Summary
Vi använde inspelning och stimulering elektroder i längsgående Hippocampus hjärnan skivor och longitudinellt placerad inspelning och elektroder stimulering i dorsala Hippocampus in vivo för att framkalla extracellulära postsynaptiska potentialer och demonstrera långsiktig synaptisk plasticitet längs den längsgående interlamellar CA1.
Abstract
Studiet av synaptisk plasticitet i hippocampus har fokuserat på användningen av CA3-CA1 lamellär nätet. Mindre uppmärksamhet har getts till den längsgående interlamellar CA1-CA1 nätverk. Nyligen emellertid, en förenings anslutning mellan CA1-CA1 pyramidala nervceller har visats. Därför, det finns ett behov av att undersöka om den längsgående interlamellar CA1-CA1 nätverk av hippocampus stöder synaptisk plasticitet.
Vi utformade ett protokoll för att undersöka närvaron eller frånvaron av långsiktig synaptisk plasticitet i interlamellar Hippocampus CA1 nätverk med elektrofysiologiska fältinspelningar både in vivo och in vitro. För in vivo extracellulära fältinspelningar, inspelningen och stimulering elektroder placerades i en septal-temporal axel av dorsala Hippocampus vid en longitudinell vinkel, att framkalla fält excitatoriska postsynaptiska potentialer. För in vitro-extracellulära fältinspelningar, Hippocampus längsgående skivor klipptes parallellt med septal-temporal planet. Inspelnings-och stimuleringelektroder placerades i stratum Oriens (S. O) och stratum radiatum (S. R) i hippocampus längs den längsgående axeln. Detta gjorde det möjligt för oss att undersöka riktnings-och lagerspecificitet framkallat excitatoriska postsynaptiska potentialer. Redan etablerade protokoll användes för att inducera långsiktig potentiering (LTP) och långvarig depression (LTD) både in vivo och in vitro. Våra resultat visade att den längsgående interlamellar CA1 nätverk stöder N-metyl-D-asparat (NMDA) receptor-beroende långsiktig potentiering (LTP) utan riktnings-eller lagerspecificitet. Den interlamellar nätverk, men i motsats till den tvärgående lamellär nätet, inte närvarande med någon betydande långsiktig depression (Ltd).
Introduction
Hippocampus har ofta används i kognitiva studier1,2,3. Det Hippocampus lamellära nätverket i den tvärgående axeln bildar Tri-Synaptic kretsar som består av dentate gyrus, CA3, och CA1 regioner. Det lamellära nätverket anses vara en parallell och självständig enhet4,5. Denna lamellära synvinkel har påverkat användningen av tvärgående orientering och tvärgående skivor för både in vivo och in vitro elektrofysiologiska studier av hippocampus. Mot bakgrund av framväxande forskning, lamellär hypotesen håller på att utvärderas6 och uppmärksamhet ges också till interlamellar nätverk av hippocampus. När det gäller Hippocampus interlamellar nätet har CA3 regionen länge undersökts7,8,9,10, men den longitudinella CA1 Hippocampus regionen har fått relativt lite uppmärksamhet tills nyligen. När det gäller den CA1 interlamellar nätverk, kortsiktiga synaptiska egenskaper längs dorsoventral longitudinella Hippocampus CA1 axel av råttor har visat sig variera11. Också, kluster av hippocampus celler som svarar på fasen och platsen befanns vara ordnade systematiskt längs den längsgående axeln av hippocampus hos råttor, genomgår en kortsiktig minne uppgift12. Också, epileptiska beslag aktiviteter befanns vara synkroniserade längs hela Hippocampus längs den längsgående axeln13.
De flesta studier av den longitudinella CA1 Hippocampus regionen har dock utnyttjat input från CA3 till CA1 regionerna11,14,15. Med hjälp av ett unikt protokoll för att göra longitudinella hjärn skivor, vårt tidigare arbete visat förenings anslutning av CA1 pyramidala nervceller längs den längsgående axeln och inblandade dess förmåga att bearbeta neuronala signalering effektivt16. Emellertid, det finns ett behov av att avgöra om den CA1 pyramidala nervceller längs den längsgående axeln utan tvärgående input kan stödja långsiktig synaptisk plasticitet. Detta konstaterande kan lägga till ytterligare en vinkel i utredningar av neurologiska frågor som rör Hippocampus.
Förmågan hos nervceller att anpassa effekten av informationsöverföring kallas synaptisk plasticitet. Synaptisk plasticitet är inblandad som den underliggande mekanismen för kognitiva processer såsom inlärning och minne17,18,19,20. Långsiktig synaptisk plasticitet visas som antingen långsiktig potentiering (LTP), som representerar förstärkning av neuronala svar, eller långvarig depression (LTD), som representerar försvagningen av neuronala svar. Långsiktig synaptisk plasticitet har studerats i tvärgående axel i hippocampus. Emellertid, detta är den första studien att demonstrera långsiktig synaptisk plasticitet i hippocampus longitudinella axeln av CA1 pyramidala nervceller.
