के लिए चिह्नित करने के लिए स्थान हैं 1 मिमी x 3 मिमी मिडलाइन पर भेजा पूर्वकाल-पोस्टर (एपी) संदर्भ बिंदु के रूप में bregma का उपयोग कर, और 3 मिमी x 3 मिमी midline पर अंक कनेक्ट करने के लिए सीधा (एमएल) midline पर अंक कनेक्ट करने के लिए। स्टीरियोटेक्टिक निर्देशांक (एपी: 1,3 और एमएल: 3,3) के रूप में दिए गए हैं।
4. एक माइक्रोस्कोप के नीचे देख तेकोड़ या उच्च गति ड्रिल का उपयोग करते हुए चिह्नित बिंदुओं के साथ हिप्पोकैम्पस के पृष्ठीय क्षेत्र के ऊपर खोपड़ी में एक चीरा बनाएं।
  नोट: 2 मिमी x 3 मिमी के आकार के साथ एक आयताकार आकार का उद्घाटन चीरा के बाद प्राप्त किया जाना चाहिए। मस्तिष्क को चोट से बचने के लिए उजागर क्षेत्र को साफ रखें।
5. ध्यान से ड्यूरा मैटर का पर्दाफाश करने के लिए संदंश के साथ ढीला खोपड़ी बाहर ले और धीरे सतह नम रखने के लिए शारीरिक नमकीन समाधान लागू करने के लिए एक सिरिंज या ड्रॉपर का उपयोग करें।
6. सुई या तेज नुकीले टिप संदंश के साथ ड्यूरा मैटर को सावधानी से निकालें।
  नोट: क्रैनिओटोमी के दौरान मस्तिष्क के ऊतकों को कोई नुकसान न पहुंचाएं। यह मस्तिष्क की सूजन के लिए नेतृत्व करेंगे और परिणाम को प्रभावित करेगा.
7. एक ड्रॉपर या सिरिंज का उपयोग कर शारीरिक लवण या निष्क्रिय तेल लगाने से उजागर मस्तिष्क ऊतक नम रखें।
विवो रिकॉर्डिंग में
1. फिक्स और उत्तेजना की स्थिति और stereotactic धारक में मजबूती से इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग. इसी एपी और एमएल की स्थिति के अनुसार स्टीरियोटैक्टिक साधन समायोजित उत्तेजना और CA1 पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस के ऊपर इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग के लिए निर्देशांक.
  नोट: पृष्ठीय अनुदैर्घ्य CA1 हिप्पोकैम्पस क्षेत्र के लिए निर्देशांक का पता लगाने में एक गाइड के रूप में स्टीरियोटैक्टिक निर्देशांक में माउस मस्तिष्क का प्रयोग करें। उदाहरण के लिए, CA1 हिप्पोकैम्पस क्षेत्र के लिए एक स्टीरियोटेक्टिक समन्वय हो जाएगा (एपी 1.5, एमएल 1.0) रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए और (एपी 1.7, एमएल 1.5) उत्तेजना इलेक्ट्रोड के लिए.
2. एक अनुदैर्घ्य दिशा में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड करने के लिए उत्तेजक इलेक्ट्रोड पार्श्व का पता लगाएँ.
  नोट: सुनिश्चित करें कि दोनों उत्तेजना और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड उपयोग से पहले साफ कर रहे हैं. यह शोर की शुरूआत जब रिकॉर्डिंग रोकता है.
3. रिकॉर्डिंग के लिए, multichannel इलेक्ट्रोड का उपयोग करें। सबसे पहले, पहले चैनल का उपयोग कर CA1 हिप्पोकैम्पस क्षेत्र के लिए स्टीरियोटेक्टिक निर्देशांक का पता लगाने। शेष इलेक्ट्रोडों को ऐसी स्थिति में रखें कि उत्तेजना और अभिलेखन इलेक्ट्रोड ों के कोण को ब्रेकमा बिंदु से मिडलाइन के संबंध में 30 डिग्री से 60 डिग्री की श्रेणी में रखा गया है।
  नोट: यह कोण CA1 हिप्पोकैम्पस क्षेत्र के अनुदैर्घ्य अभिविन्यास से मेल खाती है।
4. एक नियंत्रण के रूप में, CA1 क्षेत्र के ऊपर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड और पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस के CA3 क्षेत्र के ऊपर उत्तेजना इलेक्ट्रोड का पता लगाने. उदाहरण के लिए, एक गाइड के रूप में स्टीरियोटेक्टिक निर्देशांक में माउस मस्तिष्क का उपयोग कर, CA1-CA3 हिप्पोकैम्पस क्षेत्र के लिए एक स्टीरियोटेक्टिक समन्वय हो जाएगा (एपी 1.8, एमएल 1.0) रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए और (एपी 1.5, एमएल 1.5) उत्तेजना इलेक्ट्रोड के लिए.
  नोट: यह चरण एक वैकल्पिक नियंत्रण है और एक अलग प्रयोग में किया जाना चाहिए.
5. उजागर मस्तिष्क क्षेत्र के एक दूरस्थ भाग में या माउस की त्वचा के नीचे संदर्भ इलेक्ट्रोड रखें.
6. रिकॉर्डिंग सिस्टम चालू करें.
7. रिकॉर्डिंग और डेटा अधिग्रहण के लिए सॉफ्टवेयर खोलें.
  नोट: विभिन्न प्रयोगशालाओं रिकॉर्डिंग और डेटा अधिग्रहण के लिए अपने पसंदीदा सॉफ्टवेयर है.
