Summary
多重蛍光免疫組織化学は、無傷のホルマリン固定、パラフィン埋め込み(FFPE)組織内の複数の細胞タイプの可視化を可能にする新しい技術です。抗体と試薬を最適化し、スライドを準備し、一般的な問題を回避するためのヒントを準備するための指示を持つ7色多重を成功させるためのガイドラインを提示します。
Abstract
細胞浸潤および空間組織の分析のための無傷の組織の微小環境評価は、疾患プロセスの複雑さを理解する上で不可欠である。過去に使用された原理技術には、免疫組織化学(IHC)と免疫蛍光(IF)が含まれており、1~4マーカーを用いて時間内に細胞をスナップショットとして可視化することができます。いずれの技術も、抗原性の低い標的を染色するのが難しい、種間反応性に関する制限を含む欠点を有する。IHCは信頼性が高く再現可能ですが、可視光スペクトルに対する化学の性質と依存性により、少数のマーカーしか使用できず、共ローカリゼーションが困難になります。IFの使用は潜在的なマーカーを広げるが、通常、ホルマリン固定後の広範な組織自己蛍光による凍結組織に依存する。フローサイトメトリーは、複数のエピトープの同時標識を可能にする技術であり、IFおよびIHCの欠陥の多くを損なうが、単一細胞懸濁液として細胞を調べる必要性は、重要な生物学的生物学的を廃棄する細胞の空間的文脈を失う関係。多重蛍光免疫組織化学(mfIHC)は、これらの技術を橋渡しし、全体的な微小環境アーキテクチャと空間を維持しながら、ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織におけるマルチエピトープ細胞表現を可能にします。無傷の組織内の細胞の関係。組織エピトープに共有結合する高蛍光強度蛍光蛍光ホルは、二次抗体による種特異的交差反応性を心配することなく、一次抗体の複数の応用を可能にする。この技術は、疾患の研究のための信頼性と正確な画像を生成することが証明されていますが、有用なmfIHC染色戦略を作成するプロセスは、広範な最適化と設計のために時間がかかり、厳密なことができます。現場で正確な細胞相互作用を表す堅牢な画像を作成し、手動分析の最適化期間を緩和するために、スライド準備、抗体の最適化、多重設計、エラーを示します。染色プロセス中に一般的に遭遇します。
Introduction
無傷の腫瘍微小環境(TME)の可視化は、固体悪性腫瘍における細胞浸潤だけでなく、細胞間相互作用も評価する上で不可欠である。多重蛍光免疫組織化学(mfIHC)は、癌および関連疾患1、2、3、4、および癌の研究における細胞の多抗原表現型の有効なツールとして出現した。 5,6,7.これは、大きなデータセットを分析するように設計された新しいソフトウェアおよびプログラムと組み合わせることで、セル1、2、4間の複雑な相互作用の観察を可能にする。データ取得におけるレート制限係数は、多くの場合、分析前の染色組織の品質です。
TMEで細胞を表現するために使用される以前の技術には、免疫組織化学(IHC)、免疫蛍光(IF)およびフローサイトメトリーが含まれており、そのすべてが重要な制限を提示する。IHCは、最も頻繁に1つの抗体によって染色される前に、脱パラフィン化および水分補給されるホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織セクションを使用しています。ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体および化学反応の使用は、単一の抗原エピトープ8の可視化を可能にする。IHCは信頼性が高く、作業が容易なFFPE組織に対して行われるが、可視光スペクトルに対する制限は、1つまたは2つのマーカーのみが非常に困難な抗原の信頼できる区別およびコローカライズできることを意味する8。利用可能なマーカーを拡大し、したがって、単一のセクションでプローブすることができる抗原を拡大する方法は、視覚スペクトルのより広い範囲の使用を可能にする蛍光に変更することです。IFの場合、凍結またはFFPE組織は、様々な蛍石に結合されるスライドおよび抗体上に移される。これにより、プローブできる抗原の数が増加しますが、いくつかの重要な制限があります。第一に、各抗体は通常、蛍光素が1つしか付着していないため、明るさは組織の自己蛍光を克服するのに十分な強さではないことが多い。このため、ほとんどのIFは貯蔵が高価で作業が困難な凍結組織に対して行われる。特に非共役抗体を使用する場合は、スペクトルの重なりと異種反応性のために使用できる蛍光タグの限られた数が利用可能です。フローサイトメトリーは、新鮮な組織処理を単一細胞懸濁液に処理し、蛍光抗体による標識を行い、数十年にわたり免疫フェノタイピングのゴールドスタンダードとなっています9,10。フローサイトメトリーの利点は、ほとんどの場合が結合されているように、種の交差反応性を気にせずに複数の抗体にラベルを付ける能力です。細胞は人間の目ではなく機械によって「視覚化」されるので、利用可能な蛍煙がはるかに多くありますが、これはコストがかかります。報酬は手動で行う必要があり、誤った正と負の母集団を生み出す結果を大幅に変更する可能性があります。フローサイトメトリーの最も重要な制限は、組織アーキテクチャと、その後、すべての空間情報が単一細胞懸濁液の必要性によって失われるということです。
