Summary
提示された方法は、DNA二本鎖切断(DSB)、細胞周期分布およびアポトーシスの定量分析を組み合わせて、DSB誘導および修復の細胞周期特異的評価と修復失敗の結果を可能にする。
Abstract
提示された方法またはわずかに変更されたバージョンは、臨床腫瘍学で使用される様々な抗癌治療の特定の治療応答および副作用を研究するために考案された。放射線療法や多数の抗がん剤によって引き起こされる、遺伝子毒性ストレス後のDNA損傷応答の定量的および縦方向の分析を可能にします。この方法は、DNA損傷応答のすべての段階をカバーし、DNA二本鎖切断(DSB)の誘導および修復、修復障害の場合のアポトーシスによる細胞周期停止および細胞死のエンドポイントを提供する。これらの測定値を組み合わせることで、細胞周期依存的な治療効果に関する情報が提供され、細胞増殖とDNA損傷に対する対処メカニズムの相互作用を詳細に研究することができます。化学療法剤や電位化放射線を含む多くのがん治療薬の効果は、特定の細胞周期相に応じて制限されるか、または強く変化するので、相関分析は、治療効果を評価するために堅牢で実行可能な方法に依存しています。細胞周期特異的な方法でDNAに。これは、シングルエンドポイントアッセイと提示された方法の重要な利点では不可能です。この方法は、任意の特定の細胞株に限定されず、腫瘍および正常組織細胞株の多数で徹底的にテストされている。環境リスク因子評価、薬物スクリーニング、腫瘍細胞における遺伝的不安定性の評価など、放射線腫瘍学以外の多くの分野で包括的な遺伝毒性アッセイとして広く応用できます。
Introduction
腫瘍学の目標は、正常な細胞に害を与えることなく、癌細胞を殺すか、または不活性化することです。多くの治療法は、がん細胞に遺伝子毒性ストレスを直接的または間接的に誘導するが、正常な細胞にも広がる治療法もある。化学療法または標的薬物は、照射された腫瘍1、2、3、4、5の放射線感受性を増強するために放射線療法と組み合わされることが多く、これは、正常な組織の損傷を最小にするために放射線量。
電化放射線および他の無毒剤は、塩基修飾、鎖架面および単一または二本鎖の破断を含む異なる種類のDNA損傷を誘発する。DNA二本鎖切断(DSB)は最も重篤なDNA病変であり、その誘導は放射線化学療法における電光放射線および様々な細胞静止薬の細胞殺傷効果の鍵である。DSBはゲノムの完全性を損なうだけでなく、突然変異6、7の形成を促進する。そのため、異なるDSB修復経路、およびアポトーシスのような回復不能な損傷を受けた細胞を排除するメカニズムが進化中に開発された。DNA損傷応答全体(DDR)は、DNA損傷認識および細胞周期停止から到達するシグナル伝達経路の複雑なネットワークによって調節され、DNA修復を可能にし、修復障害の場合にプログラムされた細胞死または不活性化に8。
提示されたフローサイトメトリック法は、DSB誘導および修復、ならびに修理失敗の結果をカバーする1つの包括的なアッセイで、ジェノト毒性ストレス後のDDRを調査するために開発されました。広く適用されたDSBマーカーγH2AXの測定と、古典的なsubG1分析とカスパーゼ-3活性化のより具体的な評価を用いて、細胞周期およびアポトーシスの誘導の分析を組み合わせた。
これらのエンドポイントを1つのアッセイで組み合わせることで、時間、労力、コストコストを削減できるだけでなく、DSB誘導および修復の細胞周期特異的測定、ならびにカスパーゼ-3活性化を可能にします。このような分析は、独立して行われるアッセイでは不可能ですが、毒性ストレス後のDNA損傷応答を包括的に理解するために非常に関連性が高い。細胞増殖性化合物などの多くの抗癌剤は、細胞分裂に対して向けられており、その効率は細胞周期段階に強く依存する。異なるDSB修復プロセスの可用性は、修復精度のために重要である細胞周期段階および経路選択にも依存し、順番にセル9、10、11の運命を決定する。 12.さらに、DSBレベルは、ジェノキシック化合物または放射線の線量だけでなく、細胞のDNA含有量にも依存するため、DSBレベルの細胞周期特異的測定はプール分析よりも正確です。
この方法は、神経膠芽腫13の抵抗機構を克服し、骨肉腫14、15における電離放射線と標的薬物との相互作用を解剖するために、異なる放射線療法の有効性を比較するために使用されてきた。および非定型奇形性ラブドイド癌16.さらに、記載された方法は、間葉系幹細胞17、18、19、20、21に対する無線および化学療法の副作用を分析するために広く使用されている。 22,23,24, 治療誘発正常組織損傷の修復に不可欠であり、再生医療に潜在的な応用を有する.
