Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Celcyclus-specifieke meting van γH2AX en apoptosis na genotoxische stress door flow Cytometrie

Published: September 1, 2019 doi: 10.3791/59968
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2
1CCU Molecular and Radiation Oncology, German Cancer Research Center, 2Department of Radiation Oncology, Heidelberg University Hospital, 3Department of Radiation Oncology, Freiburg University Medical Center

Summary

De gepresenteerde methode combineert de kwantitatieve analyse van DNA Double-strand Breaks (DSBs), celcyclus verdeling en apoptosis om de celcycluspecifieke evaluatie van de inductie en reparatie van DSB mogelijk te maken, evenals de gevolgen van herstel fouten.

Abstract

De gepresenteerde methode of licht gewijzigde versies zijn bedacht om specifieke behandelings responsen en bijwerkingen van verschillende anti-kankerbehandelingen te bestuderen, zoals gebruikt in de klinische oncologie. Het maakt een kwantitatieve en longitudinale analyse van de DNA-schade reactie mogelijk na genotoxische stress, zoals geïnduceerd door radiotherapie en een veelheid aan anti-kanker drugs. De methode dekt alle stadia van de DNA-schade reactie, het verstrekken van eindpunten voor inductie en reparatie van DNA dubbel strand Breaks (DSBs), arrestatie van de celcyclus en celdood door Apoptosis in geval van herstel falen. Het combineren van deze metingen geeft informatie over de celcyclus afhankelijke behandelingseffecten en maakt zo een grondige studie mogelijk van de wisselwerking tussen cellulaire proliferatie en het omgaan met DNA-beschadiging. Aangezien het effect van veel kankertherapieën, waaronder chemotherapeutische middelen en ioniserende straling, beperkt is tot of sterk varieert naargelang de specifieke celcyclus fasen, vertrouwen correlatieve analyses op een robuuste en haalbare methode om de behandelingseffecten te beoordelen op het DNA in een celcyclus-specifieke manier. Dit is niet mogelijk met assays met één eindpunt en een belangrijk voordeel van de gepresenteerde methode. De methode is niet beperkt tot een bepaalde cellijn en is grondig getest in een veelheid van tumor en normale weefsel cellijnen. Het kan op grote schaal worden toegepast als een uitgebreide genotoxiciteitstest op vele gebieden van oncologie naast radio-oncologie, waaronder milieueffectbeoordeling, geneesmiddelen screening en evaluatie van genetische instabiliteit in tumorcellen.

Introduction

Het doel van oncologie is om kankercellen te doden of te deactiveren zonder de normale cellen te schaden. Veel therapieën induceren direct of indirect genotoxische stress in kankercellen, maar ook bij sommige zich uitstrekken in normale cellen. Chemotherapie of gerichte geneesmiddelen worden vaak gecombineerd met radiotherapie om de radio gevoeligheid van de bestraalde tumor1,2,3,4,5te verbeteren, wat een reductie van de stralingsdosis om normale weefselbeschadiging te minimaliseren.

Ioniserende straling en andere genotoxische middelen induceren verschillende soorten DNA-schade, waaronder basis modificaties, strand verknopingen en enkel-of dubbel strand pauzes. DNA Double-strand Breaks (DSBs) zijn de ernstigste DNA laesies en hun inductie is de sleutel tot het celdodende effect van ioniserende straling en diverse cytostatica in radio chemotherapie. Dsbs schaden niet alleen de integriteit van het genoom, maar bevorderen ook de vorming van mutaties op6,7. Daarom hebben verschillende DSB-reparatie trajecten en mechanismen om onherstelbaar beschadigde cellen zoals apoptosis te elimineren tijdens de evolutie ontwikkeld. De gehele DNA-schade respons (DDR) wordt gereguleerd door een complex netwerk van signalerings trajecten die reiken van DNA-schade herkenning en celcyclus arrestatie om DNA-herstel mogelijk te maken, tot geprogrammeerde celdood of inactivatie in geval van reparatie storing8.

De gepresenteerde Flow-cytometrische methode is ontwikkeld om de DDR na genotoxische stress te onderzoeken in een uitgebreide test die de inductie en reparatie van DSB dekt, evenals de gevolgen van herstel fouten. Het combineert de meting van de veeltoegepaste DSB marker γH2AX met analyse van de celcyclus en inductie van apoptosis, met behulp van klassieke subG1 analyse en specifiekere evaluatie van caspase-3 activering.

De combinatie van deze eindpunten in één assay vermindert niet alleen de tijd, arbeid en kosten uitgaven, maar maakt ook de celcyclus-specifieke meting van DSB inductie en reparatie, evenals caspase-3 activering. Dergelijke analyses zijn niet mogelijk met onafhankelijk uitgevoerde testen, maar ze zijn zeer relevant voor een uitgebreid begrip van de DNA-schade respons na genotoxische stress. Veel anti-kanker drugs, zoals cytostatische verbindingen, zijn gericht tegen het verdelen van cellen en hun efficiëntie is sterk afhankelijk van de fase van de celcyclus. De beschikbaarheid van verschillende DSB reparatie processen is ook afhankelijk van de celcyclus fase en traject keuze die essentieel is voor de reparatie nauwkeurigheid, en op zijn beurt bepaalt het lot van de cel9,10,11, 12. Bovendien is celcycle-specifieke meting van DSB-niveaus nauwkeuriger dan gepoolde analyse, omdat DSB-niveaus niet alleen afhankelijk zijn van de dosis van een genotoxische verbinding of straling, maar ook van het DNA-gehalte van de cel.