自動蛍光顕微鏡を用いた多重蛍光免疫組織化学(mfIHC)は、IHC、IF、フローサイトメトリーの利点を組み合わせ、シグナル増幅による多抗原組織染色を可能にし、補償を必要とせずに空間的な関係を保持します。FFPE組織は、抗原検索後、目的の標的抗原に一次抗体適用のラウンドを受け、続いてIHCと同様のHRP化学タグを有する二次抗体を受ける荷電スライド上に置かれる。二次抗体の配置後、HRP特異的反応は、蛍色素が目的のエピトープ11に共有結合する結果をもたらす。組織が標識されると、スライドを加熱する別のラウンドが完了し、組織エピトープ11に結合した蛍光タグのみを残して、以前に適用された一次および二次抗体複合体を除去する。これにより、任意の種の複数の抗体を、交差反応性11、12を気にすることなく再適用することができる。複数の蛍光色素の手動補償の必要性を最小限に抑えるために、核カウンター染色を含むスペクトルの重みがほとんどない蛍光色素のコレクションを使用してmfIHCを完成させる。FFPE組織で遭遇した自己蛍光を考慮して、ソフトウェアは、蛍光色素に続く抗原特異的蛍光の強さのために可能である空白のスライドからの画像を使用して、最終的な画像から自己蛍光を減算します。信号増幅。大規模なデータセット用に設計された新しいプログラムを使用して、セルの位置を識別し、空間コンテキスト 1、2、4を分析できます。この手法の最も重要な制限は、最適化時間です。実験設計と染色およびイメージング戦略の手順を含む詳細な方法論がここに見つかります。mfIHCは、手動技術を使用して、無傷のFFPE組織における細胞間相互作用の空間的コンテキストをよりよく理解したい、最適化された自動染色システムを現在持っていない実験室に役立ちます。
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Protocol
すべての作業は、ミシガン大学の内部審査委員会によって承認されています。
1. 一次抗体とスライド製剤の最適化
- 従来のIHCを用いて多重化に対する抗体の理想的な濃度を決定する。
- 手動従来の免疫組織化学(IHC)13により多重化の抗体を試験する。
- CD3抗体検査に扁桃組織を使用するなど、検査された抗体ごとに豊富な細胞型を持つ特定の組織を使用します。
- 同社が推奨するIHCの基準濃度を使用し、推奨濃度の抗体濃度と推奨濃度の上下濃度でIHCを完了します。
- ホルマリン固定パラフィン埋め込み組織をスライド上に準備します。
- マイクロトームを使用して、4と6 μmの間の厚さでFFPE組織のブロックを切断し、充電されたスライドに適用します。
注:蒸留水を使用すると、多重を通じて適切な組織の取り付けと付着が保証されます。 - スライドを平らにし、ティッシュ側を上に置き、一晩37°Cで乾燥させます。
- 多重化を完了する準備ができるまで、極端な温度から離れたスライド ボックスにスライドを格納します。
- マイクロトームを使用して、4と6 μmの間の厚さでFFPE組織のブロックを切断し、充電されたスライドに適用します。
2. 一般的な染色方法
- 洗浄および抗原検索溶液の調製
- 脱イオン水の9L、トリス緩衝生理生理生理(TBS)の1L、ポリソルベート20の10mLを混合して0.1%TBSTの洗浄液を調製する。
- 両方の抗原検索溶液(pH 6およびpH9;)材料の表)脱イオン水で1xに希釈することによって。
- 脱パラフィン化と水分補給
- スライドを焼き、平らに横たわり、組織側を60°Cで1時間ハイブリダイゼーションオーブン1で焼く。オーブンからスライドを取り外し、少なくとも5-10分間冷却し、垂直スライドラックに置きます。
- 以下の溶液中のスライドを順次処理する:三重のキシレン、続いて100%エタノール、95%エタノール、最後にスライド染色セット1を用いてそれぞれ10分間70%エタノールの単一処理を行う。
- プラスチック製のスライドボックスに浸漬し、その後、30分間13分間、中性バッファホルマリンで満たされたプラスチック製のスライドボックスに沈むことで、脱イオン水で2分間スライドのラックを洗います。スライドを脱イオン水で2分間洗い、抗原の回収に進みます。
- 抗原検索
- スライドのラックを、pH 6 または pH 9 抗原検索バッファーで内部ライン (約 300 mL) に充填された耐熱ボックスに入れます。
注:抗原検索バッファーは、エピトープごとに最適化する必要があるpH6またはpH9のいずれかでありうる。しかし、核エピトープに結合する抗体にはpH9を使用し、他のすべての抗体に対してpH6を使用します。 - 箱をプラスチックラップで覆い、ゴムバンドを使用して固定します。回転板の端にある電子レンジに箱を入れます(マイクロ波は、加熱するインバータ技術を備えておく必要があります)。100%の電力で45sのスライドを熱し、20%の電力13で15分続きます。
注:マイクロ波処理は、使用するマイクロ波によって最適化が必要な場合があります。 - スライドを約15~20分間冷やします。
- スライドのラックを、pH 6 または pH 9 抗原検索バッファーで内部ライン (約 300 mL) に充填された耐熱ボックスに入れます。