Byggnad från ett protokoll som används av Yang et al.16, vi utformat protokollet för att demonstrera ltp och Ltd i hippocampus longitudinella axeln av CA1 pyramidala nervceller. Vi använde C57BL6 manliga möss med åldrar som varierade mellan 5-9 veckor gamla för in vitro-experiment och 6-12 veckor gamla för in vivo experiment. Denna detaljerade artikel visar hur longitudinella Hippocampus hjärn skivor från möss erhölls för in vitro-inspelningar och hur in vivo-inspelningar spelades in i den längsgående axeln. För in vitro-inspelningar, vi undersökte riktnings specificitet longitudinell CA1 synaptisk plasticitet genom att rikta septal och temporala änden av hippocampus. Vi undersökte också lagerspecificitet av den longitudinella CA1 synaptiska plasticitet genom inspelning från stratum Oriens och stratum radiatum i hippocampus. För in vivo-inspelningar undersökte vi de vinklar som bäst motsvarar den longitudinella riktningen i hippocampus.
Använda både in vivo och in vitro-extracellulära fältinspelningar, observerade vi att den longitudinellt anslutna CA1 pyramidala nervceller presenteras med LTP, inte LTD. Den tvärgående orientering som involverar både CA3 och CA1 nervceller, dock stöder både LTP och LTD. Skillnaden i Synaptic kapacitet mellan tvärgående och longitudinella orientering av hippocampus kunde spekulativt betyda skillnader i deras funktionella konnektivitet. Ytterligare experiment behövs för att dechiffrera skillnaderna i deras synaptiska förmåga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur behandlades i enlighet med de riktlinjer och förordningar från djuromsorg och användning av laboratoriet för National Institute of Health. Alla metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) av City University of Hong Kong och Incheon National University.
1. in vivo fält inspelning
- Djur beredning
- Injicera uretan (0,06 g per 25 g vikt) intraperitonealt att söva mus. Tillägg med intramuskulär injektion av atropin (0,05 mg/kg). Håll musen i en mörk lugn plats tills full anestesi träder i kraft.
FÖRSIKTIGHET: uretan har cancerframkallande potential. Hantera den med omsorg och Använd skyddskläder för att undvika kontakt med exponerad hud.
Obs: Alternativt kan isofluran användas som anestesi. - Kontrollera om djupet av anestesi intermittent tills en full kirurgisk plan av anestesi träder i kraft. Kontrollera om djupet av anestesi genom att utföra tå nypa, öra nypa, svans nypa och hornhinnan touch tester för att observera svaret av musen för att fysiska stimuli.
Anmärkning: en reflex eller frivillig rörelse bör inte iakttas när musen är på ett fullständigt kirurgiskt plan av anestesi. - För tå nypa test, förlänga antingen Hind eller framben av musen och nypa fast med ett par trubbiga tång eller fingrar. Musen är inte bekräftad för full bedövning om det drar benet eller skakar kroppen, har en observerbar ökad andningsfrekvens eller gör vokala ljud.
- För örat nypa test, nypa ändarna av Pinna med ett par trubbig pinkoppar eller fingrar stadigt. Full anestesi bekräftas inte om musen flyttar morrhår framåt, skakar på huvudet, gör sång ljud eller har en observerbar ökad andningsfrekvens.
- För svans nypa test, håll svansen på musen försiktigt och stadigt nypa med en trubbig forcep eller finger. Ingen svans rörelse, vokalt ljud eller observerad ökning av andningsfrekvens bör iakttas när fullt sövda för kirurgiska ingrepp.
- För hornhinnan touch test, vidrör hornhinnan i musen försiktigt, med en bomullsveke. Inga ögonlocks rörelser, morrhår rörelse eller observerbar ökning av andningsfrekvens bör iakttas när fullt sövda för kirurgi.
- Raka håret på halsen och skalle av musen.
- Placera den fullt sövda musen på en värmedyna inställd på 37 ° c och sätt in rektal temperatursonden i ändtarmen. Detta gör att värmen som produceras av värmeplattan att justera som svar på förändringar av musens kroppstemperatur.
- Applicera Eye Gel för att fukta ögonen på musen.
- Dra tungan ut på sidan av läpparna försiktigt med hjälp av tång och fixa de två främre tänderna i den andra eller tredje tänder hålet i stereotaktisk instrument. Fäst skalle av musen stadigt med hjälp av ögat-klämma.
Obs: Alternativt kan en stereotaktisk öron klämma användas. - Observation under ett mikroskop, separera subkutan vävnad och muskler i slutet av interparietala och occipital benet av musen med en skalpell att exponera Cisterna magna. Blot dura mater torr med en bomullspinne.
- Försiktigt punktera Cisterna magna genom att göra ett grunt snitt med en skarp spetsig skalpell blad att dränera cerebrospinalvätskan (CSF). Fäst en bomullspinne för att hålla tömning av CSF.
- Injicera uretan (0,06 g per 25 g vikt) intraperitonealt att söva mus. Tillägg med intramuskulär injektion av atropin (0,05 mg/kg). Håll musen i en mörk lugn plats tills full anestesi träder i kraft.
- Kraniotomi
- Håll huden på hårbotten med pinpett, klippa och ta bort huden med ett par kirurgiska saxar. Skär tillräckligt med hud för att exponera bregma och lambda märken på hårbotten. Håll den exponerade regionen torr.
- Justera den fastspända skalle av musen för att möjliggöra bregma och lambda punkter som skall justeras i en horisontell nivå av liknande höjd. Undvik vippning av huvudet i antingen främre-posteriort position eller mediala laterala positionen.