8. एक माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन, रिकॉर्डिंग और उत्तेजना इलेक्ट्रोड धीरे धीरे micromanipulator का उपयोग कर जब तक यह सिर्फ मस्तिष्क की सतह को छू कम. हिप्पोकैम्पस क्षेत्र के लिए सही गहराई की गणना शुरू करने के लिए शून्य बिंदु के रूप में बिंदु को चिह्नित करें।
  नोट: micromanipulator गहराई जिस पर इलेक्ट्रोड किसी भी समय डाला जाता है पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रतिबाधा में वृद्धि का प्रेक्षण तभी करें जब इलेक्ट्रोड मस्तिष्क की सतह को छूता है।
9. धीरे धीरे CA1 हिप्पोकैम्पस के लिए चुना स्टीरियोटैक्टिक निर्देशांक के लिए इसी अनुमानित गहराई के लिए इलेक्ट्रोड कम.
  नोट: चुना स्टीरियोटिक निर्देशांक के लिए इसी अनुमानित गहराई प्राप्त करने के लिए एक गाइड के रूप में स्टीरियोटेक्टिक निर्देशांक में माउस मस्तिष्क का प्रयोग करें।
10. उत्तेजना (100 डिग्री की अवधि, 30 s अंतराल पर दोहराया) दे और 50 डिग्री मीटर या उससे कम के चरणों में इलेक्ट्रोड गहराई को समायोजित जब तक एक स्थिर पैदा क्षेत्र उत्तेजक पदों ynaptic क्षमता (fEPSP) मनाया जाता है.
  नोट: 20 डिग्री सेल्सियस का प्रोत्साहन आमतौर पर एक प्रेक्षणीय प्रतिक्रिया पैदा करने के लिए पर्याप्त है।
11. यह सुनिश्चित करें कि एक स्थिर एफईएसपी को उद्दीपक तीव्रता को अलग करके प्रेरित किया गया है। एफईपीएसपी की ढाल या आयाम में उल्लेखनीय वृद्धि प्रत्येक वृद्धि हुई उत्तेजना तीव्रता के साथ देखी जानी चाहिए। इसे इनपुट-आउटपुट वक्र कहते हैं। अधिकतम उद्दीपक तीव्रता का पता लगाने के लिए एक इनपुट-आउटपुट (I-O) वक्र बनाएँ जिस पर उत्कश एफईपीपी की ढलान में और अधिक वृद्धि नहीं हुई है (चित्र6)।
  नोट: डेटा को त्यागें और यदि प्रयोग के दौरान फाइबर वॉली गायब हो जाती है तो इलेक्ट्रोड स्थिति बदलें।
12. 40 करने के लिए आधार रेखा तीव्रता सेट करने के लिए इनपुट-आउटपुट वक्र का उपयोग करें - अधिकतम का 50%. आधार रेखा अभिलेखन के लिए संगत उद्दीपन तीव्रता का उपयोग की जा रही है।
13. 20 - 30 मिनट के लिए एक आधार रेखा के रूप में स्थानीय क्षेत्र क्षमता रिकॉर्ड.
14. उच्च आवृत्ति उत्तेजना (एचएफएस) या टेटनस को अधिकतम तीव्रता के 75% तक प्राप्त करने के लिए उत्तेजना तीव्रता निर्धारित करने के लिए एक ही इनपुट-आउटपुट वक्र का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, जब लंबी अवधि के अवसाद inducing, एक ही उत्तेजना तीव्रता बनाए रखने के आधार रेखा रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया जब कम आवृत्ति उत्तेजना evoking (LFS).
15. एलटीपी को प्रेरित करने के लिए 10 हर्ट्ज दालों की एक टेटेनिक उत्तेजना 4 बार 10 के अंतराल के साथ लागू करें।
  नोट: केवल एक दीर्घकालिक potentiation प्रयोग पर काम करते समय इस प्रोटोकॉल का उपयोग करें।
16. की कम आवृत्ति उत्तेजना लागू करें 5 हर्ट्ज (900 उत्तेजनाओं के दौरान 3 मिनट), 1 हर्ट्ज LFS (900 उत्तेजनाओं के दौरान 15 मिनट), या 1 हर्ट्ज युग्मित-पल्स (50 एमएस युग्मित पल्स अंतराल, 15 मिनट के दौरान उत्तेजनाओं के 900 जोड़े) पहले से ही स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार लिमिटेड प्रेरित करने के लिए.
  नोट: केवल एक दीर्घकालिक अवसाद प्रयोग पर काम करते समय इन प्रोटोकॉल का उपयोग करें.
17. HFS या LFS के बाद 1 h के लिए स्थानीय क्षेत्र क्षमता रिकॉर्ड, वैकल्पिक रूप से.
18. डेटा निर्यात और सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण।
19. दर्ज क्षेत्रों घाव करने के लिए 30 s के लिए 10 डिग्री ए वर्तमान की एक उत्तेजना देकर रिकॉर्डिंग और उत्तेजना इलेक्ट्रोड की स्थिति की पुष्टि करें। Transcardially 4% paraformaldehyde के साथ माउस perfuse और टुकड़ा करने और Cresyl वायलेट के साथ धुंधला के लिए मस्तिष्क फसल के अनुसार.
20. प्रयोग के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था या घातक संवेदनाहारी खुराक के इंजेक्शन द्वारा माउस को यूथेनाइज़ करें।