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Protocol
1. 準備
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任意のタイプの培養容器に≥1 x 105セル/サンプルを開始材料として調用します。
- 例えば、U87神経膠芽腫細胞を電分放射線に曝露した後の時間経過実験を行う:T25フラスコのサブコンフルエントU87細胞を各時間点に照射する。DSB修復(γH2AXレベル)と遅い時間ポイント(24時間から96時間まで)の動態に従って、残留DSBレベル、細胞周期効果およびアポトーシスを評価するために、早期のタイムポイント(照射後15分から8時間まで)を選択します。
注:プロトコルは、照射実験または任意の特定の細胞株に限定されない。それは異なった種およびさまざまな処置条件から、あらゆるタイプの多数の細胞株とテストされた。
- 例えば、U87神経膠芽腫細胞を電分放射線に曝露した後の時間経過実験を行う:T25フラスコのサブコンフルエントU87細胞を各時間点に照射する。DSB修復(γH2AXレベル)と遅い時間ポイント(24時間から96時間まで)の動態に従って、残留DSBレベル、細胞周期効果およびアポトーシスを評価するために、早期のタイムポイント(照射後15分から8時間まで)を選択します。
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10%の余分な容積を含む次の解決策を準備する。
- リン酸緩衝生理食液(PBS)中の4.5%パラホルムアルデヒド(PFA)からなる固定溶液の試料1サンプルあたり2mLを調製する。溶液を新鮮に準備します。煙フードの下でゆっくりと撹拌しながら80°Cに加熱することにより、PBSでPFAを希釈します。熱損失を防ぐために、フラスコをアルミホイルで覆います。溶液を室温まで冷やし、最終音量を調整します。折りたたまれたセルロースフィルター、グレード3hw(材料の表を参照)を通して溶液を渡します。
注意:PFAの煙は有毒です。ヒュームフードの下でこの手順を実行し、PFA廃棄物を適切に処分します。 - -20°Cで氷冷H2 O.ストアで70%エタノールからなる透過性溶液の試料1サンプルあたり3mLを調製する。
- PBSで0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)からなる洗浄液の試料1サンプル当たり7mLを調出す。
- 抗体希釈剤としてPBSで3%BSAの試料当たり100μLを調出す。
- PBSで1 μg/mL 4'、6-ジアミジン-2-フェニリンドル(DAPI)からなるDNA染色溶液の試料100~250μLを調製します。
- リン酸緩衝生理食液(PBS)中の4.5%パラホルムアルデヒド(PFA)からなる固定溶液の試料1サンプルあたり2mLを調製する。溶液を新鮮に準備します。煙フードの下でゆっくりと撹拌しながら80°Cに加熱することにより、PBSでPFAを希釈します。熱損失を防ぐために、フラスコをアルミホイルで覆います。溶液を室温まで冷やし、最終音量を調整します。折りたたまれたセルロースフィルター、グレード3hw(材料の表を参照)を通して溶液を渡します。
- 遠心分離機を 15 mL チューブ 200 x gおよび 7 °C で 5 分に設定します。遠心分離機を冷却し、すべての遠心分離ステップにこれらの設定を使用してみましょう。
2. サンプルコレクション
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付着細胞を処理する場合(例えば、T25フラスコで増殖したU87神経膠芽腫細胞は、37°Cおよび5%の二酸化炭素雰囲気で10%の胎児ウシ血清を補充した5mLのDulbeccoの改変イーグル培地で、ステップ2.1.1を続ける。および 2.1.2.懸濁セルの場合は、ステップ 2.1.2 に直接進みます。
- 遠心管で培地を回収します。トリプシン、エチレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)または他の細胞剥離剤の使用を含みよいルーチン細胞培養法を使用して細胞を剥離する。
- U87細胞の場合、プレウォームPBSおよびトリプシン/EDTA(材料表参照)を37°Cに、1mLのPBSで細胞層を洗浄し、1mLのトリプシン/EDTAで細胞をインキュベートし、フラスコをタップして細胞剥離をサポートします。すべての洗浄液とチューブ内の細胞懸濁液を培地で回収します。
- 細胞を遠心分離し、培地を廃棄し、PBSの1mLで細胞を再懸濁する。
- 遠心管で培地を回収します。トリプシン、エチレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)または他の細胞剥離剤の使用を含みよいルーチン細胞培養法を使用して細胞を剥離する。
- 細胞を上下に数回ピペ状にして、単一の細胞懸濁液を確保し、2 mLの固定溶液(4.5%PFA/PBS、3%最終濃度)を有するチューブに細胞懸濁液を移します。
注意:PFAの煙は有毒です。ヒュームフードの下でこの手順を実行し、PFA廃棄物を適切に処分します。 - 細胞を室温で10分間インキュベートします。
- 細胞を遠心分離し、デカンテーションによって上清を廃棄する。
- チューブをタップして細胞ペレットを緩め、70%エタノールの3 mLで細胞を再中断します。次のステップに直接進むか、サンプルを4°Cで数週間保存します。