- Markera de punkter som motsvarar Hippocampus regionen med hjälp av en Vernier bromper. Använd musen hjärnan i en stereotaktisk koordinat bok som en referens för att avgöra de exakta koordinaterna.
Anmärkning: platsen att markera för snitt för Hippocampus är 1 mm x 3 mm på mittlinjen kallas anterior-posterior (AP) med bregma som referenspunkt, och 3 mm x 3 mm vinkelrätt mot mittlinjen (ML) för att ansluta punkterna på mittlinjen. De stereotaktiska koordinaterna ges som (AP: 1,3 och ML: 3, 3). - Gör ett snitt i skallen ovanför dorsala regionen i hippocampus längs de markerade punkterna med en skalpell eller höghastighets borr medan du observerar under ett mikroskop.
Anmärkning: en rektangulär formad öppning med en storlek på 2 mm x 3 mm bör erhållas efter snitt. Håll det exponerade området rent för att undvika skador på hjärnan. - Ta försiktigt ut den lösa kraniet med tång för att exponera dura mater och Använd en spruta eller pipett för att försiktigt applicera fysiologisk saltlösning för att hålla ytan fuktig.
- Ta bort dura mater försiktigt med nål eller vassa spetsiga spets pinps.
Obs: var noga med att inte orsaka någon skada på hjärnvävnaden under kraniotomi. Detta kommer att leda till svullnad i hjärnan och kommer att påverka resultaten. - Håll den exponerade hjärnvävnaden fuktig genom att använda fysiologisk saltlösning eller inert olja med hjälp av en pipett eller spruta.
- In vivo inspelning
- Fixera och positionera stimuleringen och inspelnings elektroden stadigt i stereotaktisk hållare. Justera stereotaktisk instrument enligt positionen för motsvarande AP och ml koordinater för stimulering och inspelning elektroder ovanför CA1 dorsala hippocampus.
Obs: Använd musen hjärnan i stereotaktisk koordinater som en guide för att lokalisera koordinaterna för den dorsala longitudinella CA1 Hippocampus regionen. Till exempel kommer en stereotaktisk koordinat för regionen CA1 Hippocampus att vara (AP 1,5, ml 1,0) för inspelnings elektroden och (AP 1,7, ml 1,5) för stimuleringelektroden. - Lokalisera den stimulerande elektroden i sidled till inspelnings elektroden i en längsgående riktning.
Se till att både stimulering och inspelnings elektroder är rena före användning. Detta förhindrar att brus införs vid inspelning. - För inspelningar, Använd multikanalelektroder. Leta först upp stereotaktiska koordinater för regionen CA1 Hippocampus med den första kanalen. Placera de återstående elektroderna så att vinkeln av stimulering och inspelnings elektroder är i intervallet 30 ° till 60 ° i förhållande till mittlinjen från bregma punkt.
Anmärkning: denna vinkel motsvarar den longitudinella orienteringen av regionen CA1 hippocampus. - Som en kontroll, lokalisera inspelningen elektroden ovanför CA1 regionen och stimulering elektroden ovanför CA3 regionen dorsala hippocampus. Till exempel, med hjälp av musen hjärnan i stereotaktisk koordinater som en guide, en stereotaktisk koordinat för CA1-CA3 Hippocampus regionen kommer att (AP 1,8, ml 1,0) för inspelningen elektrod och (AP 1,5, ml 1,5) för stimulering elektroden.
Anmärkning: det här steget är en alternativ kontroll och bör göras i ett separat experiment. - Placera referenselektroden i en distala del av den exponerade hjärnregionen eller under huden på musen.
- Slå på inspelningssystemet.
- Öppna programvaran för registrering och datainsamling.
Obs: olika laboratorier har sin föredragna programvara för inspelning och datainsamling. - Observera under Mikroskop, sänk inspelningen och stimulering elektroder långsamt med hjälp av micromanipulator tills det bara vidrör ytan av hjärnan. Markera punkten som nollpunkten för att börja beräkna det exakta djupet till Hippocampus regionen.
Obs: micromanipulatorn kan användas för att övervaka det djup vid vilket elektroden sätts in vid en given tidpunkt. Observera en ökning av impedansen precis när elektroden vidrör hjärn ytan. - Sänk långsamt elektroderna till det ungefärliga djupet som motsvarar de valda stereotaktiska koordinaterna för CA1 hippocampus.
Obs: Använd musen hjärnan i stereotaktisk koordinater som en guide för att få det ungefärliga djupet som motsvarar de valda stereo taktiska koordinaterna. - Ge stimulering (100 μs varaktighet, upprepas vid 30 s intervall) och justera elektrod djupet i steg om 50 μm eller mindre tills ett stabilt framkallat fält excitatoriska postsynaptiska potential (fEPSP) observeras.
Anmärkning: en stimulans på 20 μA är oftast tillräckligt för att framkalla en observerbar respons. - Se till att en stabil fEPSP har framkallat genom att variera stimulans intensitet. En anmärkningsvärd ökning av lutningen eller amplitud av fEPSP bör observeras med varje ökad stimulans intensitet. Detta kallas för input-output-kurvan. Skapa en input-output (I-O) kurva för att detektera maximal stimulans intensitet vid vilken det inte finns någon större ökning av lutningen på den framkallade fEPSP (figur 6).
Obs: kassera data och Byt elektrod position om fiber volley försvinner under experimentet. - Använd input-output-kurvan för att ställa in baslinjens intensitet till 40-50% av max. Använd motsvarande stimulans intensitet vid baslinje inspelning.