2. इन विट्रो क्षेत्र रिकॉर्डिंग

ऑक्सीजनयुक्त टुकड़ा करने और कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) समाधान की तैयारी
1. टुकड़ा करने के समाधान के 2 एल के लिए, एक volumetric फ्लास्क में डबल आसुत पानी के लगभग 1 एल जोड़ें और एक stirer प्लेट पर जोरदार हलचल.
2. निम्नलिखित टुकड़ा करने वाले समाधान घटक जोड़ें (एमएम में): 87.0 NaCl, 2.5 KCl, 1.3 NaH₂PO₄, 25.0 NaHCO₃, 25.0 ग्लूकोज, 75.0 sucrose, 7.0 MgCl₂.6H₂O और 0.5 CaCl₂2H₂O (तालिका 1)।
  नोट: वैकल्पिक रूप से, MgCl₂$6H₂O और CaCl₂इस चरण में शामिल नहीं किया जा सकता है और बाद में वॉल्यूम का उपयोग करने के लिए तैयार में जोड़ा जा सकता है।
3. जोरदार सरगर्मी करते हुए डबल आसुत पानी के साथ 2 एल तक ऊपर.
4. ACSF के 2 L के लिए, एक volumetric फ्लास्क में डबल आसुत पानी के लगभग 1 एल जोड़ें और एक stirer प्लेट पर जोरदार हलचल.
5. निम्नलिखित ACSF समाधान घटक जोड़ें (एमएम में): 125.0 NaCl, 2.5 KCl, 1.3 नाH₂पीओ₄, 25.0 NaHCO₃, 25 ग्लूकोज, 1.0 MgCl₂$6H₂O और 2.0 CaCl₂2H₂O (तालिका 1)।
  नोट: वैकल्पिक रूप से, MgCl₂.6H₂O और CaCl₂$2H₂व् को इस अवस्था में शामिल नहीं किया जा सकता है और बाद में वॉल्यूम का उपयोग करने के लिए तैयार जोड़ा जा सकता है।
6. जोरदार सरगर्मी करते हुए डबल आसुत पानी के साथ 2 एल तक ऊपर.
सेटअप और मस्तिष्क टुकड़ा करना
1. लगभग 20 मिनट के लिए एक अलग फ्लास्क और ऑक्सीजनेट (95% हे₂/5% सीओ₂) में पहले से ही तैयार टुकड़ा करने के समाधान के 400 एमएल डालो।
2. शेष 1.6 L विलयन को 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में संग्रहित करें। समाधान को 1 सप्ताह तक रखें जिसके बाद कवक विकास से बचने के लिए इसका उपयोग नहीं किया जाना चाहिए।
3. फ्लास्क में ऑक्सीजनयुक्त टुकड़ा करने के समाधान के 200 एमएल डालो, पैराफिल्म के साथ कवर और लगभग 20 मिनट के लिए एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरण एक कीचड़ बनाने के लिए।
4. एक मस्तिष्क टुकड़ा पकड़े कक्ष में टुकड़ा करने के समाधान के शेष 200 एमएल डालो और निरंतर bubbling के साथ एक 32 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में रहते हैं.
5. टुकड़ा करने के लिए बेंच तैयार करें। बेंच के शीर्ष पर कागज तौलिए नीचे और शल्य चिकित्सा उपकरण रखें। शीघ्र एवं कुशल प्रक्रिया को सुगम बनाने के लिए शल्य चिकित्सा उपकरणों को व्यवस्थित की जाती है (चित्र 7) ।
6. फ्रीजर से ठंडा टुकड़ा करने वाले घोल को बाहर निकाल लें और बीकर में लगभग 50 एमएल डाल दें। इसे गीला करने के लिए फिल्टर पेपर युक्त एक पेट्री डिश में लगभग 10 एमएल डालो। विच्छेदन क्षेत्र द्वारा उन्हें बर्फ पर रखें।
7. टुकड़ा करने के कक्ष में slushed टुकड़ा समाधान के बाकी डालो और vibratome पर तय.
8. पशु देखभाल और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान की प्रयोगशाला के उपयोग पर दिशा निर्देशों और विनियमों का उपयोग कर isoflurane के साथ माउस Anesthetize, और संस्थागत पशु उपयोग और हांगकांग और इंचियोन राष्ट्रीय शहर विश्वविद्यालय के देखभाल समिति के अनुमोदित तरीकों विश्वविद्यालय.
9. कैंची की एक जोड़ी के साथ एनेस्थेटाइज्ड माउस को नष्ट करें और ऊतक कागज पर सिर रखें। माउस की खोपड़ी को कवर करने वाली त्वचा को काटें और कैंची से त्वचीय मांसपेशियों के माध्यम से काट ें। सर्जिकल कैंची का उपयोग करके पश्चकपाल हड्डी को मिडलाइन के साथ खोपड़ी प्लेटों को काटें।
10. मस्तिष्क का पर्दाफाश करने के लिए कुंद forceps के साथ खोपड़ी खोलें. बीकर में ठंडा टुकड़ा करने के समाधान में एक स्पैचुला और जगह के साथ मस्तिष्क को धीरे से बाहर निकाल लें। के बारे में रुको 30 s.
11. चम्मच का उपयोग कर मस्तिष्क बाहर ले लो और ध्यान से पेट्री डिश में पहले से गीला फिल्टर कागज पर जगह है.
12. एक स्केलपेल ब्लेड के साथ मिडलाइन के साथ दो मस्तिष्क गोलार्द्धों अलग. एक स्पैचुला के साथ कॉर्टेक्स से अलग होकर हिप्पोकैम्पस को अलग करें और इसे नम फिल्टर पेपर पर सावधानी से रखें। स्कैल्पल का उपयोग करके अलग-थलग हिप्पोकैम्पस के पट और अस्थायी अंत को काटें।
13. एक कुंद spatula और ब्रश का उपयोग कर अलग हिप्पोकैम्पस उठाओ. अतिरिक्त पानी को हटाने के लिए एक ऊतक कागज पर स्पैचुला को धीरे से थपथपाएं।
14. vibratome के टुकड़ा करने की प्लेट के लिए गोंद की एक छोटी राशि लागू करें.
15. एक अनुदैर्घ्य CA1 हिप्पोकैम्पस टुकड़ा के लिए, गोंद के साथ टुकड़ा करने की थाली के लिए हिप्पोकैम्पस के CA3 क्षेत्र देते हैं। जल्दी लेकिन ध्यान से यह ठंडा oxygenated टुकड़ा समाधान युक्त vibratome के टुकड़ा कक्ष में जगह है.
16. अनुप्रस्थ टुकड़ा है कि एक नियंत्रण के रूप में काम करेंगे के लिए, vibratome के टुकड़ा करने की थाली के लिए हिप्पोकैम्पस के अधर अंत देते हैं। जल्दी लेकिन ध्यान से ठंडा oxygenated विच्छेदन समाधान युक्त टुकड़ा कक्ष में जगह है.
  नोट: यह चरण ऊपर दिए गए चरण के लिए एक विकल्प है और अलग से किया जाना चाहिए।
17. ब्लेड कोण को 90 डिग्री करने के लिए स्थिति। थरथानेवाला पैरामीटर को 0ण्05 मिमी/s की गति, 1ण्20 उउ का आयाम तथा 400 उउ का स्लाइस मोटाई पर सेट करें।
18. वाइब्राटोम के साथ संलग्न हिप्पोकैम्पस स्लाइस करें।
  नोट: एक अच्छा अनुदैर्घ्य CA1 हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क टुकड़ा CA1 की एक परत और दंते हुए gyrus के 2 परतों होगा. 2 अच्छा हिप्पोकैम्पस स्लाइस की एक अधिकतम प्राप्त किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, एक अनुप्रस्थ हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क टुकड़ा दंत चिकित्सा gyrus, CA3 और CA1 क्षेत्रों बरकरार होगा.