3. 洗浄・染色
- 細胞を遠心分離し、デカンテーションによって上清を廃棄する。
- チューブをタップしてセルペレットを緩めます。洗浄液(0.5%BSA/PBS)の3mLで細胞を再懸濁し、遠心分離機を廃棄し、上清を廃棄する。
- 3 mL で洗浄工程 1x を繰り返し、1 mL 洗浄液で 1x を繰り返します。最後のステップでは、ピペッティングによって慎重に上清を廃棄します。ペレットを吸引しないように注意してください。
- 抗体希釈剤(3%BSA/PBS)を用いて100μL/試料でγH2AX、ホスホヒストンH3(Ser10)およびカスパーゼ-3(材料表参照)に対する抗体を希釈する。
- チューブをタップして細胞ペレットを緩め、ステップ3.4で調製した抗体溶液の100μLで細胞を再中断する。このステップ以降は、サンプルを暗闇の中に保管してください。
- サンプルを室温で1時間インキュベートします。
- 細胞を遠心分離し、ピペッティングによって慎重に上清を廃棄します。ペレットを吸引しないように注意してください。
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チューブをタップして細胞ペレットを緩め、DNA染色溶液(1μg/mL DAPI/PBS)の100~250μLで細胞を再定置します。
- 1-2 x105セルが存在する場合は 100 μL を使用し、セル数が大きくなります (≥1 x 106セルの場合は 250 μL)。次のステップに直接進むか、最大2週間4°Cで暗闇の中でサンプルを保存します。
注:一部の細胞型では、DAPI濃度を最適化し、細胞周期相の分離を改善するのに役立ちます。
- 1-2 x105セルが存在する場合は 100 μL を使用し、セル数が大きくなります (≥1 x 106セルの場合は 250 μL)。次のステップに直接進むか、最大2週間4°Cで暗闇の中でサンプルを保存します。
- 35 μmのメッシュ細孔サイズのサンプルチューブのセルストレーナーキャップを通してサンプルをピペットします。
4. 測定
- サンプルを氷の上に置き、表1に従って光学セットアップで設定されたフローサイトメーター(材料の表を参照)を開始し、プライムボタンを押します。必要に応じて、紫外線レーザー(355nm波長)を別々に切り替え、適切なソフトウェアを使用して電力を10mWに設定します。
- 取得ソフトウェアを開き(「材料の表」を参照)、ログインして、ブラウザツールバーの[新しい実験]ボタンをクリックして新しい実験を作成します。
- [インスペクタ]ウィンドウを使用して実験の名前をカスタマイズし、プロット表示に [5 ログ数十年] を選択します。
- ブラウザツールバーの[新しい標本]ボタンをクリックし、左側の「+」記号をクリックして新しいエントリを展開し、最初のチューブを表示します。それぞれのアイコンとタイプを選択して、標本(セルタイプなど)とチューブ(サンプル識別子)の名前を変更します。最初のチューブ(左の矢印のような記号)のチューブポインタをクリックして、緑色(アクティブ)に変えます。
- [サイトメーター]ウィンドウで[パラメータ]タブを開き、表 1に従ってパラメータを選択します。不要なパラメータをすべて削除します。
注:パラメータ名はカスタムプリセット(例:Alexa555の代わりにCy3など)によって異なる場合があります。表 1の光学フィルタと検出器の選択が一致していることを確認します。すべての蛍光体の光経路は、このセットアップでは完全に独立しており、スペクトルオーバーラップの補償は必要ありません。ただし、別の光式セットアップを使用する場合は、必要になる場合があります。 - [ワークシート]ウィンドウを開き、図 1に従ってプロットを作成します。対応するツールバーボタンを使用して2つのドットプロットと4つのヒストグラムを描画し、軸ラベルをクリックして適切なパラメータ(フロントスキャッタ(FSC-A)対サイドスキャッタ(SSC-A)、DAPI-W対DAPI-A、DAPI-Aおよび各抗体結合のヒストグラムを選択します。蛍煙管。
- コントロールサンプルをサイトメーターに取り付け、計測器の[実行]ボタンを押します。ソフトウェアのブラウザウィンドウで最初のチューブを選択し、取得ダッシュボードの[データ取得]ボタンをクリックします。ローボタン、ミッドボタン、ハイボタン、計測器の微調整ホイールを使用して、サンプル射出音量を調整します。[低]設定で作業するのが好ましいが、少なくとも 100 のイベント/秒を取得してみてください (取得ダッシュボードを参照)。
- 図 1のドット プロットをガイドラインとして使用して、インスペクタウィンドウの[パラメータ]タブで FSC、SSC、および DAPI の検出器電圧を調整します。セル母集団が線形スケールで分散しすぎるように見える場合は、FSC パラメータと SSC パラメータの対数スケールに切り替えます。
- サイトメーターのスタンバイボタンを押し、ソフトウェアのワークシートのセットアップを続行します。
- ポリゴン ゲートツールを使用して、FSC-A プロットと SSC-A プロットのセル母集団と長方形ゲートツールを定義して、DAPI-W プロットと DAPI-A プロットのシングルセル母集団を定義します。Ctrl キー + Gキーを押して母集団階層を表示し、既定のゲート名をクリックして名前を変更します。