- Registrera den lokala fältpotentialen som baslinje för 20-30 min.
- Använd samma input-output kurva för att ställa in stimulus intensitet för framkalla högfrekvent stimulering (HFS) eller stelkramp till 75% av den maximala intensiteten. Alternativt, när inducera långvarig depression, bibehålla samma stimulans intensitet som används för att registrera baslinjen när framkalla lågfrekventa stimulering (AKU).
- Applicera en tetanisk stimulering av 100 Hz pulser 4 gånger med 10 s intervall för att inducera ltp.
Obs: Använd detta protokoll endast när du arbetar på ett långsiktigt potentiering experiment. - Applicera lågfrekvent stimulering av 5 Hz (900 stimuli under 3 min), 1 Hz LFS (900 stimuli under 15 min), eller 1 Hz Parade puls (50 ms Parade puls intervall, 900 par av stimuli under 15 min) att inducera LTD enligt redan etablerade protokoll.
Obs: Använd dessa protokoll endast när du arbetar på ett långvarigt depressions experiment. - Registrera den lokala fältetspotentialen för 1 h efter HFS eller LFS, alternativt.
- Exportera data och analysera med hjälp av programvaran.
- Kontrollera placeringen av inspelningen och stimulering elektroden genom att ge en stimulering av 10 μA ström för 30 s till lesion de inspelade områdena. Transcardially BEGJUTA musen med 4% PARAFORMALDEHYD och skörda hjärnan för skivning och färgning med cresyl violett enligt.
- Euthanize mus genom cervikal dislokation eller injektion av dödlig anestesi dosering efter experiment.
- Fixera och positionera stimuleringen och inspelnings elektroden stadigt i stereotaktisk hållare. Justera stereotaktisk instrument enligt positionen för motsvarande AP och ml koordinater för stimulering och inspelning elektroder ovanför CA1 dorsala hippocampus.
2. in vitro-registrering av fält
- Förbereda syrade skivning och artificiell cerebrospinalvätska (ACSF) lösningar
- För 2 L skivning lösning, tillsätt ca 1 L dubbeldestillerat vatten i en mätkolv och rör om kraftigt på en omrörare plattan.
- Lägg till följande skivning lösningskomponenter (i mM): 87,0 NaCl, 2,5 KCl, 1,3 NaH2Po4, 25,0 NaHCO3, 25,0 glukos, 75,0 sackaros, 7,0 mgcl2. 6H2o och 0,5 CaCl2∙ 2H2o (tabell 1).
Obs: Alternativt, MgCl2∙ 6H2o och CaCl2∙ 2H2o kan uteslutas i detta skede och läggas senare i en klar att använda volym. - Upp till 2 L med dubbelt destillerat vatten under omrörning.
- För 2 L ACSF, tillsätt ca 1 L dubbeldestillerat vatten i en mätkolv och rör om kraftigt på en omrörare platta.
- Lägg till följande ACSF-lösningskomponenter (i mM): 125,0 NaCl, 2,5 KCl, 1,3 NaH2Po4, 25,0 NaHCO3, 25 glukos, 1,0 mgcl2∙ 6H2o och 2,0 CaCl2∙ 2H2o (tabell 1).
Obs: Alternativt kan MgCl2. 6H2o och CaCl2∙ 2H2o uteslutas i detta skede och läggas till senare i en klar att använda volym. - Upp till 2 L med dubbelt destillerat vatten under omrörning.
- Installation och hjärnskivning
- Häll 400 ml redan preparerad skivning lösning i en separat kolv och syresätta (95% O2/5% Co2) för cirka 20 min.
- Förvara resten av 1,6 L-lösningen i ett kylskåp på 4 ° c. Håll lösningen upp till 1 vecka varefter den måste kasseras om den inte används för att undvika svamp tillväxt.
- Häll 200 mL av den syrade skivning lösningen i kolven, täck med parafilm och överför till en-80 ° c frys i ca 20 min för att göra en slush.
- Häll resterande 200 mL av skivning lösning i en hjärna slice hålla kammaren och hålla i en 32 ° c vattenbad med kontinuerlig bubblande.
- Förbered bänken för skivning. Placera pappershanddukar ner och kirurgiska verktyg på toppen av bänken. Ordna de kirurgiska verktygen i användningsordning för att underlätta en snabb och effektiv process (figur 7).
- Ta ut den kylda skivning lösningen från frysen och häll ca 50 mL i en bägare. Häll ca 10 mL i en petriskål som innehåller filtrerpapper för att fukta den. Placera dem på isen genom dissektion området.
- Häll resten av den slushed skivning lösning i skivning kammaren och fixa det på vibratome.
- Anesthetize musen med isofluran med hjälp av riktlinjer och förordningar om djuromsorg och användning av laboratoriet för nationella institutet för hälsa, och de godkända metoderna för institutionell djuranvändning och omsorg kommittén för City University of Hong Kong och Incheon National University.
- Halshugga den sövda musen med ett par sax och placera huvudet på silkespapper. Skär huden täcker skalle av musen och skär genom kutana muskler med sax. Skär skalle plattorna längs mittlinjen till occipital benet med kirurgisk sax.