De methode is gebruikt om de werkzaamheid van verschillende radio therapieën te vergelijken om de resistentiemechanismen in multiform glioblastoom13 te overwinnen en het samenspel tussen ioniserende straling en gerichte geneesmiddelen in Osteosarcoom te ontleden14,15 en atypische teratoïde rhabdoïde kankers16. Bovendien is de beschreven methode op grote schaal gebruikt voor het analyseren van bijwerkingen van radio-en chemotherapie op mesenchymale stamcellen17,18,19,20,21, 22,23,24, die essentieel zijn voor de reparatie van de behandeling veroorzaakte normale weefselbeschadiging en een mogelijke toepassing in regeneratieve geneeskunde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voorbereiding

  1. Bereid ≥ 1 x 105 cellen/monster in elk type kweek vaartuig als uitgangsmateriaal.
    1. Bijvoorbeeld, het uitvoeren van een tijd-cursus experiment na blootstelling van U87 multiform glioblastoom cellen aan ioniserende straling: irradiate sub-confluente U87 cellen in T25 kolven in triplicaten voor elk tijdspunt. Kies vroege tijd-punten (15 min tot 8 h na bestraling) om de kinetiek van DSB Repair (γH2AX niveau) en late tijdpunten (24 h tot 96 h) te volgen om de resterende DSB-niveaus te beoordelen, celcyclus effecten en apoptosis.
      Opmerking: Het protocol is niet beperkt tot bestralings experimenten of een specifieke cellijn. Het is getest met talrijke cellijnen van alle soorten, van verschillende soorten en voor verschillende behandelings condities.
  2. Bereid de volgende oplossingen voor, waaronder 10% overtollig volume.
    1. Bereid 2 mL per monster van de fixatie oplossing, bestaande uit 4,5% Paraformaldehyde (PFA) in fosfaatgebufferde Saline (PBS). Bereid de oplossing fris. Verdun PFA in PBS door te verwarmen tot 80 °C met langzaam roeren onder de dampkap. Bedek de kolf met aluminiumfolie om warmteverlies te voorkomen. Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur en pas het uiteindelijke volume aan. Doorloop de oplossing door een gevouwen cellulose filter, Grade 3hw (Zie de tabel met materialen).
      Let op: PFA-dampen zijn giftig. Voer deze stap uit onder een rook afzuigkap en gooi PFA-afval op de juiste manier weg.
    2. Bereid 3 mL per monster permeabilization oplossing samengesteld uit 70% ethanol in ijskoude H2O. bewaren bij-20 °c.
    3. Bereid 7 mL per monster wasoplossing, bestaande uit 0,5% boviene serumalbumine (BSA) in PBS.
    4. Bereid 100 μL per monster van 3% BSA in PBS als antistof verdunningsmiddel.
    5. Bereid 100-250 μL per monster van de DNA-kleurings oplossing, bestaande uit 1 μg/mL 4 ', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) in PBS.
  3. Zet de centrifuge voor 15 mL buisjes op 5 min bij 200 x g en 7 °c. Laat de centrifuge afkoelen en gebruik deze instellingen voor alle Centrifugeer stappen.

2. monsterverzameling

  1. Als het verwerken van aanhandige cellen (bijv. U87 multiform glioblastoom cellen die in T25 kolven worden geteeld met 5 ml van het gemodificeerde eagle's medium van Dulbecco, aangevuld met 10% foetaal runderserum bij 37 °c en 5% koolstofdioxide atmosfeer), ga dan verder met stap 2.1.1. en 2.1.2. Voor suspensie cellen gaat u rechtstreeks naar stap 2.1.2.
    1. Verzamel het medium in een centrifugeren buis. Maak de cellen los met behulp van een routine-celcultuurmethode, waaronder het gebruik van trypsine, ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) of andere celdetacherings agenten.
      1. Voor U87 cellen, prewarme PBS en trypsine/EDTA (Zie de tabel met materialen) tot 37 °c, was de cellaag met 1 ml PBS, inbroed de cellen voor 1-2 min met 1 ml trypsine/EDTA en ondersteun celloslating door op de kolf te tikken. Verzamel alle wasoplossing en de celsuspensie in de buis met het medium.
    2. Centrifuge de cellen, gooi het medium weg en regeer de cellen in 1 mL PBS.
  2. Pipet de cellen meerdere malen op en neer om te zorgen voor een suspensie met één cel en breng de celsuspensie over in een buis met 2 mL fixatie oplossing (4,5% PFA/PBS, 3% eindconcentratie).
    Let op: PFA-dampen zijn giftig. Voer deze stap uit onder een rook afzuigkap en gooi PFA-afval op de juiste manier weg.
  3. Inincuberen de cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Centrifugeer de cellen en gooi het supernatant weg door decantatie.
  5. Maak de celpellet los door op de buis te tikken en de cellen in 3 mL 70% ethanol te respenderen. Ga direct verder met de volgende stap of bewaar de monsters tot enkele weken bij 4 °C.