19. एक पिपेट के साथ vibratome से अनुदैर्घ्य हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस स्थानांतरण और पानी के स्नान में मस्तिष्क टुकड़ा पकड़े कक्ष में यह इनक्यूबेट।
20. 32 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर 20 मिनट के लिए पानी के स्नान में इनक्यूबेट स्लाइस और वसूली के 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान के लिए बाहर ले आओ।
  नोट: वैकल्पिक रूप से, जब पानी स्नान से बाहर मस्तिष्क टुकड़ा हस्तांतरण और धीरे वसूली के 30 मिनट के लिए 32 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर oxygenated ACSF बह के साथ रिकॉर्डिंग कक्ष में जगह है.
21. जबकि पानी के स्नान में incubating, एक अलग फ्लास्क और oxygenate में ACSF समाधान के400 एमएल डालना (95% हे₂/ 2 एमएल/मिनट की गति से एसीएसएफ को रिकॉर्डिंग कक्ष में लगातार अतिउपयोग करना।
22. बहते एसीएसएफ को 32 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने के लिए तापमान नियंत्रक को चालू करें।
23. शेष 1.6 L विलयन को 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में संग्रहित करें। समाधान को एक सप्ताह तक रखें जिसके बाद कवक विकास से बचने के लिए इसका उपयोग नहीं किया जाना चाहिए।
इन विट्रो रिकॉर्डिंग
1. सभी की जरूरत हार्डवेयर पर मोड़ द्वारा एक रिकॉर्डिंग रिग सेट करें।
2. रिकॉर्डिंग कक्ष में टुकड़ा पकड़े कक्ष से मस्तिष्क टुकड़ा स्थानांतरण. कुंद forceps के साथ मस्तिष्क टुकड़ा की स्थिति को समायोजित करें और यह एक वीणा के साथ जगह में पकड़. ACSF कम से कम 20 मिनट के लिए चलाने के लिए अनुमति दें. यह रिकॉर्डिंग से पहले स्थिर होने के लिए मस्तिष्क टुकड़ा सक्षम बनाता है.
3. एक आंतरिक समाधान के रूप में ACSF के साथ रिकॉर्डिंग pipette भरें.
4. नामित सॉफ्टवेयर के साथ रिकॉर्डिंग pipette प्रतिरोध की जाँच करें. रिकॉर्डिंग पिपेट प्रतिरोध 3-5 एमजेड की सीमा के भीतर होना चाहिए।
5. डेटा प्राप्ति के लिए सॉफ़्टवेयर चालू करें. इस सॉफ्टवेयर में इसी तरह की विशेषताएं होनी चाहिए जो डेटा अधिग्रहण को उसी तरह सक्षम करती हैं जैसे पहले दिखाए गए विवो रिकॉर्डिंग में।
6. रिकॉर्डिंग और उत्तेजना इलेक्ट्रोड मजबूती से स्टीरियोटैक्टिक साधन धारक में ठीक करें। अभिलेखकक्ष में एसीएसएफ में संदर्भ इलेक्ट्रोड रखें।
7. अनुदैर्घ्य स्लाइस के लिए, स्तर ओरियन्स (एस.ओ.) में उत्तेजना और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की स्थिति। इलेक्ट्रोडों के बीच की दूरी को लगभग 300 से 500 उ रखें। मस्तिष्क के पटयाल या अस्थायी पक्ष पर उत्तेजना इलेक्ट्रोड रखें और उसी परत से अभिलेख ित करें (चित्र8)।
8. वैकल्पिक रूप से, स्तर रेडिएटम (एस.आर.) में उत्तेजना और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की स्थिति। मस्तिष्क स्लाइस के या तो पट या अस्थायी पक्ष पर उत्तेजना इलेक्ट्रोड रखें.
9. अनुप्रस्थ स्लाइसों के लिए एक नियंत्रण के रूप में, CA3 पर उत्तेजक इलेक्ट्रोड स्थिति (Schaffer संपार्श्विक मार्ग) क्षेत्र, और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड पर CA1 क्षेत्र (चित्र 9).
  नोट: यह एक वैकल्पिक नियंत्रण चरण है और एक अलग प्रयोग में किया जाना चाहिए.
10. अलग उत्तेजना जनरेटर चालू करें और उत्तेजना दे (100 डिग्री की अवधि, 30 s अंतराल पर दोहराया). रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड गहराई और/
11. यह सुनिश्चित करें कि एक स्थिर एफईएसपी को उद्दीपक तीव्रता को अलग करके प्रेरित किया गया है। एपीएफईपीपी की ढलान में एक उल्लेखनीय परिवर्तन को उद्दीपक तीव्रता के प्रत्येक परिवर्तन के साथ देखा जाना चाहिए। इसे इनपुट-आउटपुट वक्र कहते हैं। अधिकतम उद्दीपक तीव्रता का पता लगाने के लिए एक इनपुट-आउटपुट (I-O) वक्र बनाएँ जिस पर एफईपीएसपी की प्रवणता में कोई वृद्धि नहीं हुई है (चित्र6)।
  नोट: डेटा को त्यागें और यदि प्रयोग के दौरान फाइबर वॉली गायब हो जाती है तो इलेक्ट्रोड स्थिति बदलें।
12. इनपुट-आउटपुट वक्र का उपयोग आधारभूत रिकॉर्डिंग के लिए और उच्च आवृत्ति उत्तेजना (एचएफएस) या टेटनस को अधिकतम उत्कश fEPSP के 30-40% तक प्राप्त करने के लिए उत्तेजना तीव्रता निर्धारित करने के लिए करें।
13. वैकल्पिक रूप से, लिमिटेड के बारे में प्रयोगों के लिए, इनपुट-आउटपुट वक्र का उपयोग आधारभूत रिकॉर्डिंग के लिए आधारभूत तीव्रता निर्धारित करने के लिए और कम आवृत्ति उत्तेजना (एलएफएस) के लिए अधिकतम पैदा fEPSP के 70% करने के लिए.
14. 20 - 30 मिनट के लिए आधार रेखा के रूप में स्थानीय फ़ील्ड क्षमता रिकॉर्ड करें।
15. एलटीपी को प्रेरित करने के लिए 30 के अंतराल के साथ दो बार 100 हर्ट्ज दालों के HFS लागू करें।
16. वैकल्पिक रूप से, LTD प्रयोगों के लिए, कम आवृत्ति उत्तेजना लागू 5 हर्ट्ज (900 उत्तेजनाओं के दौरान 3 मिनट) या 1 हर्ट्ज LFS (900 उत्तेजनाओं के दौरान 15 मिनट) या 1 हर्ट्ज युग्मित पल्स (50 एमएस युग्मित पल्स अंतराल, 15 मिनट के दौरान उत्तेजनाओं के 900 जोड़े) पहले से ही के अनुसार एलटी प्रेरित करने के लिए स्थापित प्रोटोकॉल.
17. HFS या LFS के बाद 1 h के लिए स्थानीय क्षेत्र क्षमता रिकॉर्ड.
18. डेटा निर्यात करें और विश्लेषण करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