- その後、すべてのヒストグラムを右クリックし、[人口を表示] を選択します|コンテキスト メニューのシングルセル。
- 抗体結合蛍光体の検出器電圧を最適化し、その後制御および処理されたサンプルを取得して完全なダイナミックレンジをカバーします。信号対雑音比を最大化し、検出器の飽和を回避します。シングルセルの作成のAlexa488ピークが、コントロールでも処理されたサンプルでも切り捨てられていないことを確認します。
- サイトメーターのスタンバイボタンを押し、必要に応じてソフトウェアのワークシートウィンドウで手順4.11.1-4.11.3を実行して、サンプル取得時の治療効果の概算を取得します。
- 母集団階層で単一セルを選択し、長方形ゲートツールを使用して、DAPI-W プロットと DAPI-A プロットの G1 母集団を定義します。Alexa488ヒストグラムで右クリックし、[人口を表示] を選択します|コンテキストメニューからG1。
- Alexa488ヒストグラムを右クリックし、コンテキストメニューから「統計ビューの作成」を選択します。統計ビューで右クリックし、[統計ビューの編集] を選択します。[統計]タブに移動し、G1 母集団の Alexa488 信号の中央値のチェックボックスを有効にします (他のすべてのオプションを無効にします)。
- 母集団階層内のシングルセルを選択し、インターバルゲートツールを使用して、DAPI-A、Alexa555-A(図1のCy3-A)でサブG1、M、Casp3+母集団を定義し、 Alexa647-Aヒストグラム。
- サイトメーターの[実行]ボタンを押し、ソフトウェアの取得ダッシュボードを使用してサンプルを測定します。停止ゲートをすべてのイベントまたはセルゲート (多数の小さなパーティクルが存在する場合) に設定し、記録するイベントの数を 10,000 に設定します。
- [次のチューブ]をクリックして新しいサンプルを作成し、ブラウザウィンドウで名前を変更し、[データの取得]をクリックして取得を開始し、データを記録して記録を開始します。
- ファイルの選択|エクスポート |メニュー バーからテストを行い、ダイアログ ボックスで[ディレクトリエクスポート]を選択して、データを '.fcs' ファイルとして保存します。必要に応じて、後で実験を再インポートできるようにする場合は、実験を追加のzip ファイルとして保存します。
注:既存の実験の設定は、編集で簡単に再利用できる|データなしで重複します。
5. データ評価
- フローサイトメトリック解析ソフトウェアのサンプルブラウザに '.fcs' ファイルをドラッグ アンド ドロップします (「材料の表」を参照)。図 2に示すゲーティング戦略を適用します。次の娘のゲートに進む前に、ゲートがすべてのサンプルの対応する母集団に収まることを確認してください。
- すべてのサンプルに変更を適用するには、サンプルブラウザで変更されたゲートを選択し、Ctrl + Cキーを押してコピーし、親ゲートを選択し、Ctrl + Shiftキーを押してすべてのサンプルで同等のノードを選択し、Ctrl + Vキーを押して貼り付けまたは上書きします。門グループ ゲートは使用しないでください。
- ブラウザの最初のサンプルをダブルクリックして、SSC-A プロットと FSC-A プロットを開きます。ツールバーの[ポリゴン]ツールを使用して、解析からデブリを除外するセルの母集団 (図 2、プロット 1) を定義します。ゲートが治療関連のシフトに対応するために右上隅に向かって十分に広いことを確認しますが、セルを確実に除外するために、プロットの左下隅に向かう境界線を制限します。
- セルゲートをダブルクリックして新しいプロットウィンドウを開き、軸ラベルをクリックして軸をDAPI-W(垂直)とDAPI-A(水平)に変更します。長方形ツールを使用して、シングルセルの母集団(図2、プロット2)を定義し、分析からセルの二重または束を除外します(G1細胞の二重はG2およびM細胞と同じDAPI-A強度を持ちますが、かなり高いDAPI-Wです)。値)。
注:異なるサンプルの細胞数が異なると、DNAへのDAPIの平衡結合による全体的なDAPI-A信号強度のシフトが生じます。これはセルサイクル解析には影響しませんが、これらのシフトを考慮するためにサンプルごとに単一セルゲートサンプルの右の境界線を調整する必要がある場合があります。 - SingleCellsゲートをダブルクリックして新しいプロット ウィンドウを開き、軸を変更して DAPI-A ヒストグラムを表示します。バイセクタツールを使用して、正常なDNA含有量(CellCycle集団)を持つ単一の細胞と、分解されたDNA(subG1集団)を有するアポトーシス細胞を区別します。 その後、ブラウザで新しいゲートを選択し、Ctrl + Rキーを押して名前を変更します (図2、プロット 3)。
- ブラウザでCellCycleゲートを選択し、[ツール] を選択します|生物学 |細胞周期...メニューバーからセルサイクルモデリングツールを開きます。G1、S、G2/M相の細胞の周波数を推定するには、モデルセクションでディーンジェットフォックス25、26を選択します(図2、プロット4)。コンストレイントは、モデリングのパフォーマンスが低下した場合にのみ使用します(モデルとデータの間のルート平均平方偏差を最小限に抑えます)。