3. wassen en vlekken

  1. Centrifugeer de cellen en gooi het supernatant weg door decantatie.
  2. Maak de celpellet los door op de buis te tikken. Rebreng de cellen in 3 mL wasoplossing (0,5% BSA/PBS), centrifugeer en gooi het supernatant weg.
  3. Herhaal de wasstap 1x met 3 mL, en vervolgens 1x met 1 mL wasoplossing. Gooi de supernatant in de laatste stap voorzichtig weg door pipetten. Wees voorzichtig om de pellet niet te aspireren.
  4. Verdun de antilichamen tegen γH2AX, fosho-Histon H3 (Ser10) en caspase-3 (Zie de tabel met materialen) in 100 μL/monster met antilichaam verdunningsmiddel (3% BSA/PBS).
  5. Maak de celpellet los door op de buis te tikken en de cellen in 100 μL van de antilichaam oplossing die in stap 3,4 is bereid, te hervatten. Houd de monsters in het donker vanaf deze stap verder.
  6. Incuberen de monsters gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  7. Centrifugeer de cellen en gooi de supernatant voorzichtig weg door pipetten. Wees voorzichtig om de pellet niet te aspireren.
  8. Maak de celpellet los door op de buis te tikken en de cellen in 100-250 μL DNA-kleurings oplossing (1 μg/mL DAPI/PBS) te hervatten.
    1. Gebruik 100 μL als 1-2 X105 cellen aanwezig zijn en verhoog het volume voor hogere celaantallen (250 μl voor ≥ 1 x 106 cellen). Ga direct verder met de volgende stap of bewaar de monsters in het donker bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken.
      Opmerking: Voor sommige celtypen optimaliseren van de DAPI-concentratie kan helpen om de scheiding van de fasen van de celcyclus te verbeteren.
  9. Pipet de monsters door de dop van de celzeef van een monsterbuis met een mesh poriegrootte van 35 μm.

4. meting

  1. Plaats de monsters op ijs, start de flow cytometer (Zie de tabel met materialen) geconfigureerd met een optische opstelling volgens tabel 1 en druk op de Prime -knop. Schakel indien nodig de ultraviolette laser (355 nm golflengte) afzonderlijk in en stel het vermogen in op 10 mW met behulp van de juiste software.
  2. Open de verwervings software (Zie tabel met materialen), Meld u aan en maak een nieuw experiment door te klikken op de knop Nieuw experiment op de werkbalk van de browser .
  3. Gebruik het venster Inspector om de naam van het experiment aan te passen en kies ' 5 log decennia ' voor plot weergave.
  4. Klik op de knop nieuw preparaat in de werkbalk van de browser en vouw het nieuwe item uit door op het symbool ' + ' aan de linkerkant te klikken om de eerste buisweer te geven. Selecteer het betreffende pictogram en type om de naam van het preparaat (bijv. celtype) en de buis (voorbeeld-id) te wijzigen. Klik op de buis aanwijzer van de eerste buis (pijl-achtig symbool aan de linkerkant) om deze groen te maken (actief).
  5. Open het tabblad parameters in het venster cytometer en kies de parameters volgens tabel 1. Verwijder alle onnodige parameters.
    Opmerking: de parameternamen kunnen variëren, afhankelijk van de aangepaste voorinstellingen (bijvoorbeeld Cy3 in plaats van Alexa555). Zorg ervoor dat de selectie overeenkomt met de optische filters en detectoren in tabel 1. De licht paden van alle fluor Foren zijn volledig onafhankelijk in deze opstelling en compensatie van spectrale overlapping is niet vereist; het kan echter nodig zijn als er een andere optische installatie wordt gebruikt.
  6. Open het werkblad venster en maak plots volgens Figuur 1. Teken 2 stip plots en 4 histogrammen met behulp van de corresponderende werkbalkknoppen en klik op de aslabels om de juiste parameters te kiezen (front Scatter (FSC-A) versus side Scatter (SSC-A), DAPI-W versus DAPI-A en een histogram voor DAPI-A en elk antilichaam-gekoppeld de.
  7. Bevestig een controlemonster aan de cytometer en druk op de knop uitvoeren op het apparaat. Selecteer de eerste buis in het browser venster van de software en klik op de knop gegevens ophalen in het acquisitie dashboard. Pas het monster injectievolume aan met de knoppen laag, Midden of hoog en het fijnafstelling wiel op het apparaat. Bij voorkeur werken bij lage instelling, maar probeer te verwerven ten minste 100 gebeurtenissen/seconde (Zie acquisitie dashboard).
  8. Pas de detector spanningen voor FSC, SSC en DAPI aan op het tabblad parameters van het Inspector -venster met behulp van de punt plots in Figuur 1 als richtsnoer. Schakel over naar logaritmische schaal voor de parameters FSC en SSC als de celpopulatie te gedispergeerd op een lineaire schaal verschijnt.
  9. Druk op de standby-knop op de cytometer en ga verder met de werkbladinstellingen in de software.
    1. Gebruik de veelhoek Gate tool om de cellen populatie in de FSC-A versus SSC-a plot en de rechthoek Gate tool te definiëren om de singlecells -populatie in de DAPI-W versus DAPI-een plot te definiëren. Druk op CTRL + G toetsen om de bevolkings hiërarchie weer te geven en klik op de standaard Gate-namen om ze te hernoemen.
    2. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op alle histogrammen en kies populaties tonen | SingleCells uit het contextmenu.
  10. Optimaliseer de detector spanningen voor de met antilichamen gekoppelde fluor Foren om het volledige dynamische bereik te dekken door vervolgens controle en behandelde monsters te verwerven. Maximaliseer de signaal-ruis verhouding en Vermijd de verzadiging van de detector. Zorg ervoor dat de piek van de Alexa488 in de Singlecells -populatie niet wordt afgekapt in het besturingselement of het behandelde monster.
  11. Druk op de standby-knop op de cytometer en Voer desgewenst stappen 4.11.1-4.11.3 uit in het werkbladvenster van de software om een ruwe schatting te krijgen van de behandelingseffecten tijdens de monster overname.
    1. Selecteer Singlecells in de bevolkings hiërarchie en gebruik het gereedschap rechthoek-poort om de G1-populatie in de DAPI-W versus DAPI-A-plot te definiëren. Klik met de rechtermuisknop op het Alexa488 histogram en kies populaties tonen | G1 in het contextmenu.
    2. Klik met de rechtermuisknop op het Alexa488 histogram en kies statistiek weergave maken in het contextmenu. Klik met de rechtermuisknop op de statistiek weergave en kies statistiek weergave bewerken. Ga naar het tabblad Statistieken en activeer het selectievakje voor de mediaan van het Alexa488-signaal in de populatie G1 (Deactiveer alle andere opties).
    3. Selecteer Singlecells in de bevolkings hiërarchie en gebruik het interval Gate -gereedschap om de subG1-, M -en Casp3 + -populaties in de DAPI-a, Alexa555-a (Cy3-a in Figuur 1) te definiëren en Alexa647-een histogrammen.
  12. Druk op de knop uitvoeren op de cytometer en meet de samples met behulp van het acquisitie dashboard in de software. Stel de stop poort in op alle gebeurtenissen of de poort van de cellen (als er meerdere kleine deeltjes aanwezig zijn) en het aantal gebeurtenissen dat moet worden vastgelegd op 10.000.
  13. Klik op volgende buis om een nieuw voorbeeld te maken, de naam ervan te wijzigen in het browser venster, klik op gegevens verzamelen om de overname te starten en gegevens op te nemen om de opname te starten.
  14. Selecteer bestand | Export | Experimenten uit de menubalk en kies mapexport in het dialoogvenster om de gegevens op te slaan als '. FCS ' bestanden. Desgewenst het experiment opslaan als een extra zip-bestand als u wilt inschakelen opnieuw importeren van het experiment op een later tijdstip.
    Opmerking: Het instellen van bestaande experimenten kan eenvoudig worden hergebruikt met Edit | Dupliceer zonder gegevens.