हम दोनों विवो में और इन विट्रो में extracellular क्षेत्र रिकॉर्डिंग का उपयोग हिप्पोकैम्पस के अनुदैर्घ्य CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स की लंबी अवधि के synaptic plasticity का पता लगाया. LTP और लिमिटेड लंबी अवधि के synaptic प्लास्टिक के पहलुओं है कि हिप्पोकैम्पस के अनुप्रस्थ अक्ष में प्रदर्शन किया गया है undirectional हो रहे हैं.

हम यहाँ से पता चला है कि अनुदैर्घ्य हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग कर, वहाँ हिप्पोकैम्पस के CA1 अनुदैर्घ्य अक्ष में LTP है. हमने सेप्टोटेम्पोरअक्ष के साथ हिप्पोकैम्पस के अनुदैर्घ्य स्लाइस तैयार किए, जो अनुप्रस्थ स्लाइसों के लंबवत होते हैं (चित्र 1)। हिप्पोकैम्पस के CA1 क्षेत्र से रिकॉर्डिंग का उपयोग करना, हम दिशा विशिष्ट नहीं था कि LTP की उपस्थिति से पता चला. सन्तति या लौकिक से रिकॉर्डिंग में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं थे (चित्र 2) देशांतरीय हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस के पक्ष में. हमने एलटीपी की उपस्थिति भी दिखाई जो परत विशिष्ट नहीं थी; इस प्रकार, दोनों स्तर radiatum और स्तर oriens से रिकॉर्डिंग (चित्र 2) अनुदैर्घ्य मस्तिष्क टुकड़ा में सफलतापूर्वक प्रेरित LTP दिखाया. हमने D-AP5 का उपयोग किया, एक NMDAR विरोधी यह प्रदर्शित करने के लिए कि प्रेरित LTP प्रेरित NMDA रिसेप्टर्स पर निर्भर था (चित्र 3)। विट्रो में क्या होता है जरूरी vivo स्थितियों में प्रतिबिंबित नहीं करता है, इसलिए हम vivo में LTP की जांच की. चित्र 4 एक उत्तेजना और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के एक योजनाबद्ध आरेख से पता चलता है विवो में CA1 क्षेत्र के अनुदैर्घ्य अक्ष के साथ पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस में तैनात. रिकॉर्डिंग और उत्तेजना के लिए प्रयुक्त इलेक्ट्रोडों की स्थिति घाव के निशान और क्रिस्टल बैंगनी धुंधला द्वारा सत्यापित की गई थी (चित्र 4क) । हमने अनुदैर्घ्य सीए 1 क्षेत्र में विवो में एलटीपी की उपस्थिति का प्रदर्शन किया (चित्र 4ख)