- Öppna skallen med trubbiga pinps för att exponera hjärnan. Skopa försiktigt ut hjärnan med en spatel och placera den kylda skivning lösningen i bägaren. Vänta ca 30 s.
- Ta ut hjärnan med skeden och försiktigt placera den på den tidigare fuktade filtrerpapper i petriskål.
- Separera de två hjärn halvkloten längs mittlinjen med en skalpell blad. Isolera Hippocampus genom att försiktigt koppla loss den från cortex med en spatel och placera den försiktigt på det fuktade filterpapperet. Klipp ut septal och temporala slutet av isolerade Hippocampus med skalpell.
- Plocka upp den isolerade Hippocampus med en trubbig spatel och borste. Klappa försiktigt spateln på ett mjukpapper för att avlägsna överflödigt vatten.
- Applicera en liten mängd lim på den skivning plattan av vibratome.
- För en längsgående CA1 Hippocampus slice, bifoga CA3 regionen i hippocampus till skivning plattan med limmet. Snabbt men försiktigt placera den i den skivning kammaren av vibratome som innehåller den kylda oxygenerade skivning lösning.
- För den tvärgående skiva som kommer att fungera som en kontroll, bifoga den ventrala änden av hippocampus till skivning plattan av vibratome. Snabbt men försiktigt placera den i skivning kammare som innehåller den kylda syresatt dissektion lösning.
Obs: detta steg är ett alternativ till steget ovan och bör utföras separat. - Placera bladvinkeln på 90 °. Ställ in vibratome-parametrarna till en hastighet av 0,05 mm/s, en amplitud på 1,20 mm och en segment tjock lek på 400 μm.
- Skiva den bifogade Hippocampus med vibratome.
Notera: en bra längsgående CA1 Hippocampus hjärn skiva kommer att ha ett lager av CA1 och 2 lager av dentate gyrus. Högst 2 bra Hippocampus skivor kan erhållas. Alternativt, en tvärgående Hippocampus hjärn skiva kommer att ha dentate gyrus, CA3 och CA1 regioner intakt. - Överför den längsgående Hippocampus hjärnan skivor från vibratome med en pipett och inkubera det i hjärnan slice hålla kammaren i vattenbadet.
- Inkubera skivorna i vattenbadet i 20 minuter vid en temperatur på 32 ° c och ta ut rumstemperaturen i 30 minuter efter återvinning.
Obs: alternativt överföra hjärn skiva när ut ur vattenbadet och försiktigt placera den i inspelnings kammaren med flödande syresatt acsf vid en temperatur på 32 ° c för 30 min av återhämtning. - Medan inkuberande i vattenbadet, häll 400 ml av acsf lösning i en separat kolv och syresätta (95% O2/5% Co2) för cirka 20-30 min innan du överför hjärnan slice i inspelnings kammaren. Superfuse ACSF kontinuerligt i inspelnings kammaren med en hastighet på 2 mL/min.
- Slå på temperaturregulatorn för att värma flödande ACSF till 32 ° c.
- Förvara resten av 1,6 L-lösningen i ett kylskåp på 4 ° c. Förvara lösningen upp till en vecka efter vilken den måste kasseras om den inte används för att undvika svamp tillväxt.
- In vitro-inspelning
- Ställ in en inspelnings rigg genom att slå på all nödvändig maskinvara.
- Överför hjärn segmentet från segmentet som håller kammaren in i inspelnings kammaren. Justera positionen för hjärn skiva med trubbiga pinps och håll den på plats med en harpa. Låt ACSF att köra i minst 20 min. Detta gör att hjärn skiva att vara stabil innan inspelningen.
- Fyll inspelningspipetten med ACSF som en intern lösning.
- Kontrollera inspelningspipettmotståndet med angiven programvara. Den registrerande pipettresistensen bör vara inom intervallet 3-5 MΩ.
- Slå på programvaran för datainsamling. Denna programvara bör ha liknande funktioner som möjliggör datainsamling på ett liknande sätt som in vivo inspelningar som visas tidigare.
- Fixera inspelningen och stimuleringelektroderna stadigt i den stereotaktiska instrument hållaren. Placera referenselektroden i ACSF i inspelnings kammaren.
- För längsgående skivor, placera stimulering och inspelning elektrod i stratum Oriens (S.O.). Håll avståndet mellan elektroderna till ca 300 till 500 μm. Placera stimuleringelektroden på antingen septal eller temporala sidan av hjärnan slice och spela in från samma skikt (figur 8).
- Alternativt kan du placera stimuleringen och inspelnings elektroden i stratum radiatum (S.R.). Placera stimulering elektroden på antingen septal eller temporala sidan av hjärnan slice.
- För tvärgående skivor som en kontroll, placera den stimulerande elektroden på CA3 (Schaffer säkerheter Pathway) regionen, och inspelningen elektroden på CA1 regionen (figur 9).
Anmärkning: Detta är ett alternativt kontroll steg och bör utföras i ett separat experiment. - Slå på den isolerade stimulus Generator och ge stimulering (100 μs varaktighet, upprepas vid 30 s intervaller). Justera inspelningen elektrod djup och/eller position tills en stabil framkallat excitatoriska postsynaptiska fält potential observeras.
- Se till att en stabil fEPSP har framkallat genom att variera stimulans intensitet. En anmärkningsvärd förändring i lutningen på fEPSP bör observeras med varje förändring av stimulans intensitet. Detta kallas för input-output-kurvan. Skapa en input-output (I-O) kurva för att detektera maximal stimulans intensitet vid vilken det inte finns någon större ökning av lutningen på FEPSP (figur 6).