5. gegevensevaluatie

  1. Sleep de '. FCS ' bestanden naar de voorbeeld browser van de flow flowcytometrische Analysis software (zie tabel met materialen). Pas de gating-strategie toe die wordt weergegeven in Figuur 2. Zorg ervoor dat de poorten passen op de corresponderende populatie in alle monsters voordat u doorgaat met de volgende dochter poort.
    1. Als u wijzigingen op alle voorbeelden wilt toepassen, selecteert u de gewijzigde poort in de voorbeeld browser, kopieert u deze door op CTRL + Cte drukken, selecteert u de bovenliggende poort, drukt u op CTRL + SHIFT + E om de equivalente knooppunten in alle voorbeelden te selecteren en drukt u op CTRL + V om te plakken of te overschrijven de poort. Gebruik geen groeps poorten.
    2. Dubbelklik op het eerste voorbeeld in de browser om het plot SSC-A vs. FSC-A te openen. Gebruik het gereedschap veelhoek in de werkbalk om de cellen populatie te definiëren (Figuur 2, plot 1), met uitzondering van puin uit de analyse. Zorg ervoor dat de poort breed genoeg is naar de rechterbovenhoek om te voldoen aan behandelingsgerelateerde verschuivingen, maar beperk de rand naar de linkerbenedenhoek van het plot om de cel op betrouwbare wijze uit te sluiten.
    3. Dubbelklik op de poort van de cellen om een nieuw plot venster te openen en verander de assen in DAPI-W (verticaal) versus DAPI-a (horizontaal) door op de aslabels te klikken. Gebruik het gereedschap rechthoek om de singlecells -populatie te definiëren (Figuur 2, plot 2), met uitzondering van celdubbeltjes of klonters uit de analyse (dubbeltjes van G1-cellen hebben dezelfde DAPI-een intensiteit als G2-en M-cellen, maar een aanzienlijk hogere DAPI-W waarde).
      Opmerking: Wisselende celtellingen in verschillende samples veroorzaken verschuivingen in de algehele DAPI-een signaalsterkte als gevolg van evenwichts binding van DAPI aan DNA. Dit heeft geen invloed op de celcyclus analyse, maar het kan nodig zijn om de rechterrand van het single cell Gate monster per sample aan te passen voor deze verschuivingen.
    4. Dubbelklik op de poort Singlecells om een nieuw plot venster te openen en de assen te wijzigen om de DAPI-een histogram weer te geven. Gebruik de Bisector tool om afzonderlijke cellen te onderscheiden met een normaal DNA-gehalte (cellcycle populatie) van apoptotische cellen met gedegradeerd DNA (subG1 populatie). Selecteer vervolgens de nieuwe poorten in de browser en druk op CTRL + R om ze dienovereenkomstig te hernoemen (afbeelding 2, plot 3).
    5. Selecteer de Cellcycle Gate in de browser en kies gereedschap | Biologie | Celcyclus... van de menubalk om de celcyclus modellerings tool te openen. Kies Dean-Jett-Fox25,26 in de model sectie om de frequentie van cellen in de G1-, S-en G2/M-fase te schatten (Figuur 2, plot 4). Gebruik beperkingen alleen in het geval van slechte modellering prestaties (minimaliseren van de hoofdmap gemiddelde vierkante afwijking tussen model en gegevens).
    6. Maak Gates voor G1 (Ellipse tool), S (veelhoek gereedschap) en G2 + M (Ellipse tool) fase in de DAPI-W vs. DAPI-een plot van de cellcycle populatie om celcycluspecifieke γh2ax meting mogelijk te maken ( Afbeelding 2, plot 5). Gebruik de modellerings tool niet voor automatische celcyclus-gating op basis van de DAPI-een histogram, omdat dit onnauwkeurig kan zijn.
      Opmerking: Het kan nodig zijn om de poorten langs de DAPI-A-asmonster per monster te verplaatsen om rekening te kunnen maken met de bovengenoemde verschuivingen in de totale DAPI-signaalsterkte. Verplaats de drie poorten alleen als een groep en verander de vorm van individuele poorten niet om bias te voorkomen.
    7. Gebruik de Bisector tool om te onderscheiden phospho-histone H3-positieve (m) en-negatieve (m-) cellen in de Alexa555-een histogram van de cellcycle populatie (Figuur 2, plot 6). Houd CTRL ingedrukt en selecteer de poorten G2 + m en m-. Druk op CTRL + SHIFT + A om de G2 -poort (G2 + m & m-) te maken.
    8. Gebruik de Bisector tool om caspase-3-positieve (Casp3 +) en-negatieve (Casp3-) cellen in de Alexa647 te onderscheiden-een histogram van de singlecells -populatie (Figuur 2, plot 7). Stel de drempel zo in dat het gemiddelde van de Casp3 + populatie in de onbehandelde controles neerkomt op ~ 0,8% om hoge gevoeligheid te garanderen en assay-to-assay variaties te minimaliseren.
    9. Druk op CTRL + T om de tabel editor te openen en deze te configureren volgens afbeelding 3. Sleep de verschillende populaties van de voorbeeld browser naar de tabel editor en dubbelklik op de rijen om de instellingen voor statistiek, parameter en naam te wijzigen. Verwijder de overbodige rijen die automatisch worden toegevoegd na het slepen en neerzetten van het pictogram voor het modelleren van de celcyclus door de rijen te selecteren en op delte drukken.
    10. Kies bestand, de indeling en bestemming in de sectie uitvoer van het menu lint en klik op tabel maken om de gegevens te exporteren als '. xlsx ' bestand.
  2. Gebruik tabel berekenings software (zie tabel met materialen) voor verdere gegevensanalyse volgens aanvullend bestand 1 (FACS_Analysis_Template_ (1). XLSX).
    1. Corrigeer de frequenties van cellen in de verschillende fasen van de celcyclus, zodat hun som neerkomt op 100% door toepassing van de formule X ' = X * 100/Σ (alle fasen van de celcyclus), met X ': gecorrigeerde waarde, X: RAW-waarde, aan elke celcyclus fase.
      Opmerking: Afwijkingen van een som van 100% optreden als gevolg van onnauwkeurigheden in de celcyclus modellering, maar zijn meestal klein (< 5%).
    2. Normaliseer de mediane γH2AX-intensiteiten tot het DNA-gehalte in de verschillende celcyclus fasen door de waarden in de S-fase te delen door 1,5 en in de G2-en M-fase door 2,0.
    3. Om het gecombineerde genormaliseerde γH2AX niveau in de hele celpopulatie te berekenen, gebruikt u de formule Ia = iG1 * G1 + is * S + iG2 * G2 + im * m, waar ika, iG1, iS, iG2, im zijn genormaliseerde mediaan γH2AX intensiteiten van alle, G1, S, G2, M cellen respectievelijk G1, S, G2, M zijn gecorrigeerde frequentie van cellen in de respectieve celcyclus fase.
    4. Voor de genormaliseerde γH2AX niveaus en de frequentie van subG1 en caspase-3-positieve cellen, trekt u de gemiddelde waarde van de onbehandelde besturingselementen van elk monster af.
    5. Bereken de gemiddelde en standaarddeviatie van elke parameter van alle replicaatsamples en plot de resultaten in diagrammen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Humane U87 of LN229 multiform glioblastoom cellen werden bestraald met 4 GY foon of koolstofionstraling. Celcyclus-specifieke γH2AX niveaus en apoptosis werden gemeten op verschillende tijdstippen tot 48 uur na bestraling met behulp van de hier gepresenteerde Flow cytometrische methode (Figuur 3). In beide cellijnen induceerde koolstofionen hogere γH2AX piek niveaus die langzamer daalden en bleven significant verhoogd bij 24 tot 48 h vergeleken met fotopstraling bij dezelfde fysieke dosis (Figuur 4A). Dit gaf aan dat koolstofionen hogere piek niveaus van DNA dubbele-strand onderbrekingen (Dsb's) induceerden dan fotonen die minder efficiënt werden gerepareerd. Voor beide stralings typen waren de γH2AX niveaus het hoogst in G1-cellen, waarschijnlijk omdat DSB-reparatie beperkt is tot het pad van niet-homologe eindverbindingen in dit stadium van de celcyclus.