- スライドが涼しい間、抗体および蛍煙素の働く解決を準備する。
- ウシ血清アルブミン顆粒の0.5gをTBSTの50mLに溶解することにより、一次抗体希釈剤を調出す。あるいは、顆粒を溶解するために1xリン酸緩衝生理食べ物(PBS)の50 mLを使用します。
- 各一次抗体作業溶液を、セクション1で決定した最適化濃度に対して、一次抗体希釈液で作る。スライドあたり約 200 μL と見積もる。
- 1:100の濃度で蛍油希釈液中の各蛍油を希釈することにより、蛍油作動溶液を調剤する。
注:これは、抗体に応じて最適化する必要がある場合があります。スライドあたり約 100 μL と見積もる。 - 染色の最終日に、TBSTの1mLにDAPIの3滴を加えることによって4',6-diamidino-2-フェニリンドール(DAPI)作業溶液を調製する。
- スライド染色(洗浄・遮断)
- 冷却後に電子レンジから箱を取り出し、プラスチックラップを取り外し、2分間脱イオン水でスライドを洗い、続いてプラスチック製のスライドボックスで2分間洗浄し、TBST13を充填したプラスチック製のスライドボックスで2分間洗浄する。
- 繊細なタスクで組織の周りの各スライドを乾燥させた後、組織が乾燥しないように注意して拭き取り、疎水性バリアペンを使用して組織の外側をトレースします。繊細な作業ワイプやペンでティッシュに触れないでください。
- 各スライドを加湿室に置き、組織にブロッキング溶液(約4滴)を追加します。室温(RT)で10分間インキュベートします。
- スライド染色(一次抗体塗布)
- 各スライドを取り、ペーパータオルのスタック上のスライドの側面をタップし、組織の周りから余分なブロッキング剤を除去するために繊細なタスクワイプを使用して、ブロッキング溶液を削除します。
- スライドを加湿室に戻し、働く一次抗体の約200 μLを追加します。RTで1時間加湿室でインキュベートします。
- トリプリケート13で浸漬して2分間TBSTで洗浄します。
注:各洗浄ステップの後、TBSTを変更すると、よりクリーンなイメージを確保するのに役立ちます。
- スライド染色(二次抗体塗布)
- 各スライドから残りのTBSTを塗布し、約3~4滴の二次抗体(ウサギとマウスの二次HRP結合抗体の混合物)を塗布する。RT13で加湿室で10分間インキュベートする。
注:マウスまたはウサギ以外の二次抗体を必要とする一次抗体を使用する場合、または代替二次抗体を使用することを選択する場合は、適切なHRP結合二次をスライドに適用し、RTで45分間インキュベートします。代替二次14にはインキュベーション時間が必要な場合がある。 - インキュベーション後、TBSTで2分間三部13で洗う。
- 各スライドから残りのTBSTを塗布し、約3~4滴の二次抗体(ウサギとマウスの二次HRP結合抗体の混合物)を塗布する。RT13で加湿室で10分間インキュベートする。
- スライド染色(蛍色素塗布)
- フルオロフォア作動液の約100 μLを適用し、RTの加湿室で10分13のインキュベートする。
- 三つ三つ13で2分間TBSTで洗います。
- 抗体の除去
- マイクロ波スライド(100%で45s、20%で15分)抗体13、14の除去のための耐熱ボックス(ステップ2.3.2を参照)で。
注: これで、多重の 1 ラウンドが完了します。これは、プロトコルを一時停止できる唯一のポイントです。プロトコルを一時停止するには、スライドを室温で一晩抗原検索バッファーに沈めたままにしておきます。
- マイクロ波スライド(100%で45s、20%で15分)抗体13、14の除去のための耐熱ボックス(ステップ2.3.2を参照)で。
- 染色の追加のラウンドを続けます。抗体-フルオロフォアペアの残りの部分について、ステップ2.5.1−2.9.1を繰り返します。すべての抗体と蛍煙管が使用されたら、セクション2.11に進みます。
- DAPI アプリケーションとマウント
- 多重化における最後の染色ラウンドの後、抗原検索液pH 613を用いて最後の抗体塗布を除去する。脱イオン水で洗い、その後TBSTを2分ずつ13分ずつ洗う。
- 作業DAPI溶液の約150 μLをスライドに適用し、RT1で10分間加湿室でインキュベートします。
- 約30sのTBSTで洗浄し、アンチフェードマウントでカバースリップをマウントします。取り付けメディアが乾いてカバースリップを固定するために、カバースリップの四隅に明確な指のマニキュアを適用します(オプション)。
3. ライブラリ、モノプレックス、マルチプレックスの詳細
- 蛍煙素ライブラリを構築するためのスライドを選択します。
- 7色多重化のために、ライブラリ用の7つの免疫細胞豊富な組織スライド(すなわち、扁桃、脾臓など)を収集する。
注: マルチプレックスで使用される各固有の蛍ッ素を表す各スライドを持つ蛍煙素ライブラリに使用するコントロール スライドを選択します。コントロールスライドは、選択の豊富なエピトープを持っている必要があり、各フルオロフォアのための組織の同じタイプであってもよいです。
- 7色多重化のために、ライブラリ用の7つの免疫細胞豊富な組織スライド(すなわち、扁桃、脾臓など)を収集する。
- モノプレックスおよび多重で使用するためのステインおよびイメージ ライブラリ スライド。