Obs: kassera data och Byt elektrod position om fiber volley försvinner under experimentet. - Använd input-output kurva för att ställa in stimulans intensitet för baseline inspelning och för att framkalla högfrekvent stimulering (HFS) eller stelkramp till 30-40% av den maximala framkallade fepsp.
- Alternativt, för experiment om LTD, använda input-output kurvan för att ställa in baslinjen intensitet för baseline inspelning och för att framkalla lågfrekventa stimulering (AKU) till 70% av den maximala framkallade fEPSP.
- Registrera den lokala fältpotentialen som baslinje för 20-30 min.
- Applicera HFS på 100 Hz pulser två gånger med 30 s intervall för att inducera LTP.
- Alternativt, för LTD experiment, tillämpa lågfrekvent stimulering av 5 Hz (900 stimuli under 3 min) eller 1 Hz LFS (900 stimuli under 15 min) eller 1 Hz Parade puls (50 ms Parade-puls intervall, 900 par stimuli under 15 min) att inducera LTD enligt redan upprättat protokoll.
- Registrera den lokala fältetspotentialen för 1 h efter HFS eller LFS.
- Exportera data och analysera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi undersökte långsiktig synaptisk plasticitet av längsgående CA1 pyramidala nervceller i hippocampus med hjälp av extracellulära fältinspelningar både in vivo och in vitro-. LTP och LTD är aspekter av långsiktig synaptisk plasticitet som har visats i den tvärgående axeln av hippocampus vara enkelriktad.
Vi visade här att använda längsgående Hippocampus hjärn skivor, det finns LTP i den CA1 längsgående axeln av hippocampus. Vi förberedde längsgående skivor av hippocampus längs septotemporal axeln, som är vinkelrät mot de tvärgående skivorna (figur 1). Med hjälp av inspelningar från regionen CA1 i hippocampus, visade vi närvaron av LTP som inte var riktningen specifika. Det fanns inga statistiskt signifikanta skillnader i inspelningarna från septal eller temporala (figur 2) sidan av den längsgående Hippocampus hjärn skiva. Vi visade också närvaron av LTP som inte var lagerspecifik; Således, inspelningar från både stratum radiatum och stratum Oriens (figur 2) visade framgångsrikt INDUCERAD ltp i den longitudinella hjärn skiva. Vi använde D-AP5, en NMDAR-antagonist för att visa att LTP inducerade var beroende av NMDA-receptorer (figur 3). Vad som händer in vitro återspeglar inte nödvändigtvis in vivo villkor, så vi undersökte LTP in vivo. Figur 4 a visar ett Schematiskt diagram av stimulering och inspelning elektrod placerad i dorsala Hippocampus längs den längsgående axeln av CA1 region in vivo. Placeringen av elektroderna som användes för inspelningen och stimulering kontrollerades av lesionsmärken och Crystal Violet-färgning (figur 4a). Vi visade närvaron av LTP in vivo i den longitudinella CA1 regionen (figur 4b).
Med hjälp av redan etablerade protokoll för inducera LTD, vi misslyckades med att framgångsrikt inducera LTD både in vivo och in vitro (figur 5).
Figur 1 . En schematisk ritning av tvärgående och längsgående Hippocampus hjärn skivor. Denna siffra är anpassad och modifierad från Sun et al. 201821. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . LTP i längsgående skivor. Synaptic svar på S.R. (a) eller S.O. (b) i längsgående skivor potentieras direkt efter stelkramp stimulering med både temporala och septal ingångar (S.R./temporal (n = 12, c), S.R./septal (n = 12, c), s.o./temporal (n = 10, d), s.o./septal (n = 9, d).