In lijn met de hogere DSB inductie snelheid en tragere reparatie kinetiek induceerde koolstofionen een sterker en langer durende arrestatie van de celcyclus in de G2 fase (Figuur 3B) en een hoger percentage apoptosis dan fotonen (Figuur 4C). Koolstof ionstraling kan daarom helpen bij het overwinnen van radioresistische mechanismen die in multiform glioblastoom zijn waargenomen bij klassieke radiotherapie met fotonen (Zie Lopez Perez, et al.1 voor gedetailleerde bespreking).

De in Figuur 4 getoonde resultaten zijn voorbeelden van een optimaal resultaat van deze methode, met duidelijke verschillen tussen onbehandelde en bestraalde cellen en statistisch significante differentiaal effecten tussen verschillende behandelingen. In gevallen waar inductie van DSBs en apoptosis minder duidelijk is, is het belangrijk om positieve controles op te nemen. Zoals hier wordt weergegeven, zijn de cellen die 1 h na de bestraling van foton hebben vastgesteld, goede positieve controles voor de γh2ax-inductie. Photon straling is ook bekend om efficiënt induceren apoptosis in lymfocyten, waardoor ze nuttig als positieve controles voor apoptosis 2-4 dagen na bestraling. Een andere mogelijkheid is het gebruik van geneesmiddelen voor apoptosis inductie, zoals de proteasoom inhibitor MG132 of een dood receptor ligand (Figuur 5).