- セルサイクル母集団のDAPI-W対DAPI-Aプロットで、G1(楕円ツール)、S(ポリゴンツール)、G2 +M(楕円ツール)フェーズのゲートを作成し、細胞周期特異的γHAX測定を可能にします( 図2、プロット5)。これは不正確な場合がありますので、DAPI-A ヒストグラムに基づく自動セル サイクル ゲーティングにはモデリング ツールを使用しないでください。
注:全体的なDAPI信号強度の前述のシフトを考慮するために、サンプルによってDAPI-A軸サンプルに沿ってゲートを移動する必要があるかもしれません。3 つのゲートをグループとして移動するだけで、バイアスを避けるために個々のゲートの形状を変更しないでください。 - Bisectorツールを使用して、CellCycle 母集団の Alexa555-A ヒストグラム内のホスホヒストン H3 陽性 (M) と -陰性 (M-) 細胞を区別します (図2,プロット 6)。Ctrl を押したまま、ゲート G2 + MとM-を選択します。Ctrl キーを押しながら Shift キーを押しながら A を押して、G2 (G2+M & M-) ゲートを作成します。
- Bisectorツールを使用して、単一セル母集団の Alexa647-A ヒストグラム内のカスパーゼ-3 陽性 (Casp3+ ) と -否定 (Casp3-) セルを区別します (図 2、プロット 7)。未処理のコントロールにおけるCasp3+母集団の平均が ~0.8% に達するようにしきい値を設定し、高い感度を保証し、アッセイとアッセイの変動を最小限に抑えます。
- Ctrl キーを押しながら T キーを押してテーブル エディタを開き、図 3に従って設定します。サンプル ブラウザからテーブル エディタに異なる母集団をドラッグ アンド ドロップし、行をダブルクリックして統計、パラメータ、および名前の設定を変更します。行を選択して Del キーを押すと、セル サイクル モデリング アイコンのドラッグ アンド ドロップ後に自動的に追加される不要な行を削除します。
- メニューリボンの[出力]セクションのフォーマットと宛先を選択し、[テーブルの作成] をクリックしてデータを '.xlsx' ファイルとしてエクスポートします。
- 補足ファイル 1 (FACS_Analysis_Template_(1)xlsx に従ってさらにデータ分析を行うには、テーブル計算ソフトウェア (材料の表を参照) を使用します。
- 数式 X' = X * 100 / Σ (すべてのセル サイクルフェーズ) を適用して合計が 100% に相当するように、異なるセル サイクルフェーズ内のセルの頻度を修正します。
注:100%の合計からの偏差は、細胞周期モデリングの不正確さのために生じるが、通常は小さい(<5%)。 - 中央値のγH2AX強度を異なる細胞周期相のDNA含有量に正規化し、S相の値を1.5、G2とM相を2.0で割ります。
- 細胞母集団全体で結合された正規化されたγH2AXレベルを計算するには、式IA = IG1 * G1 +S * S + IG2 * G2 + IM * M、I A、IG1、IG2、IG2、IMを使用します。全ての重文γH2AX強度を正規化し、G1、S、G2、M細胞はそれぞれG1、S、G2、Mの各細胞周期相における細胞の周波数を補正する。
- 正規化されたγH2AXレベルとsubG1およびカスパーゼ-3陽性細胞の頻度については、各サンプルから未処理コントロールの平均値を差し引きます。
- すべてのレプリケートサンプルから各パラメータの平均と標準偏差を計算し、結果をダイアグラムにプロットします。
- 数式 X' = X * 100 / Σ (すべてのセル サイクルフェーズ) を適用して合計が 100% に相当するように、異なるセル サイクルフェーズ内のセルの頻度を修正します。
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Representative Results
ヒトU87またはLN229神経膠芽腫細胞を4Gyのフォトンまたは炭素イオン放射で照射した。細胞周期特異的γH2AXレベルおよびアポトーシスは、ここに示す流れサイトメトリック法を用いて照射後48時間までの異なる時点で測定した(図3)。いずれの細胞株でも、炭素イオンは、同じ物理線量での光子放射と比較して、より低速に低下し、24~48時間で有意に上昇したγH2AXピークレベルを誘導した(図4A)。これは、炭素イオンが、あまり効率的に修復されなかった光子よりもDNA二本鎖破断(DSB)のピークレベルが高いことを示した。いずれの放射線タイプでも、γH2AXレベルはG1細胞で最も高く、おそらくDSB修復は細胞周期のこの段階で非相同末結合の経路に限定されているためである。
DSB誘導速度が高く、修復運動が遅いことに伴い、炭素イオンはG2相(図3B)でより強く、より長持ちする細胞周期停止を誘発し、光子よりもアポトーシスの速度が高い(図4C)。したがって、炭素イオン放射は、光子を用いた古典的な放射線療法の際に神経膠芽腫で観察される放射線抵抗機構を克服するのに役立つ可能性がある(詳細な議論については、ロペス・ペレスら1を参照)。
図4に示す結果は、この方法の最適な結果の例であり、未処理細胞と照射細胞の明確な違いと、異なる治療間の統計的に有意な差異効果を示す。DSBおよびアポトーシスの誘導があまり明確でない場合は、正のコントロールを含むことは重要です。ここに示すように、フォトン照射後1時間に固定された細胞はγH2AX誘導に対する良好な陽性対照である。光子放射線は、リンパ球のアポトーシスを効率的に誘導することも知られており、照射後2~4日のアポトーシスに対する陽性コントロールとして有用である。別の可能性は、プロテアソーム阻害剤MG132または死受容体リガンド(図5)のようなアポトーシス誘導に薬物を使用することです。
アッセイの最適な結果のためのもう一つの重要な側面は、細胞周期プロファイルの品質です。図4Bでは、G1とG2のピークが狭く明確に分離されており、細胞周期モデリングを容易に適用し、γH2AXの細胞周期特異的測定のゲートを定義することが容易になりました。細胞の種類と治療効果の強さ(図6A,B)に応じて、異なる細胞周期相の分解能が著しく悪化する可能性がある。場合によっては、DAPI濃度が細胞周期プロファイルの品質に大きな影響を与え、調整する必要があります(図6C)。治療により明確なG1ピークが検出できない場合、細胞周期モデリングツールを正確に適用することはできません。プロトコルで説明されているように、明確に定義されたセル サイクル プロファイルを持つコントロールに基づいて、DAPI-A 対 DAPI-W プロットでのみ手動ゲーティングを使用することをお勧めします。
明確なG1ピークのない細胞周期プロファイルの分析は、治療が全体的なDAPI信号強度の大きなシフトをもたらす低い細胞数につながる場合、さらに複雑になる可能性があります。このような状況では、ピークがG1またはG2ピークである場合、判断することは困難な場合があります。この問題を回避するために、細胞はノイバウアー室または最後の洗浄ステップ(ステップ3.3)の後に他の手段でカウントすることができ、細胞数を調整することができます。処理されたセルのピーク位置は、コントロールと一致します。
図 1: サンプル取得用のワークシートの設定。フローサイトメーターソフトウェアのワークシートウィンドウに信号表示用のプロットとゲート(材料の表を参照)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: データ評価のためのゲーティング戦略。フロー サイトメトリック解析ソフトウェアで異なるサブ母集団を定義するようにゲートがどのように設定されているかを示す母集団ツリーと図。DJFは、ディーンジェットフォックス法25、26を使用してセルサイクルモデリングツールを指します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 生データエクスポートテーブル。フローサイトメトリック解析ソフトウェアにおける生データエクスポート用の「テーブルエディタ」の設定この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4:ヒトU87およびLN229グロン芽細胞のDNA損傷応答は、光子対炭素イオン放射の4Gyで照射した後である。(A) γH2AXレベルで測定したDSB誘導および修復。蛍光の中央値は、各細胞周期相における相対DNA含有量(G1=1.0、S=1.5、G2=2.0)に正規化し、対照レベルを差し引いた。シンボルは平均を示し、誤差記号はSD値を示します。実線は関数 I(t) = (p1*t² + p2 *t) / (t² + q1* t + q2) |t ≥ 0、p1 < 0、p1、q1、q2 > 0。(B)光子または炭素イオン照射後24時間におけるDNA含有量マーカーDAPIの細胞周期分布(平均およびSD)および代表的ヒストグラム。(C)アポトーシス誘導は、カスパーゼ-3およびsubG1陽性細胞(平均およびSD)によって測定される。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 (両面学生のtテスト).この数字は、許可を受けてロペスら1から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: U87神経膠芽腫細胞における薬物媒介性アポトーシス誘導U87細胞を修飾TNF関連アポトーシス誘導リガンド(材料表参照)の5ng/mLで処理し、20時間2.5μM MG132を加えて固定化し、活性カスパーゼ-3およびsubG1分析によるアポトーシス測定を検証した。(A)未処理細胞に対するカスパーゼ-3シグナルのヒストグラム。(B)subG1集団を用いた処理された細胞のDAPIヒストグラムは、DNA分解を示す。カスパーゼ-3陽性事象のヒストグラムは赤で重ね合わされ、アポトーシス細胞のほとんどが現時点でDNAを分解していないことを示している。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6: 細胞周期プロファイルの品質に影響を与える要因。過酷な治療は細胞周期分析を複雑にする。(A) 100mJのUV放射線を有するHS68線維芽細胞の処置後、20Gyの光子照射を有するLLC細胞(ルイス肺癌)または(B)96hの治療後にG1ピークは検出可能な48hである。(C) 異なる細胞株におけるDAPI濃度:HS68線維芽細胞(上パネル)では、G2/Mピーク(矢印を参照)は、0.01〜1.0 μg/mLの間のDAPI濃度のG1ピークから等しくよく分離された。対照的に、0.75 μg/mL未満のDAPI濃度は、MRC-5線維芽細胞(下パネル)におけるG2/Mピーク(矢印を参照)の分離および形状定義が不十分でした。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表 1: 一般的なフロー サイトメーター構成。λ = 励起レーザーの波長、U =検出器電圧、ログ=対数スケール(それ以外の場合は線形)、-A=信号面積、-H=最大信号高さ、-W=信号幅(持続時間)、FSC=フロントスキャッタ、SSC=サイドスキャッタ。光学フィルタ仕様は、ナノメートルの中央波長/帯域幅として与えられています。設定は、異なるフローサイトメータのために異なる場合があり、検出器電圧は異なるセルラインに合わせて調整する必要があります。
補足図1:γH2AX病巣の顕微鏡画像。U87細胞は、異なる用量の光子照射を照射し、提示されたプロトコルに従って30分後に固定および染色し、議論に記載されているように顕微鏡検査用に調製した。2 Gyでは、個々の病巣を簡単に区別することができ、8 Gyの病巣カウントではかなりの重複のために偏っていた。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 1:このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
注目の方法は使いやすく、二本鎖の破壊(DSB)誘導および修理、細胞周期の効果およびアポトーシス細胞死を含むDNA損傷応答の速く、正確で、再生可能な測定を提供する。これらのエンドポイントの組み合わせは、個々のアッセイよりも相互関係のより完全な画像を提供します。この方法は、放射線生物学、治療および保護の分野における包括的な遺伝毒性アッセイとして広く適用することができ、より一般的には腫瘍学(例えば、環境リスク因子評価、薬物スクリーニングおよび遺伝学の評価のために)腫瘍細胞の不安定性)。
このプロトコルの最も重要なステップは、セルの固定です。明確に定義された細胞集団と異なる細胞周期相の最適な分解能を持つクリーンなサンプルを得るためには、付着細胞に培養容器から切り離し、完全に丸い形状を形成するのに十分な時間を与える必要があります。細胞は、細胞束なしで単一の細胞懸濁液として固定溶液に移されるべきである。それらを分離するには、細胞を上下にピペットするか、困難な場合には細かい針を数回通過する必要があります。固定時間は、すべてのサンプル間で一定に保たれるべきであり、70%エタノールで細胞を再懸濁する前に遠心分離のための時間を含む20分を超えてはなりません。長時間の固定は、抗体結合のためのアクセス可能なエピトープの損失につながり、方法のシグナル強度および感度を低下させる。
この技術の主な制限は、全核内の強度以外のγH2AX病巣の品質に関する情報を提供しないことである。特に大きなγH2AX病巣の発生と同様に、汎核γH2AX染色は、非常に困難であるクラスター化されたDSBs1、27、28、29にリンクされている。30を修復するには.このようなクラスター化病変は、臨床的に適用された炭素イオン放射などの粒子放射線に特徴があるようで、光子31,32と比較して重いイオン放射の生物学的有効性が優れている理由である可能性がある。 、33.したがって、γH2AX病巣サイズの分析は、損傷の複雑さの指標として興味深い可能性がある。画像ストリームサイトメーターを用いてγH2AX病巣を可視化することは可能であるが、達成可能な解像度は古典的な顕微鏡的アプローチと競合することはできない。しかし、フローサイトメトリック測定後の残りのサンプルから顕微鏡スライドを作成することに成功し(補足図1)、γH2AX病巣数、サイズ、パン核強度を用いていくつかの特徴を評価した。半自動イメージングおよび分析システム。顕微鏡検査用のサンプルを調製するために、染色された細胞の30〜50 μLを24mm x 24mmカバーガラスの表面に広げ、暗闇の中で室温で一晩乾燥し、ガラススライドに取り付け媒体を埋め込んだ。
γH2AX病巣計によるDSBレベルの顕微鏡評価と比較して、フローサイトメトリック測定はスループット、サンプリングレート、ダイナミックレンジおよび精度で優れています。顕微鏡病巣計数のダイナミックレンジは、光学分解能によって制限され、重なり合う病巣29、34を区別することができない。実際には、放射線量とγH2AX病巣数2Gy以下の線形関係を観察し、U87神経膠芽腫細胞1では2Gyを超える強い飽和効果を示した。対照的に、フローサイトメトリーによって測定されたγH2AXシグナルの強度は、試験された全用量範囲(0-8 Gy)に対する用量で線形に増加した。
顕微鏡病巣計数の精度は、追加の染色なしで異なる細胞周期相を区別できないことによって制限される35。細胞内で誘導されるDSBの数は、放射線量だけでなくDNA含有量にも依存するため、細胞周期段階に依存します。例えばG2細胞はG1細胞の2倍のDNAを持ち、ある放射線量で誘導されるDSBの平均数はG1と比較してG2細胞の2倍高い。これは、フローサイトメトリーによって測定された放射線の後の早期時点におけるG2対G1細胞のγH2AX信号強度に明確に反映される。したがって、正確な結果を得るためには、セルサイクル固有の方法でDSBレベルを評価することが重要です。顕微鏡的アプローチで通常のように、異なる細胞周期相の細胞のプール分析は、特に放射線誘発G2停止による細胞周期分布のシフトによって偏ることができます。この効果を考慮し、異なる細胞周期段階間のDSB修復特性を比較するために、γH2AXレベルは、プロトコルに示されているようにフローサイトメトリー法のDNA含有量に容易に正規化することができる。
本プロトコルの拡張は、比較的少ない余分な労力で可能です。互換性のある蛍煙素標識を持つ追加の抗体は、サンプル調製中に余分なステップを必要とせずにステップ3.4に含めることができます。アポトーシスのより詳細な分析が望まれる場合は、カスパーゼ-7、-9および-8抗体を含むことができる。もう一つの拡張として、我々は最近、生きた細胞染料、トロポニンT抗体、および照射後に線維芽細胞と共培養した心筋細胞を特異的に分析するプロトコルにビーズを含めた。生細胞染色とカウントビーズの添加は、細胞に有用な追加情報を提供するさらなるエンドポイントとして心筋細胞の線維芽細胞増殖および非アポトーシス細胞死を含む方法の能力を拡大する毒性ストレス後の運命。拡張プロトコルは、要求に応じて利用可能です。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
ドイツがん研究センター(DKFZ)のフローサイトメトリー施設チームの支援に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 µL filter tips | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
| 100-1,000 µL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 12 mm x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size | BD Falcon | 352235 | |
| 15 mL tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 200 µL filter tips | Nerbe plus | 07-662-8300 | |
| 20-200 µL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Dissolve in water at 200 µg/mL and store aliquots at -20 °C |
| Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | Dilute 1:20 |
| Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Dilute 1:20 |
| BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | Dissolve in water to 1x concentration |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin | Biochrom | FG 0415 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
| Excel software | Microsoft | ||
| FBS Superior (fetal bovine serum) | Biochrom | S 0615 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| FlowJo v10 software | LLC | online order | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples |
| Folded cellulose filters, grade 3hw | NeoLab | 11416 | |
| LSRII or LSRFortessa cytometer | BD Biosciences | ||
| MG132 | Calbiochem | 474787 | optional drug for apoptosis positive control |
| Multifuge 3SR+ | Heraeus | ||
| Paraformaldehyde | AppliChem | A3813 | Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter. |
| Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Dilute 3:200 |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
| SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | optional drug for apoptosis positive control |
| T25 cell culture flasks | Greiner bio-one | 690160 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-025500 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| U87 MG glioblastoma cells | ATCC | ATCC-HTB-14 | Example cell line used in the protocol |
References
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