N står för antalet skivor. Felstaplar representerar SE. Denna siffra är anpassad och modifierad från Sun et al. 201821. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . NMDAR-beroende LTP i längsgående skivor. (a,b) LTP induktion i tidsmässig och septal riktning blockeras av 50 μM D-AP5 (temporal, n = 6, a) (septal, n = 5, b). (c,d) LTP induktion i temporal och septal riktning blockeras också av D-AP5. N står för skivor. Felstaplar representerar SE. Denna siffra är anpassad och modifierad från Sun et al. 201821. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . I vivo LTP i det interlamellära nätverket. a) enSchematisk ritning över inspelnings-och stimuleringelektroder hos sövda djur. Loci av inspelningen (på septal sidan av CA1) och stimulerande elektroder (på den temporala sidan av CA1) identifierades av lesion Marks. (b) ltp induceras i den interlamellära anslutningen med 100 Hz högfrekvent stimulering (HFS) (n = 10 möss). Färg spår: före (svart) och efter (röd) HFS. Felstaplar representerar SE. Denna siffra är anpassad och modifierad från Sun et al. 201821. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Frånvaro av in vivo och in vitro LTD i Interlamellar CA1 nätverk. (a) 1 Hz-PP LFS inducerar inte in vivo Ltd. (b) 1 Hz PP-ltp, (c) 5 Hz LFS, och (d) 1 Hz LFS producerar inte Ltd på antingen temporala eller septal sidor av längsgående hjärn skiva. medan LTD induceras av 1 Hz PP-LFS i tvärgående skivor: temporal (n = 8), septal (n = 11) och tvärgående (n = 6) med 1 Hz PP-LFS; temporala (n = 3) och septal (n = 3) med 5 Hz LFS; tidsmässiga (n = 3) och septal (n = 3) med 1 Hz LFS. N står för skivor. Felstaplar representerar SE. Denna siffra är anpassad och modifierad från Sun et al. 201821. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 . Input-output kurva presentera fEPSP lutning som svar på ökad stimulans input i hippocampus Brain slice. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 . Kirurgiska verktyg som används för Hippocampus isolering under in vitro-hjärnskivning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8 . En longitudinell hjärn skiva redo för inspelning. Stimuleringselektrod och inspelningspipett infogas i stratum radiatum. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9 . En tvärgående Hippocampus hjärn skiva redo för inspelning. Stimulering elektrod sätts in på Schaffer säkerheter CA3 region och inspelning pippette sätts in på CA1 region. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Sammansatta | Skivning lösning (mM) | ACSF (mM) |
| CaCl2. 2H2O | 0,5 | 2 |
| Glukos | 25 | 25 |
| KCl | 2,5 | 2,5 |
| MgCl2. 6H2O | 7 | 1 |
| Nacl | 87 | 125 |
| Nä2Po4 | 1,3 | 1,3 |
| NaHCO3 | 25 | 25 |
| Sackaros | 75 |
Tabell 1: koncentrationer av föreningar i hjärn skiva och konstgjorda cerebrospinalvätska lösningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet visar metoden för att inducera långsiktig synaptisk plasticitet in vivo samt från hjärn skivor i den longitudinella CA1-CA1 axeln i hippocampus in vitro. De steg som beskrivs ger tillräckligt med Detaljer för en försöksledare att undersöka ltp och Ltd i en längsgående Hippocampus CA1-CA1 anslutning. Övning behövs för att finslipa de färdigheter som krävs för att framgångsrikt registrera fält excitatoriska potentialer.
Förutom att behöva öva, det finns flera kritiska steg som är nödvändiga för att uppnå goda resultat. Först visades det tidigare att vinkeln som hjärn skivorna gjordes kan antingen trunkera eller bevara den longitudinella projektionerna av pyramidala nervceller i regionen CA1-CA1 i hippocampus16. Den longitudinella pyramidala nervceller projektet från de tvärgående nervceller i en vinkel som är nästan vinkelrät. Som CA1 nervceller propagera i olika vinklar inom Hippocampus, den longitudinella kopplingen mellan dem lägger ut längs dorsoventral axeln av hippocampus. Således, för in vitro-inspelning, måste försöksledaren hålla detta i åtanke att korrekt rikta den CA1-CA1 Hippocampus nervceller längs den längsgående axeln genom att skära den isolerade Hippocampus vävnad längs dorsala-ventrala axeln. Även för in vivo-inspelningar avgör den vinkel vid vilken stimulering och inspelnings elektroder är placerade huruvida de erhållna resultaten är representativa för den längsgående axeln eller en blandning av både tvärgående och längsgående axel. Ytterligare utredningar som utnyttjar CRISPR-Cas9 kan göras för att bekräfta om det framkallade svaret är enbart från regionen CA1 eftersom det kan vara en blandning av svar från både CA1-och CA3-regionerna.
För det andra, för in vitro-experiment, måste försöksledaren se till att hjärnan skivning lösning, ACSF, arbetsbänk och all utrustning eller instrument som kommer i kontakt med hjärnan slice är fria från föroreningar. Varje form av kontaminering kommer att leda till försämring av integriteten eller döden av hjärn skiva. Att upprätthålla en ren elektrod yta kommer att säkerställa bra och stabila inspelningar för både in vitro-och in vivo experiment.
Vi har visat att den longitudinella Hippocampus CA1 nätverket uppvisar nmdar-beroende LTPS, men inte Ltds. Den trisynaptiska kretsen, dock presenterar med både ltp och Ltd22,23. Detta innebär att den longitudinella CA1 nätverket och Tri-Synaptic kretsar har unika egenskaper. Vårt protokoll utnyttjar endast elektrofysiologiska inspelningar och är därför begränsade till att hitta skillnaden mellan dessa två nätverk.
Sökandet efter ett botemedel mot hjärnsjukdomar som schizofreni fortsätter. Nedgång eller deformitet av CA1 Hippocampus underregioner har kopplats till några schizofrena symtom24,25. Tillämpningen av vårt protokoll, men grundläggande, har lett till ljus en unik synaptisk förmåga av den CA1 longitudinella Hippocampus subregionen. Denna kunskap är användbar i utformningen av experiment som kan ytterligare undersöka denna handikappande hjärnsjukdom längs den längsgående CA1 axeln i hippocampus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Incheon National University (International Cooperative) forskningsbidrag. Vi kommer att vilja tacka MS gona Choi för att hjälpa till med vissa datainsamling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atropine Sulphate salt monohydrate, ≥97% (TLC), crystalline | Sigma-Aldrich | 5908-99-6 | Stored in Dessicator |
| Axon Digidata 1550B | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| Clampex 10.7 | |||
| D-(+)-Glucose ≥ 99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Eyegel | Dechra | ||
| Isoflurane | RWD Life Sciences | R510-22 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, BioXtra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
| Matrix electrodes, Tungsten | FHC | 18305 | |
| Multiclamp 700B Amplifier | |||
| Potassium chloride, BioXtra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous ≥99% | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | Stored in Dessicator |
| Pump | Longer precision pump Co., Ltd | T-S113&JY10-14 | |
| Silicone oil | Sigma-Aldrich | 63148-62-9 | |
| Sodium Bicarbonate, BioXtra, 99.5-100.5% | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | |
| Sodium Chloride, BioXtra, ≥99.5% (AT) | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic, powder | Sigma-Aldrich | 7558-80-7 | |
| Sucrose, ≥ 99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | 57-50-1 | |
| Temperature controller | Warner Instruments | TC-324C | |
| Tungsten microelectrodes | FHC | 20843 | |
| Urethane, ≥99% | Sigma-Aldrich | 51-79-6 | |
| Vibratome | Leica | VT-1200S | |
| Water bath | Grant Instruments | SAP12 |
References
- Levy, W. B. A sequence predicting CA3 is a flexible associator that learns and uses context to solve hippocampal-like tasks. Hippocampus. 6 (6), 579-590 (1996).
- Eldridge, L. L., Knowlton, B. J., Furmanski, C. S., Bookheimer, S. Y., Engel, S. A. Remembering episodes: A selective role for the hippocampus during retrieval. Nature Neuroscience. 3 (11), 1149-1152 (2000).
- Sullivan Giovanello, K., Schnyer, D. M., Verfaellie, M. A critical role for the anterior hippocampus in relational memory: evidence from an fMRI study comparing associative and item recognition. Hippocampus. 14 (1), 5-8 (2004).
- Andersen, P., Bland, B., Dudar, J. D.
- Andersen, P., Bliss, T. V. P., Skrede, K. K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways. Experimental Brain Research. 13 (2), 222-238 (1971).
- Sloviter, R., Lømo, T. Updating the Lamellar Hypothesis of Hippocampal Organization. Frontiers in Neural Circuits. 6 (102), (2012).
- Ishizuka, N., Weber, J., Amaral, D. G. Organization of intrahippocampal projections originating from CA3 pyramidal cells in the rat. Journal of Comparative Neurology. 295 (4), 580-623 (1990).
- Tamamaki, N., Nojyo, Y. Crossing fiber arrays in the rat hippocampus as demonstrated by three-dimensional reconstruction. Journal of Comparative Neurology. 303 (3), 435-442 (1991).
- Swanson, L., Wyss, J., Cowan, W. An autoradiographic study of the organization of intrahippocampal association pathways in the rat. Journal of Comparative Neurology. 181 (4), 681-715 (1978).
- Rebola, N., Carta, M., Mulle, C. Operation and plasticity of hippocampal CA3 circuits: implications for memory encoding. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 208 (2017).
- Papaleonidopoulos, V., Trompoukis, G., Koutsoumpa, A., Papatheodoropoulos, C. A gradient of frequency-dependent synaptic properties along the longitudinal hippocampal axis. BMC Neuroscience. 18 (1), 79 (2017).
- Hampson, R. E., Simeral, J. D., Deadwyler, S. A. Distribution of spatial and nonspatial information in dorsal hippocampus. Nature. 402, 610 (1999).
- Umeoka, S. C., Lüders, H. O., Turnbull, J. P., Koubeissi, M. Z., Maciunas, R. J. Requirement of longitudinal synchrony of epileptiform discharges in the hippocampus for seizure generation: a pilot study. Journal of Neurosurgery. 116 (3), 513-524 (2012).
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65, (2010).
- Milior, G., et al. Electrophysiological properties of CA1 pyramidal neurons along the longitudinal axis of the mouse hippocampus. Scientific Reports. 6, (2016).
- Yang, S., et al.
- Tsien, J. Z., Huerta, P. T., Tonegawa, S. The Essential Role of Hippocampal CA1 NMDA Receptor–Dependent Synaptic Plasticity in Spatial Memory. Cell. 87 (7), 1327-1338 (1996).
- Bliss, T., Collingridge, G. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361, 31-39 (1993).
- Roman, F., Staubli, U., Lynch, G. Evidence for synaptic potentiation in a cortical network during learning. Brain Research. 418 (2), 221-226 (1987).
- McNaughton, B., Barnes, C., Rao, G., Baldwin, J., Rasmussen, M. Long-term enhancement of hippocampal synaptic transmission and the acquisition of spatial information. Journal of Neuroscience. 6 (2), 563-571 (1986).
- Sun, D. -g, et al. Long term potentiation, but not depression, in interlamellar hippocampus CA1. Scientific Reports. 8 (1), 5187 (2018).
- Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).
- Milner, A. J., Cummings, D. M., Spencer, J. P., Murphy, K. P. Bi-directional plasticity and age-dependent long-term depression at mouse CA3-CA1 hippocampal synapses. Neuroscience Letters. 367 (1), 1-5 (2004).
- Bogerts, B., et al. Hippocampal CA1 deformity is related to symptom severity and antipsychotic dosage in schizophrenia. Brain. 136 (3), 804-814 (2013).
- Ho, N. F., et al. Progressive Decline in Hippocampal CA1 Volume in Individuals at Ultra-High-Risk for Psychosis Who Do Not Remit: Findings from the Longitudinal Youth at Risk Study. Neuropsychopharmacology. 42, 1361 (2017).