Een ander belangrijk aspect voor een optimaal resultaat van de test is de kwaliteit van de celcyclus profielen. In Figuur 4B waren de G1-en G2-pieken smal en duidelijk gescheiden, waardoor het eenvoudig werd om celcyclus modellering toe te passen en om de poorten te definiëren voor de celcycluspecifieke meting van γh2ax. Afhankelijk van het celtype en de sterkte van het behandelingseffect (Figuur 6A, B), kan de resolutie van de verschillende fasen van de celcyclus aanzienlijk erger zijn. In sommige gevallen heeft de DAPI-concentratie een grote invloed op de kwaliteit van het celcyclus profiel en moet deze worden aangepast (Figuur 6C). In gevallen waarin geen duidelijke G1-piek door de behandeling detecteerbaar is, kan het gereedschap celcyclus modellering niet nauwkeurig worden toegepast. Het is raadzaam dan alleen handmatige gating in de DAPI-A versus DAPI-W plot op basis van besturingselementen met een goed gedefinieerde celcyclus profiel, zoals beschreven in het protocol te gebruiken.

De analyse van een celcyclus profiel zonder een duidelijke G1-piek kan verder worden gecompliceerd als de behandeling leidt tot lage celaantallen die resulteren in grote verschuivingen in de algehele DAPI-signaalsterkte. In deze situatie kan het moeilijk zijn om te oordelen, als een piek de G1 of de G2-piek is. Om dit probleem te voorkomen, kunnen de cellen worden geteld met een Neubauer kamer of met andere middelen na de laatste wasstap (stap 3,3) en kunnen de celaantallen worden aangepast. De piek posities in de behandelde cellen komen dan overeen met de besturingselementen.

Figure 1
Figuur 1 : Werkbladinstellingen voor voorbeeld verwerving. Plots en poorten voor signaalweergave in het werkbladvenster van de flow cytometer-software (Zie de tabel met materialen). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2 : Gating strategie voor data-evaluatie. Bevolkings boom en diagrammen die laten zien hoe de poorten zijn ingesteld om de verschillende subpopulaties in de Flow cytometrische analyse software te definiëren. DJF verwijst naar de celcyclus modellerings tool met behulp van de Dean-Jett-Fox methode25,26. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3 : Tabel met onbewerkte gegevens exporteren. Opzetten van de ' Table Editor ' voor RAW data export in de flow flowcytometrische analyse software. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4 : DNA-schade reactie van humane U87 en LN229 multiform glioblastoom cellen na bestraling met 4 GY foon versus koolstofionstraling. A) de inductie en reparatie van DSB gemeten door de γH2AX niveaus. De mediane fluorescentie intensiteit werd genormaliseerd naar het relatieve DNA-gehalte in elke celcyclus fase (G1 = 1,0, S = 1,5, G2 = 2,0) en de controleniveaus werden afgetrokken. Symbolen geven de gemiddelde en foutbalken aan die de SD-waarden aangeven. Massieve lijnen vertegenwoordigen de passingen volgens de functie I (t) = (P1 * t ² + P2 * t)/(t ² + Q1 * t + Q2) | t ≥ 0, P1 < 0, P1, Q1, Q2 > 0. B) verdeling van de celcyclus (gemiddelde en SD) en representatieve histogrammen van de DNA-INHOUDMARKERING DAPI na 24 uur na het foor-of koolstofionbestraling. (C) inductie van apoptosis, gemeten door caspase-3 en subG1 positieve cellen (gemiddelde en SD). * P < 0,05, * * P < 0,01, * * * P < 0,001 (tweezijdige Student t-toets). Dit cijfer is gewijzigd van Lopez, et al.1 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5 : Drug-gemedieerde apoptosis-inductie in U87 multiform glioblastoom cellen. U87 cellen werden behandeld met 5 ng/mL van een gemodificeerde TNF-gerelateerde, apoptosis-inducerende ligand (Zie tabel met materialen) plus 2,5 μM MG132 voor 20 h vóór fixatie om de apoptosis-meting te valideren door actieve caspase-3 en subG1-analyse. A) histogram van het caspase-3-signaal van behandelde versus onbehandelde cellen. B) DAPI-histogram van behandelde cellen met een subG1 populatie, met vermelding van de DNA-afbraak. Het histogram van caspase-3-positieve gebeurtenissen wordt in het rood overgelegd, wat aantoont dat de meeste apoptotische cellen hun DNA op dit moment nog niet hadden afgebroken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6 : Factoren die van invloed zijn op de kwaliteit van celcyclus profielen. Te agressieve behandelingen compliceren de celcyclus analyse. A) geen G1-piek is detecteerbaar 48 h na behandeling van LLC-cellen (Lewis longcarcinoom) met 20 GY fotopradiatie of (B) 96 h na behandeling van HS68 fibroblasten met 100 MJ UV-straling. C) DAPI-concentratie in verschillende cellijnen: in HS68 fibroblasten (bovenste paneel) was de G2/M piek (Zie pijlen) even goed gescheiden van de G1 piek voor DAPI concentraties tussen 0,01 en 1,0 μg/ml. DAPI-concentraties onder 0,75 μg/mL resulteerden daarentegen in een slechte scheiding en vorm bepaling van de G2/M piek (Zie pijlen) in MRC-5 fibroblasten (onderste paneel). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Table 1
Tabel 1: typische flow cytometer configuratie. λ = golflengte van de excitatie laser, U = detector spanning, log = logaritmische schaal (anders lineair),-A = signaalgebied,-H = maximale signaal hoogte,-W = signaal breedte (duur), FSC = voorste spreiding, SSC = zijverstrooiing. Optische filter specificaties worden gegeven als centrale golflengte/bandbreedte in nanometers. Instellingen kunnen variëren voor verschillende flowcytometers en detector spanningen moeten worden aangepast voor verschillende cellijnen.