- 選択したコントロールスライドとコントロールティッシュスライドを使用して、ステップ2.1−2.9.1に従ってください。1:100の濃度で各スライドに異なる蛍色素を置きます。1 つのスライドに DAPI のみを含める必要があります。
- DAPI 染色を省略する場合を除き、セクション 2.11 に進み、代わりに TBST とマウントを使用します。
- スライドを一晩乾燥させた後、DAPI、CY3、CY5、CY7、テキサスレッド、半導体量子ドット、蛍光線イソチオシアネート(FITC)を備えた画像を備え、飽和保護機能1で250ミリ秒に露出を設定します。
注: 露出時間は 50−250 ミリ秒13に設定できます。 - ライブラリイメージをソフトウェアにアップロードし、モノプレックスとマルチプレックスの解析に使用します。
- モノプレックスのスライドを選択します。
- 最適化された抗体に基づいて、豊富なエピトープを持つコントロールスライドを選択します(セクション1)。多重で行われる染色のラウンドごとに、その数のコントロール スライドを選択してモノプレックスを作成します。
注:モノプレックスの目的は、多重で使用される各抗体に最適な位置(順序)を決定することです。
- 最適化された抗体に基づいて、豊富なエピトープを持つコントロールスライドを選択します(セクション1)。多重で行われる染色のラウンドごとに、その数のコントロール スライドを選択してモノプレックスを作成します。
- ステインモノプレックス。
- 各スライドの異なる順序(位置)で一次抗体を使用してセクション2.1−2.11に従ってください。各スライドには、他のスライドとは異なる順序(位置)に適用される一次抗体が1つだけ必要です。
注:ラウンドが一次抗体または蛍河野を呼び出さない各スライドについて、代わりに一次抗体希釈剤および蛍油溶剤13を使用する。
- 各スライドの異なる順序(位置)で一次抗体を使用してセクション2.1−2.11に従ってください。各スライドには、他のスライドとは異なる順序(位置)に適用される一次抗体が1つだけ必要です。
- 画像スライドを行い、モノプレックスを解析します。
- 顕微鏡を使用し、すべてのチャンネルで露出時間を250ミリ秒に設定すると、DAPIを使用して各画像をキャプチャして焦点を合わせます。
注: 露出時間は 50−250 ミリ秒14に設定できます。 - 分析ソフトウェアを用いて、染色されたマーカーの蛍光強度を見て各モノプレックススライドを評価する。
- この強度を背景と比較します。背景の 5~10 倍以上の高さである場合、そのスライドの位置は、最終的な多重で使用するのに最適な位置です。
- 顕微鏡を使用し、すべてのチャンネルで露出時間を250ミリ秒に設定すると、DAPIを使用して各画像をキャプチャして焦点を合わせます。
- マルチプレックスのスライドを選択します。
- 目的のスライドを選択し、染色とイメージング後の自己蛍光を減算するための空白のスライドとして使用する余分なスライドを追加します。
- 多重を染色します。
- モノプレックス結果に基づいて、ステップ3.5.3に基づいて、各抗体の適切な順序(位置)を選択します。各蛍煙素を抗体に割り当てます。
注: これは最適化が必要な場合があります。しかし、より少ないマーカー1に対して明るい抗体を使用する計画は、共局所抗体は互いに遠いスペクトル13の蛍色素と一致するべきであり、スペクトル540と570を有する蛍敵は共局所化されるべきではない。スペクトルオーバーラップ問題1. - セクション2.1−2.11に進み、ブランクスライドが一次抗体、蛍油、またはDAPIを受け取らないようにし、代わりに抗体希釈剤、蛍油剤希釈剤、およびTBSTをそれぞれその場所で使用します。
- モノプレックス結果に基づいて、ステップ3.5.3に基づいて、各抗体の適切な順序(位置)を選択します。各蛍煙素を抗体に割り当てます。
- 画像多重化と染色の完全性を分析
- 顕微鏡を使用し、すべてのチャンネルの露出時間を250ミリ秒に設定し、DAPIを利用して各画像を撮影してピントを合わせます。
- 分析ソフトウェア(材料の表)を使用して、蛍光偽色で各多重を評価する。
注: 明確な画像は、各マーカーを明確に示す必要があります。マーカーが拡散して粒状に見える場合、または存在しない場合は、マーカーが機能せず、再最適化する必要があります。 - 解析ソフトウェアを使用して、病理学ビューによって各多重を評価します。病理学ビューは、各マーカーの特異性を確認します。以前に最適化された IHC と比較します (セクション 1)。
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Representative Results
7色多重アッセイを得る全体的なプロセスは、反復パターンに従う。図 1は、プロセスを図式形式で記述します。スライドを切断して乾燥させたり、実験室から受け取り、60°Cのハイブリダイゼーションオーブンで1時間焼き上げたら、デパラフィン化と水分補給に進み、再びホルマリンでスライドを固定し、抗原の検索を行います。多重化の各ラウンドは抗原検索から始まり、抗体除去で終了します(図1)。