लिमिटेड को प्रेरित करने के लिए पहले से ही स्थापित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम विवो और इन विट्रो दोनों में लिमिटेड को सफलतापूर्वक प्रेरित करने में विफल रहे (चित्र 5)।

चित्र 1 . अनुप्रस्थ और अनुदैर्घ्य हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस का एक योजनाबद्ध ड्राइंग. यह आंकड़ा अनुकूलित और सूर्य एट अल से संशोधित किया जाता है 2018²¹. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 2 . अनुदैर्घ्य स्लाइस में LTP. एस.आर. (क) याएस.ओ. (ख) में अनुक्रियाओं में अनुदैर्घ्य स्लाइस ों में तपन की उत्तेजना के ठीक बाद दोनों लौकिक और सेप्टल इनपुट (एस.आर./ 9, घ)।
n स्लाइस की संख्या के लिए खड़ा है. त्रुटि पट्टियाँ SE का प्रतिनिधित्व करती हैं. यह आंकड़ा अनुकूलित और सूर्य एट अल से संशोधित किया जाता है 2018²¹. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 3 . अनुदैर्घ्य स्लाइस में NMDAR-निर्भर LTP. (ए,ख) अस्थायी तथा पटीय दिशा में एलटीपी प्रेरण 50 डिग्री द-ए-एपी5 (अस्थायी, द र् 6, क) (सेप्टल, द र् 5, ख) द्वारा अवरुद्ध है। (ग,घ) अस्थायी और पट दिशा में एलटीपी प्रेरण भी डी-एपी 5 द्वारा अवरुद्ध है। एन स्लाइस के लिए खड़ा है. त्रुटि पट्टियाँ SE का प्रतिनिधित्व करती हैं. यह आंकड़ा अनुकूलित और सूर्य एट अल से संशोधित किया जाता है 2018²¹. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 4 . इंटरलामेलर नेटवर्क में विवो एलटीपी में। (क) एनेस्थेटाइज्ड जंतुओं में रेकॉर्डिंग और उत्तेजना इलेक्ट्रोड का एक योजनाबद्ध ड्राइंग। रिकॉर्डिंग की loci (CA1 के पटके हुए पक्ष पर) और उत्तेजक इलेक्ट्रोड (CA1 के अस्थायी पक्ष पर) घाव के निशान से पहचान े ली गई. (ख) एलटीपी को 100 हर्ट्ज उच्च आवृत्ति उत्तेजना (एचएफएस) (द ] 10 चूहे द्वारा अंतरलामेलर संबंध में प्रेरित किया जाता है। रंग निशान: पहले (काला) और बाद (लाल) HFS. त्रुटि पट्टियाँ SE का प्रतिनिधित्व करती हैं. यह आंकड़ा अनुकूलित और सूर्य एट अल से संशोधित किया जाता है 2018²¹. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 5 . विवो में और इंटरलामेलर CA1 नेटवर्क में इन विट्रो लिमिटेड की अनुपस्थिति। (अ) 1 हर्ट्ज-पीपी एलएफएस विवो लिमिटेड में प्रेरित नहीं करता है (ख) 1 हर्ट्ज पीपी-एलटीपी , (ग) 5 हर्ट्ज एलएफएस , और (घ) 1 हर्ट्ज एलएफएस या तो लौकिक या सेप्टिक पक्षों पर अनुदैर्घ्य मस्तिष्क स्लाइस का उत्पादन नहीं करता है। जबकि लिमिटेड अनुप्रस्थ स्लाइस में 1 हर्ट्ज पीपी-एलएफएस द्वारा प्रेरित है: अस्थायी (द $ 8), सेप्टल (एन $ 11) और अनुप्रस्थ (एन जेड 6) के साथ 1 हर्ट्ज पीपी-एलएफएस; शंखीय (द र् 3) तथा पट् का (द र् 3) 5 भ्भ् एलएफएस के साथ; शंखीय (द र् 3) तथा पटीय (द र् 3) 1 भ्भ् एलएफएस के साथ। एन स्लाइस के लिए खड़ा है. त्रुटि पट्टियाँ SE का प्रतिनिधित्व करती हैं. यह आंकड़ा अनुकूलित और सूर्य एट अल से संशोधित किया जाता है 2018²¹. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 6 . हिपोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस में प्रोत्साहन इनपुट में वृद्धि के प्रत्युत्तर में एफईएसपी ढलान प्रस्तुत करने वाला इनपुट-आउटपुट वक्र. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 7 . इन विट्रो मस्तिष्क टुकड़ा करने के दौरान हिप्पोकैम्पस अलगाव के लिए उपयोग किए जाने वाले सर्जिकल उपकरण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 8 . एक अनुदैर्घ्य मस्तिष्क टुकड़ा जो रिकॉर्डिंग के लिए तैयार होता है। उत्तेजना इलेक्ट्रोड और रिकॉर्डिंग पिपेट स्तर रेडिएटम में डाला जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 9 . एक अनुप्रस्थ हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क टुकड़ा रिकॉर्डिंग के लिए तैयार है। उत्तेजना इलेक्ट्रोड Schaffer संपार्श्विक CA3 क्षेत्र में डाला जाता है और रिकॉर्डिंग pippette CA1 क्षेत्र में डाला जाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

यौगिक	टुकड़ा समाधान (एमएम)	एसीएसएफ (एमएम)
CaCl₂.2H₂हे	0.5	2
ग्लूकोज	25	25
केसीएल	2.5	2.5
MgCl₂.6H₂हे	7	1
Nacl	87	125
नाह₂पीओ₄	1.3	1.3
नाHको₃	25	25
Sucrose	75

तालिका 1: मस्तिष्क टुकड़ा और कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव समाधान में यौगिकों की सांद्रता।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्रोटोकॉल विवो में दीर्घकालिक synaptic प्लास्टिक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विट्रो में हिप्पोकैम्पस के अनुदैर्घ्य CA1-CA1 अक्ष में मस्तिष्क स्लाइस से प्रेरित करने के लिए विधि को दर्शाता है. दिए गए चरणों में एक प्रयोगकर्ता को एक अनुदैर्घ्य हिप्पोकैम्पस CA1-CA1 कनेक्शन में LTP और LTD की जांच करने के लिए पर्याप्त विवरण दिया गया है। अभ्यास सफलतापूर्वक क्षेत्र उत्तेजक क्षमता रिकॉर्ड करने के लिए आवश्यक कौशल को सुधारने के लिए आवश्यक है।

अभ्यास की जरूरत के अलावा, वहाँ कई महत्वपूर्ण कदम है कि अच्छे परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं. सबसे पहले, यह पहले से पता चला था कि कोण जो करने के लिए मस्तिष्क स्लाइस किए गए थे या तो काट या हिप्पोकैम्पस¹⁶के CA1-CA1 क्षेत्र में पिरामिड न्यूरॉन्स के अनुदैर्घ्य अनुमानों की रक्षा कर सकता है. अनुप्रस्थ न्यूरॉन्स से अनुप्रस्थ न्यूरॉन्स से लगभग लम्बवत कोण पर अनुदैर्घ्य पिरामिडीय न्यूरॉन्स का कार्य होता है। के रूप में CA1 न्यूरॉन्स हिप्पोकैम्पस के भीतर विभिन्न कोणों में प्रचार, उन दोनों के बीच अनुदैर्घ्य संबंध हिप्पोकैम्पस के dorsoventral अक्ष के साथ बाहर देता है. इस प्रकार, इन विट्रो रिकॉर्डिंग के लिए, प्रयोगकर्ता को इसे ध्यान में रखना चाहिए ताकि पृष्ठीय-अवतरण अक्ष के साथ अलग हिप्पोकैम्पस ऊतक को काटने से अनुदैर्घ्य अक्ष के साथ CA1-CA1 हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स को सही ढंग से लक्षित किया जा सके। इसके अलावा, विवो रिकॉर्डिंग में, कोण जिस पर उत्तेजना और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड तैनात कर रहे हैं निर्धारित करता है कि क्या प्राप्त परिणाम अनुदैर्घ्य अक्ष या दोनों अनुप्रस्थ और अनुदैर्घ्य अक्ष का एक मिश्रण के प्रतिनिधि हैं. CRISPR-Cas9 का उपयोग आगे की जांच की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है कि क्या पैदा की प्रतिक्रिया केवल CA1 क्षेत्र से है क्योंकि यह दोनों CA1 और CA3 क्षेत्रों से प्रतिक्रियाओं का एक मिश्रण हो सकता है.

दूसरे, इन विट्रो प्रयोगों के लिए, प्रयोगकर्ता को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि मस्तिष्क टुकड़ा करने का समाधान, ACSF, वर्क बेंच और मस्तिष्क स्लाइस के साथ संपर्क में आने वाले सभी उपकरण या उपकरण contaminants से मुक्त हैं। संदूषण के किसी भी रूप में अखंडता या मस्तिष्क टुकड़ा की मौत की गिरावट के लिए नेतृत्व करेंगे. एक साफ इलेक्ट्रोड सतह बनाए रखने दोनों इन विट्रो में और विवो प्रयोगों में के लिए अच्छा और स्थिर रिकॉर्डिंग सुनिश्चित करेगा.

हमने दिखाया है कि अनुदैर्घ्य हिप्पोकैम्पस CA1 नेटवर्क NMDAR-निर्भर LTPs दर्शाती है, लेकिन LTDs नहीं. तथापि, ट्राइसाइनाप्टिक परिपथ एलटीपीऔर एलटी 22^,²³दोनों के साथ प्रस्तुत करता है। इसका तात्पर्य यह है कि अनुदैर्घ्य CA1 नेटवर्क और त्रि-synaptic circuitry अद्वितीय विशेषताएं हैं. हमारे प्रोटोकॉल केवल electrophysiological रिकॉर्डिंग का उपयोग करता है और इसलिए इन दो नेटवर्क के बीच अंतर खोजने में सीमित है.

इस तरह के एक प्रकार का पागलपन के रूप में मस्तिष्क रोगों के लिए एक इलाज के लिए खोज जारी है. सीए 1 हिप्पोकैम्पस उपक्षेत्रों की गिरावट या विकृति को कुछ शाइजोफ्रेनिक लक्षणों²⁴^,^{25 के}साथ जोड़ा गया है . हमारे प्रोटोकॉल के आवेदन, हालांकि बुनियादी, CA1 अनुदैर्घ्य हिप्पोकैम्पस उपक्षेत्र की एक अद्वितीय synaptic क्षमता प्रकाश में लाया गया है. यह ज्ञान प्रयोगों है कि आगे हिप्पोकैम्पस के अनुदैर्घ्य CA1 अक्ष के साथ इस दुर्बल मस्तिष्क रोग की जांच कर सकते हैं डिजाइन करने में उपयोगी है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

हमारे पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को इंचियोन नेशनल यूनिवर्सिटी (इंटरनेशनल कोऑपरेटिव) रिसर्च ग्रांट ने सपोर्ट किया। हम कुछ डेटा संग्रह के साथ सहायता करने के लिए सुश्री गोना चोई को धन्यवाद देना पसंद करेंगे।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atropine Sulphate salt monohydrate, ≥97% (TLC), crystalline	Sigma-Aldrich	5908-99-6	Stored in Dessicator
Axon Digidata 1550B
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	10035-04-8
Clampex 10.7
D-(+)-Glucose ≥ 99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	50-99-7
Eyegel	Dechra
Isoflurane	RWD Life Sciences	R510-22
Magnesium chloride hexahydrate, BioXtra, ≥99.0%	Sigma-Aldrich	7791-18-6
Matrix electrodes, Tungsten	FHC	18305
Multiclamp 700B Amplifier
Potassium chloride, BioXtra, ≥99.0%	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Potassium phosphate monobasic anhydrous ≥99%	Sigma-Aldrich	7778-77-0	Stored in Dessicator
Pump	Longer precision pump Co., Ltd	T-S113&JY10-14
Silicone oil	Sigma-Aldrich	63148-62-9
Sodium Bicarbonate, BioXtra, 99.5-100.5%	Sigma-Aldrich	144-55-8
Sodium Chloride, BioXtra, ≥99.5% (AT)	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Sodium phosphate monobasic, powder	Sigma-Aldrich	7558-80-7
Sucrose, ≥ 99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	57-50-1
Temperature controller	Warner Instruments	TC-324C
Tungsten microelectrodes	FHC	20843
Urethane, ≥99%	Sigma-Aldrich	51-79-6
Vibratome	Leica	VT-1200S
Water bath	Grant Instruments	SAP12

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Levy, W. B. A sequence predicting CA3 is a flexible associator that learns and uses context to solve hippocampal-like tasks. Hippocampus. 6 (6), 579-590 (1996).
Eldridge, L. L., Knowlton, B. J., Furmanski, C. S., Bookheimer, S. Y., Engel, S. A. Remembering episodes: A selective role for the hippocampus during retrieval. Nature Neuroscience. 3 (11), 1149-1152 (2000).
Sullivan Giovanello, K., Schnyer, D. M., Verfaellie, M. A critical role for the anterior hippocampus in relational memory: evidence from an fMRI study comparing associative and item recognition. Hippocampus. 14 (1), 5-8 (2004).
Andersen, P., Bland, B., Dudar, J. D. Organization of the hippocampal output. Experimental Brain Research. 17 (2), 152-168 (1973).
Andersen, P., Bliss, T. V. P., Skrede, K. K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways. Experimental Brain Research. 13 (2), 222-238 (1971).
Sloviter, R., Lømo, T. Updating the Lamellar Hypothesis of Hippocampal Organization. Frontiers in Neural Circuits. 6 (102), (2012).
Ishizuka, N., Weber, J., Amaral, D. G. Organization of intrahippocampal projections originating from CA3 pyramidal cells in the rat. Journal of Comparative Neurology. 295 (4), 580-623 (1990).
Tamamaki, N., Nojyo, Y. Crossing fiber arrays in the rat hippocampus as demonstrated by three-dimensional reconstruction. Journal of Comparative Neurology. 303 (3), 435-442 (1991).
Swanson, L., Wyss, J., Cowan, W. An autoradiographic study of the organization of intrahippocampal association pathways in the rat. Journal of Comparative Neurology. 181 (4), 681-715 (1978).
Rebola, N., Carta, M., Mulle, C. Operation and plasticity of hippocampal CA3 circuits: implications for memory encoding. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 208 (2017).
Papaleonidopoulos, V., Trompoukis, G., Koutsoumpa, A., Papatheodoropoulos, C. A gradient of frequency-dependent synaptic properties along the longitudinal hippocampal axis. BMC Neuroscience. 18 (1), 79 (2017).
Hampson, R. E., Simeral, J. D., Deadwyler, S. A. Distribution of spatial and nonspatial information in dorsal hippocampus. Nature. 402, 610 (1999).
Umeoka, S. C., Lüders, H. O., Turnbull, J. P., Koubeissi, M. Z., Maciunas, R. J. Requirement of longitudinal synchrony of epileptiform discharges in the hippocampus for seizure generation: a pilot study. Journal of Neurosurgery. 116 (3), 513-524 (2012).
Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65, (2010).
Milior, G., et al. Electrophysiological properties of CA1 pyramidal neurons along the longitudinal axis of the mouse hippocampus. Scientific Reports. 6, (2016).
Yang, S., et al. Interlamellar CA1 network in the hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (35), 12919-12924 (2014).
Tsien, J. Z., Huerta, P. T., Tonegawa, S. The Essential Role of Hippocampal CA1 NMDA Receptor–Dependent Synaptic Plasticity in Spatial Memory. Cell. 87 (7), 1327-1338 (1996).
Bliss, T., Collingridge, G. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361, 31-39 (1993).
Roman, F., Staubli, U., Lynch, G. Evidence for synaptic potentiation in a cortical network during learning. Brain Research. 418 (2), 221-226 (1987).
McNaughton, B., Barnes, C., Rao, G., Baldwin, J., Rasmussen, M. Long-term enhancement of hippocampal synaptic transmission and the acquisition of spatial information. Journal of Neuroscience. 6 (2), 563-571 (1986).
Sun, D. -g, et al. Long term potentiation, but not depression, in interlamellar hippocampus CA1. Scientific Reports. 8 (1), 5187 (2018).
Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).
Milner, A. J., Cummings, D. M., Spencer, J. P., Murphy, K. P. Bi-directional plasticity and age-dependent long-term depression at mouse CA3-CA1 hippocampal synapses. Neuroscience Letters. 367 (1), 1-5 (2004).
Bogerts, B., et al. Hippocampal CA1 deformity is related to symptom severity and antipsychotic dosage in schizophrenia. Brain. 136 (3), 804-814 (2013).
Ho, N. F., et al. Progressive Decline in Hippocampal CA1 Volume in Individuals at Ultra-High-Risk for Psychosis Who Do Not Remit: Findings from the Longitudinal Youth at Risk Study. Neuropsychopharmacology. 42, 1361 (2017).

Neuroscience

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.