Figure 1
Aanvullend figuur 1: microscopische afbeeldingen van γH2AX Foci. U87 cellen werden bestraald met verschillende doses fotonen straling, vast en gekleurd na 30 min volgens het gepresenteerde protocol en voorbereid voor microscopie zoals beschreven in de discussie. Bij 2 Gy konden individuele Foci gemakkelijk worden onderscheiden, terwijl bij 8 GY Foci telling bevooroordeeld was vanwege een aanzienlijke overlapping. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De aanbevolen methode is eenvoudig te gebruiken en biedt een snelle, nauwkeurige en reproduceerbare meting van de DNA-schade respons inclusief dubbele-strand break (DSB) inductie en reparatie, celcyclus effecten en apoptotische celdood. De combinatie van deze eindpunten biedt een vollediger beeld van hun onderlinge relaties dan individuele assays. De methode kan op grote schaal worden toegepast als een uitgebreide genotoxiciteitstest op het gebied van stralings biologie, therapie en bescherming, en meer in het algemeen in oncologie (bijvoorbeeld voor beoordeling van milieurisico risicofactoren, geneesmiddelen screening en evaluatie van genetische instabiliteit in tumorcellen).

De meest kritieke stap in dit protocol is de vastlegging van de cellen. Om een zuiver monster met een duidelijk gedefinieerde celpopulatie en een optimale resolutie van verschillende celcyclus fasen te verkrijgen, is het belangrijk om de aanhandige cellen voldoende tijd te geven om zich los te maken van het kweek vaartuig en een volledig ronde vorm te vormen. De cellen moeten worden overgebracht in de fixatie oplossing als een enkelvoudige celsuspensie zonder celklonters. Om ze te scheiden, moeten de cellen op en neer worden pipetteren of door een enkele keer door een fijne naald worden doorgegeven in moeilijke gevallen. De fixatietijd moet tussen alle monsters constant blijven en mag niet meer dan 20 minuten bedragen, inclusief de tijd voor centrifugeren voordat de cellen in 70% ethanol opnieuw worden gesuspensie. Langdurige fixatie zal leiden tot verlies van toegankelijke epitopen voor antilichaam binding en zal de signaalsterkte en gevoeligheid van de methode verminderen.

De belangrijkste beperking van de techniek is dat het geen informatie verschaft over de kwaliteit van de γH2AX Foci, anders dan de intensiteit in de hele Nucleus. Vooral grote γh2ax Foci en het optreden van een pan-nucleaire γh2ax kleuring zijn gekoppeld aan geclusterd dsbs1,27,28,29, die zeer complexe laesies zijn die zeer moeilijk zijn om30te repareren. Dergelijke geclusterde laesies lijken kenmerkend te zijn voor deeltjes straling zoals klinisch toegepaste koolstofionstraling en kunnen de reden zijn voor de superieure biologische effectiviteit van zware ionen straling in vergelijking met fotonen31,32 ,33. Analyse van de γH2AX Foci-grootte kan daarom van belang zijn als indicator van de complexiteit van de beschadiging. Hoewel het mogelijk is om het huidige protocol te gebruiken met een beeld stroom cytometer om de γH2AX Foci te visualiseren, kan de haalbare resolutie niet concurreren met een klassieke microscopische benadering. We hebben echter met succes microscopische dia's van de resterende monsters bereid na de flowcytometrische meting (aanvullend figuur 1) en verschillende functies geëvalueerd, waaronder het aantal γh2ax Foci, de grootte en de pan-nucleaire intensiteit met behulp van een semi-geautomatiseerd beeld-en analysesysteem. Om de monsters voor te bereiden op microscopie, werden 30-50 μL van de bevlekte cellen verspreid over het oppervlak van een 24 mm x 24 mm afdekglas, lucht gedroogd op kamertemperatuur in het donker en vervolgens ingebed met een afdekmedium op een glazen glijbaan.

In vergelijking met microscopische evaluatie van DSB-niveaus door γH2AX Foci-telling, is de Flow cytometrische meting superieur in doorvoer, bemonsteringsfrequentie, dynamisch bereik en nauwkeurigheid. Het dynamische bereik van microscopische Foci-tellingen wordt beperkt door de optische resolutie, wat leidt tot het onvermogen om de overlappende Foci29,34te onderscheiden. In de praktijk hebben we een lineair verband waargenomen tussen de stralingsdosis en de γh2ax Foci-getallen onder 2 Gy, en een sterk verzadigings effect boven 2 Gy in U87 multiform glioblastoom-cellen1. Daarentegen steeg de intensiteit van het γH2AX-signaal gemeten door de Flowcytometrie lineair met de dosis voor het geteste hele dosisbereik (0-8 Gy).

De nauwkeurigheid van microscopische Foci-telling wordt beperkt door het onvermogen om onderscheid te maken tussen verschillende fasen van de celcyclus zonder extra kleuringen35. Het aantal Dsb's geïnduceerd in een cel is niet alleen afhankelijk van de stralingsdosis, maar ook van het DNA-gehalte, en vandaar de celcyclus fase. G2-cellen hebben bijvoorbeeld twee keer zoveel DNA als G1-cellen en het gemiddelde aantal Dsb's dat wordt geïnduceerd bij een bepaalde stralingsdosis is tweemaal zo hoog voor G2-cellen in vergelijking met G1. Dit wordt duidelijk weerspiegeld in de γH2AX signaalintensiteit van G2 versus G1 cellen op vroege tijdstippen na straling gemeten doorstroming cytometrie. Daarom is het belangrijk om te evalueren DSB niveaus in een cel cyclus-specifieke manier om nauwkeurige resultaten te verkrijgen. Een Gepoolde analyse van cellen in verschillende celcyclus fasen, zoals gebruikelijk in microscopische benaderingen, kan worden bevooroordeeld door verschuivingen in de celcyclus verdeling, vooral als gevolg van door straling veroorzaakte G2-arrestatie. Om dit effect te kunnen beoordelen en om de reparatie kenmerken van DSB te vergelijken tussen verschillende fasen van de celcyclus, kan de γH2AX-niveaus eenvoudig worden genormaliseerd naar het DNA-gehalte in de flow-cytometrie-methode zoals aangegeven in het protocol.