プロセスの各ステップの最適化は、明確で使いやすいイメージを実現するために最も重要です。抗体は、各抗体に対してpH6およびpH9を有する抗原検索バッファーを使用して、その特定の抗体に最も適した抗原検索バッファーを視覚化するために、まずIHCによって試験されるべきである。一般に、核標的はバッファーpH9で抗原検索に応答する。例えば、FOXP3は、pH9の抗原検索バッファーを使用する場合に最適であり、pH6の抗原検索バッファーに最適なCD3とは対照的に使用されます。IHC プロセスから取得したイメージは、多重解析の特異性を検証するために使用する必要があります。
多重内の各抗体の順序を決定するには、モノプレックスが必要です。4色または7色のキットのいずれかを使用する場合、各抗体は配列内で好ましい順序を持つことになります。使用される抗体の数については、適切な対照スライドを収集します(すなわち、1色がDAPIである7色多重の場合は、6つの他のフルオロフォリーに対して6つの組織特異的代表制御スライドを選択します)。図 2A-Cは、FFPE大腸癌組織を用いた3つのスライドを用いたモノプレックスアッセイの概略表現である。各スライドは、そのタグとして蛍動管570を使用して、配列内の異なる位置にFOXP3を持っています。DAPIは、核を適切に可視化するためのカウンター染色として使用されます。図3では、異なるFOXP3位置を持つモノプレックスと多重の代表的な画像を示す。図3A、FOXP3が3番目の位置にあるB(図2Cに示す順序に対応)では、明るい核染色図3Aと共局所化によって示されるように、FOXP3(赤色)の特異的かつ堅牢な染色が示されている。CD3図3Bと.蛍色素シグナル強度は、組織図3Aの他の場所に非特異的染色することなくFOXP3の特異性を確認する。図3Cでは、FOXP3が最初の位置にある場合(図2Aの順序に対応する)、FOXP3の非特異的染色がある。赤色カバーの粒状拡散領域は、これらの領域のスライドと蛍光強度の大部分が1未満である。モノプレックスを最初に完了せずに多重を行おうとすると、染色の順序をテストすると同様の結果が生じ、試薬が無駄になります。多重プロセスで見落とすことができないもう一つの重要なステップは、DAPI染色です。作業 DAPI カウンターステインは、解析ソフトウェアを使用した細胞識別およびさらなる空間解析の基礎となります。重要なコントラストは、図 3Eの作業 DAPI (青) を持つ合成イメージと、図 3Fの非動作 DAPI で確認できます。図3Fの画像は、解析ソフトウェア内の細胞を識別するために使用できなかった。多重化および組織分析を救出する試みでは、カバースリップはTBSTにスライドを浸すことによって除去され、続いてDAPIの追加適用を伴うpH 6抗原検索バッファーにおけるマイクロウェーブステップが続く。
モノプレックスアッセイが完了し、最適な抗体の順序が確認されたら、多重化戦略を構築することができます図4.すべてのターゲットに異なる蛍煙管を選択する必要があります。各蛍光色素に関連する数は、フローサイトメトリーと同様に、励起後に放出されるスペクトル蛍光波長を表す。提案された抗体を蛍光体と照合し、スペクトルの重なりとマーカーの潜在的な出血を制限する場合は注意が必要です。良い戦略は、鮮明な画像とより信頼性の高い表現型13を提供する余分なスペクトルの重なりを減らすために抗体を共局所化するために互いに遠く波長を選択することです。例えば、表示される多重化戦略(図4)において、CD8は蛍素570と対され、CD3は蛍素520と対合される。これらは最も無差別であり、結果を損なう可能性があるため、共局所的な標的での蛍機540および570の使用を避ける必要があります。Fluorophore 620は非常に明るい傾向があり、組織に豊富でない抗体に使用されるべきである。各蛍光素の基準として使用される最近のライブラリは、蛍光体のスペクトルオーバーラップを減らすのにも役立ちます。合成画像からの自己蛍光抽出を確実にするためには、抗原検索のすべてのラウンドを経る空白のスライドが必要です。このブランクスライドは、働く一次抗体および蛍油性抗体の代わりに除く多重スライドと同じ処置を受け、抗体希釈剤および蛍油希釈剤はそれぞれ図4Bを用いられる。
マルチプレックス設計が適切に機能し、合成画像に表示されるマーカーが特定であることを確認するには、顕微鏡ソフトウェアを使用して「ブライトフィールド」設定オプションと組み合わせて「病理学画像」を使用します。セクション1で説明した前のIHCアッセイと比較した。残念ながら、美しい合成画像は必ずしも正確な汚れを反映していない可能性があり、これはプロセスを品質管理し、偽陽性の結果を防ぐための重要なステップです。図 5Aは、最初の問題なく合成イメージを示しています。CD3は可視化され、特定の染色(緑色)を示し、図5Bの病理明視野画像によって確認される。CD163(オレンジ色)は、合成画像に見られます(図5A)。しかしながら、CD163(図5C)の病理明視野図を評価する際に、抗体は非特異的である。特定の染色を伴う最適な多重画像の例を合成画像で示す(図5D)。CD3およびCD163特異性は、病理学明視野(図5Eおよび図5F)を用いて確認され、これらの抗体を用いて行われた以前のIHCアッセイと有利に比較される(図図5F)。
図1:染色ワークフロー図。
この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:モノプレックス開発。
(A) 位置1にFOXP3を持つ大腸癌スライド。(B) 位置2にFOXP3を持つ大腸癌スライド。(C) 位置3にFOXP3を持つ大腸癌スライド。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: モノプレックスと多重の成功と落とし穴。
(A)位置3にFOXP3を有する原発性大腸癌のモノプレックスアッセイ、蛍光強度標識が示す。(B) 位置3にFOXP3、2位にCD3を持つ原発性大腸癌の多重アッセイ。(C)位置1にFOXP3を有する原発性大腸癌のモノプレックスアッセイ、蛍光強度標識が示す。(D) 位置1にFOXP3、2位にCD3を持つ原発性大腸癌の多重アッセイ。(E) 抗体の順序を持つ原発性大腸癌の多重アッセイ:CD8(黄色)、CD3(緑色)、CD163(オレンジ)、パンサイトケラチン(白色)、PD-L1(マゼンタ)、FOXP3(赤)、働くDAPI(青)。(F)抗体の順序を持つ原発性大腸癌の多重アッセイ:CD8(黄色)、CD3(緑色)、CD163(オレンジ)、パンサイトケラチン(白)、PD-L1(マゼンタ)、FOXP3(赤)、非動作DAPI(青)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: 多重化の開発。
(A) 7色多重における大腸癌の多重スライド。(B) 大腸癌組織を用いた7色多重のブランクスライド。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: 7 色多重の特異性を解析する。
(A) 抗体を用いた多重合成画像:CD8(黄色)、CD3(緑色)、CD163(オレンジ)、パンサイトケラチン(白色)、Ki67(赤)、DAPI(青)。(B) CD3上のパネルAの画像の病理学明視野図のみ。(C) CD163上のパネルAの画像の病理学明視野図のみ。(D) 抗体を用いた多重合成画像:CD8(黄色)、CD3(緑色)、CD163(オレンジ)、パンサイトケラチン(白色)、PD-L1(マゼンタ)、FOXP3(赤)、DAPI(青)。(E) CD3のみのパネルDの画像の病理学明視野図。(F) CD163上のパネルDの画像の病理学明視野図のみ。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
固形腫瘍生検および外科的切除からの無傷の組織標本は、疾患分析および患者の予後のための重要な診断および予測ツールのままである。多重蛍光免疫組織化学(mfIHC)は、免疫組織化学(IHC)、免疫蛍光(IF)およびフローサイトメトリーの利点を組み合わせた新しい技術です。その場で細胞をプローブする以前の方法は、組織環境8における細胞間配置の評価を可能にしたが、しかし、プローブできるエピトープの数が少ないため、複雑な分析が制限される。フローサイトメトリーは、検体中の多くの細胞型を分析するのに有用であるが、単一細胞懸濁液9、10としてサンプルを準備することにより空間的文脈を失う。mfIHCは、細胞微小環境の空間コンテキストを保持し、標識されたエピトープ11当たりの信号を増幅しながら標識することができるエピトープの数を増やすことによって、これらの技術を橋渡しする。これまでの研究では、がんおよび非癌組織標本1、2、3、4、5、15における細胞浸潤を表現するためにmfIHCを使用している。ポスト画像解析は、組織微小環境1、2、4内の細胞および構造の空間的関係を分析するためにも使用されている。信頼性の高い解析を行うには、まず特定の正確な画像を作成する必要があります。手動染色技術は、自動染色システムとは対照的に、この技術へのより小さく、コスト意識の高い実験室へのアクセスを可能にします。最適化時間と染色時間は、さらなる空間解析のための信頼性の高い画像を達成するための最大の障壁の一つです。
いくつかの一般的なルールは、信頼性の高い複合多重イメージの生成が成功する可能性を高め、時間とリソースを節約します。多重化で使用される抗体は、手動の従来のIHCでの成功に基づいて選択されるべきである。pH6およびpH9を有する抗原検索バッファーは、多重化で使用するための適切な抗原検索を調査するためにIHCに使用されるべきである。モノプレックスの開発は、多重化プロトコル内の抗体の配置を同定するために必要である。この根拠は複雑であり、組織標本とエピトープの間で異なります。場合によっては、エピトープは複数のマイクロウェーブステップで劣化し、マーカーの視覚化が失われる場合があります(CD3の場合と同様)。しかし、FOXP3は、より多くのマイクロウェーブステップで明るくなり、多重13、14の第1または第2ラウンドに置かれた場合、ほとんど見えません。
染色プロセスは、充電されたスライドにFFPE組織をカットして始まります。発生する可能性のある最初の問題は、マイクロウェーブ後にスライドから落ちる組織です。電荷を帯びたスライドを使用しない場合、ガラス表面への組織の付着が制限され、組織は過度の折りたたみを有するか、または完全に滑り落ちる可能性がある。さらに、染色プロセス中に組織がスライドに付着することを確実にするために、いくつかの技術が行われる。まず、スライドにブロックを切断しながら、水の最も純粋な形が最も効果的です。一部の研究室では、脱イオン水で十分かもしれませんが、蒸留水が最もうまくいきました。スライドは、一晩37°Cで切断した直後に平らに乾燥する必要があります。さらに密着を確保するために、スライドはハイブリダイゼーションオーブンに入れ、使用直前の1時間60°Cで平らに焼かれます。ホルマリン固定は初期組織調製プロセス中に既に起こっていますが、デパラフィン化および水分補給プロセス後30分間中性緩衝ホルマリンにスライドを配置すると、マウントされた構造の完全性が向上します。ティッシュ1、13。
手動染色プロセスは、使用される抗体の数に応じて、最大3、8時間かかる場合があります。落とし穴を避けることは、時間を節約し、試薬を節約するために不可欠です。最初の一般的な間違いは、試薬の調製でしばしば発生します。水は実験室によって異なり、1つの実験室から次の実験室への結果の1つの単一の違いであり得る。すべての反応および試薬のためのきれいな水源と同じおよび使用して一貫した結果を保障する。抗体、ブロッキング溶液、および蛍煙素は室温で最もよく働きます。試薬および作業溶液調製の落とし穴を避けるために、すべての試薬に同じ水を使用します。また、室温ですべての作業溶液と試薬を使用します。
mfIHCのトラブルシューティングは重要であり、コンポーネントの汚染やオペレータエラーを制限するために重要な厳格なラボガイドラインを遵守しています。最適でない画像の生産は、結果を歪め、データに悪影響を及ぼす可能性のある偽陽性および陰性の細胞集団につながります。究極の分析には通常、機械学習に基づいてコンピュータで生成された型が含まれるため、染色の小さな誤差を拡大してデータセット全体に影響を与えることができます。たとえば、すべての汚れが完全に機能する場合がありますが、DAPI のエラーまたは省略により、将来のセルセグメンテーションとカウントによって実験が役に立たなくなります。解析ソフトウェアは、DAPI染色を使用してセルを識別するだけでなく、各セルに x 座標と y 座標を割り当て、多重化が薄暗い場合、割り外向きが悪い、または拡散する DAPI 染色を行う場合、画像をさらに使用できず、マルチプレックスを再試行または試行する必要があります。DAPIの救助と再染色。病理学やブライトフィールドビューなどのソフトウェアコンポーネントを使用することで、最適化プロセスの早い段階で感度と特異性に対する信頼が高まり、多重プロセスの早い段階でミスを防ぐことができます。
イメージングプロセスの修正の側面は、画像の最適化にも役立ちます。たとえば、DAPI を使用して画像を視覚的なフォーカスとして使用すると、ぼやけた画像を避けるのに役立ちます。新しく作られた蛍光ライブラリをソフトウェアに追加することで、分析段階で各蛍光素のクリーンな画像とスペクトルオーバーラップが少なく、空白のスライドを使用して自己蛍光を抽出することでマーカーが強くなり、画像が強化されます。品質。
組織標本の使用は、疾患の病態生理学を調査する上で不可欠なツールとして残ります。新しい技術は、細胞間相互作用の我々の理解を高め、mfIHCは有望な新しいプレーヤーです。この技術の染色プロセス中の最適化と精度は、細胞間相互作用の適切な利用とさらなる分析のために最も重要です。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者たちは、以前パーキン・エルマーから来たエド・スタックに、オリジナルの多重染色のセットアップと最適化に関する彼の支援に感謝したいと思います。著者らはまた、分析ソフトウェアを使用してヒントをアコヤバイオサイエンスからクリステンシュミットに感謝したいと思います。この出版物で報告された研究は、賞番号P30CA046592の下で国立がん研究所によってサポートされました, K08CA201581(1lf)、K08CA234222(js)、R01CA15158807(mpm)、RSG1417301CSM(mpm)、R01CA19807403(mpm)、U01CA22414501(午後)、hcCA170568 (hc)。内容は著者の責任のみであり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。ジェフリー・A・コルビー・コロン癌とトム・リウ記念研究基金による追加支援が行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | Fisher | HC8001GAL | |
| 70% ethanol | Fisher | HC10001GL | |
| 95% ethanol | Fisher | HC11001GL | |
| Analysis software | Akoya Biosciences | CLS135783 | inForm version 2.3.0 |
| Antifade mountant | ThermoFisher | P36961 | ProLong Diamond |
| Blocking solution | Vector | SP-6000 | Bloxall |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Life Sciences | A9647-100G | |
| Cover Slips | Fisher | 12-548-5E | |
| Delicate task wipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Fluorescent diluent | Akoya Biosciences | ARD1A01EA | Opal TSA diluent |
| Fluorophore 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 1:100 |
| Fluorophore 540 | Akoya Biosciences | FP1494001KT | 1:100 |
| Fluorophore 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 1:100 |
| Fluorophore 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 1:100 |
| Fluorophore 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 1:100 |
| Fluorophore 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
| Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 drops in TBST or PBS |
| Heat resistant box | Tissue-Tek | 25608-904 | Plastic slide box-green |
| Humidified Chamber | Ibi Scientific | AT-12 | |
| Hybridization oven | FisherBiotech | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | ImmEdge |
| Microscope | Perkin Elmer | CLS140089 | Mantra quantitative pathology workstation |
| Microwave | Panasonic | NN-A661S | with inverter technology |
| Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% neutral buffered formalin |
| pH 6 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
| pH 9 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
| Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | PBS |
| Plastic slide box | Tissue-Tek | 25608-906 | |
| Plastic wrap | Fisher | NC9070936 | |
| Polysorbate 20 | Fisher | BP337-800 | Tween 20 |
| Primary antibody CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
| Primary antibody CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
| Primary antibody CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
| Primary antibody FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
| Primary antibody pancytokeratin | Cell Signaling | 12653 | 1:500 |
| Primary antibody PD-L1 | Cell Signaling | 13684 | 1:200 |
| Secondary antibody | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Opal polymer |
| Slide stain set | Electron Microscopy Sciences | 6254001 | |
| Tris buffered saline | Corning | 46-012-CM | TBS |
| Vertical slide rack | Electron Microscopy Sciences | 50-294-72 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
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