Uitbreidingen van het huidige protocol zijn mogelijk met relatief weinig extra inspanning. Extra antilichamen met compatibele fluorofores-etiketten kunnen worden opgenomen in stap 3,4 zonder dat er extra stappen nodig zijn tijdens de monstervoorbereiding. Als een meer gedetailleerde analyse van apoptosis gewenst is, kunnen caspase-7,-9 en-8 antilichamen worden opgenomen. Als een andere uitbreiding, we hebben onlangs opgenomen een levende en dode cel kleurstof, een troponine T antilichaam en het tellen van kralen in het protocol om specifiek te analyseren hartspier co-gekweekte met fibroblasten na bestraling. De toevoeging van de levende/dode cel vlek en de tellen kralen breidt de mogelijkheid van de methode om de Fibroblast proliferatie en niet-apoptotic celdood van de hartspier als verdere eindpunten die nuttige aanvullende informatie over de cel te bevatten lot na genotoxische stress. Het uitgebreide protocol is op aanvraag beschikbaar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We danken het flow Cytometry Facility team van het Duitse kanker onderzoekscentrum (DKFZ) voor hun steun.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,000 µL filter tips Nerbe plus 07-693-8300
100-1,000 µL pipette Eppendorf 3123000063
12 mm x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size BD Falcon 352235
15 mL tubes BD Falcon 352096
200 µL filter tips Nerbe plus 07-662-8300
20-200 µL pipette Eppendorf 3123000055
4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 Dissolve in water at 200 µg/mL and store aliquots at -20 °C
Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 BioLegend 613406 Dilute 1:20
Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 BD Pharmingen 560626 Dilute 1:20
BD FACSClean solution BD Biosciences 340345 For cytometer cleaning routine after measurement
BD FACSRinse solution BD Biosciences 340346 For cytometer cleaning routine after measurement
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Biochrom L 182 Dissolve in water to 1x concentration
Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin Biochrom FG 0415 Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
Ethanol absolute VWR 20821.330
Excel software Microsoft
FBS Superior (fetal bovine serum) Biochrom S 0615 Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
FlowJo v10 software LLC online order
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01 Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples
Folded cellulose filters, grade 3hw NeoLab 11416
LSRII or LSRFortessa cytometer BD Biosciences
MG132 Calbiochem 474787 optional drug for apoptosis positive control
Multifuge 3SR+ Heraeus
Paraformaldehyde AppliChem A3813 Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter.
Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 Cell Signaling Technology #3475 Dilute 3:200
PIPETBOY acu 2 Integra Biosciences 155 016
Serological pipettes, 10 mL Corning 4488
Serological pipettes, 25 mL Corning 4489
Serological pipettes, 5 mL Corning 4487
SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) Biomol AG-40T-0002-C020 optional drug for apoptosis positive control
T25 cell culture flasks Greiner bio-one 690160 Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
Trypsin/EDTA PAN Biotech P10-025500 Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
U87 MG glioblastoma cells ATCC ATCC-HTB-14 Example cell line used in the protocol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jensen, A., et al. Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518). BMC Cancer. 6, 122 (2006).
  2. Oertel, S., et al. Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec). Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).
  3. Timke, C., et al. Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy. Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).
  4. Zhang, M., et al. Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761. Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).
  5. Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
  6. Hoeijmakers, J. H. DNA Damage, Aging, and Cancer. New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).
  7. Rodgers, K., McVey, M. Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).
  8. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  9. Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle. Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).
  10. Escribano-Díaz, C., et al. A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice. Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
  11. Bakr, A., et al. Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice. Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).
  12. Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation. Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).
  13. Lopez Perez, R., et al. DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells. Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).
  14. Oertel, S., et al. Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines. Radiation oncology. 6 (1), 119 (2011).
  15. Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
  16. Thiemann, M., et al. In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model. Radiation Oncology. 7 (1), 52 (2012).
  17. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).
  18. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy. Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).
  19. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition. Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).
  20. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin. Scientific Reports. 6, 20035 (2016).
  21. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment. Scientific Reports. 6, 26645 (2016).
  22. Rühle, A., et al. Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells. Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).
  23. Münz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
  24. Rühle, A., et al. The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).
  25. Dean, P. N., Jett, J. H. Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry. Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).
  26. Fox, M. H. A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry. Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).
  27. Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts. Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).
  28. Meyer, B., Voss, K. -O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  29. Lopez Perez, R., et al. Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci. FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).
  30. Schipler, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice. Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).
  31. Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. DNA fragmentation by charged particle tracks. Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).
  32. Friedland, W., et al. Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping. Scientific Reports. 7, 45161 (2017).
  33. Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy. Frontiers in Oncology. 6, 130 (2016).
  34. Böcker, W., Iliakis, G. Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells. Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).
  35. Löbrich, M., et al. γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization. Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).

Tags

Kankeronderzoek uitgave 151 DNA-dubbele strand breuken celcyclus verdeling apoptosis DNA-schade respons ioniserende straling koolstofionstraling genotoxische stress Flowcytometrie
Celcyclus-specifieke meting van γH2AX en apoptosis na genotoxische stress door flow Cytometrie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lopez Perez, R., Münz, F.,… More

Lopez Perez, R., Münz, F., Kroschke, J., Brauer, J., Nicolay, N. H., Huber, P. E. Cell Cycle-specific Measurement of γH2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (151), e59968, doi:10.3791/59968 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter