Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

מחזור התא-מדידה ייחודית של γH2AX ו אפופטוזיס לאחר הלחץ הגנוטוקסיידי זרימה Cyהמטריה

Published: September 1, 2019 doi: 10.3791/59968
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2
1CCU Molecular and Radiation Oncology, German Cancer Research Center, 2Department of Radiation Oncology, Heidelberg University Hospital, 3Department of Radiation Oncology, Freiburg University Medical Center

Summary

השיטה המוצגת משלבת את הניתוח הכמותי של מעברי ה-DNA כפול סטרנד (DSBs), מחזור התא הפצה ו אפופטוזיס כדי לאפשר מחזור התא הערכה ספציפית של האינדוקציה DSBS ותיקון, כמו גם את ההשלכות של כשל בתיקון.

Abstract

השיטה המוצגת או גרסאות מעט שונה כבר המציאו ללמוד תגובות טיפול ספציפיות תופעות לוואי של טיפולים שונים נגד סרטן משמש אונקולוגיה קלינית. היא מאפשרת ניתוח כמותי ואורכי של התגובה נזק DNA לאחר הלחץ גנוטוקסי, כפי שנגרם על ידי הקרנות והמון תרופות נגד סרטן. השיטה מכסה את כל השלבים של תגובת ה-DNA התגובה, מתן נקודות קצה עבור אינדוקציה ותיקון של ה-DNA כפול הגדיל מעברי (DSBs), מעצר תא המעצר תא מוות על ידי אפופטוזיס במקרה של כשל בתיקון. שילוב מדידות אלה מספק מידע על השפעות הטיפול תלויי מחזור התא ובכך מאפשר מחקר מעמיק של הגומלין בין התפשטות הסלולר ומנגנוני ההתמודדות נגד נזק לדנ א. כמו ההשפעה של מtherapeutics סרטן רבים כולל סוכני כימותרפיה וקרינה מייננת מוגבל או משתנה מאוד על פי שלבים ספציפיים מחזור התא, מנתח הקורקורונים להסתמך על שיטה חזקה והומה להעריך את השפעות הטיפול ב-DNA באופן ספציפי למחזור התא. דבר זה אינו אפשרי עם בחני נקודת קצה אחת ויתרון חשוב של השיטה המוצגת. השיטה אינה מוגבלת לקו תא מסוים ונבדק ביסודיות בהמון שורות של תאים סרטניים ורקמות רגילות. זה יכול להיות מיושם באופן נרחב בתור שיטת הרעילות מקיפה בתחומים רבים של אונקולוגיה מלבד רדיו-אונקולוגיה, כולל גורם סיכון סביבתי הערכה, הקרנת סמים והערכה של אי-יציבות גנטית בתאי הגידול.

Introduction

המטרה של אונקולוגיה היא להרוג או להשבית תאים סרטניים מבלי לפגוע בתאים נורמליים. טיפולים רבים או ישירות או עקיף לגרום ללחץ גנוטוקסינים בתאים סרטניים, אבל גם כמה להאריך בתאים נורמליים. כימותרפיה או תרופות ממוקדות משולבים לעתים קרובות עם הקרנות כדי לשפר את רגישות הרדיו של הגידול לקרינה,1,2,3,4,5, אשר מאפשר ירידה של את המינון הרדיואקטיבי כדי למזער את הנזק לרקמות נורמלי.

קרינה מייננת וסוכנים גנוסיים אחרים לגרום סוגים שונים של נזק לדנ א, כולל שינויי בסיס, מרובי סטרנד והפסקות יחיד או כפול סטרנד. DNA מעברי הגדיל כפול (DSBs) הם נגעים DNA החמורה ביותר האינדוקציה שלהם הוא המפתח להשפעה הריגת תאים של קרינה מייננת ותרופות ציטוסטטי שונים בכימותרפיה רדיותרפיה. Dsbs לא רק לפגוע ביושרה של הגנום, אלא גם לקדם את היווצרות של מוטציות6,7. לכן, מסלולים תיקון DSB שונים, מנגנונים לחסל תאים פגומים באופן חסר תקנה כמו אפופטוזיס פיתחו במהלך האבולוציה. התגובה הנזק DNA כולו (DDR) מוסדר על ידי רשת מורכבת של איתות מסלולים המגיעים מ-DNA זיהוי נזק ומחזור תא מעצר כדי לאפשר תיקון DNA, למות תאים מתוכנתים או הפעלה במקרה של כשל תיקון8.

שיטת הזרימה המוצגת של סייטוטומטנה פותחה כדי לחקור את ה-DDR לאחר הלחץ הגנומי באחת השיטות המקיפות שמכסה את האינדוקציה והתיקון של DSB, כמו גם תוצאות כשל בתיקון. הוא משלב את המדידה של היישום הנרחב DSB סמן γH2AX עם ניתוח של מחזור התא אינדוקציה של אפופטוזיס, באמצעות ניתוח subG1 הקלאסי והערכה ספציפית יותר של caspase-3 הפעלה.

השילוב של נקודות קצה אלה באחד מה, לא רק מפחית את הזמן, העבודה והוצאות העלות, אלא גם מאפשר מדידה ספציפית של מחזור התא של האינדוקציה והתיקון של DSB, כמו גם הפעלת caspase-3. ניתוחים כאלה לא יהיה אפשרי עם שנערך באופן עצמאי, אבל הם רלוונטיים מאוד להבנה מקיפה של התגובה נזק לדנ א לאחר הלחץ גנוטוקסיד. תרופות רבות נגד סרטן, כגון תרכובות ציטוסטטי, מכוונים נגד חלוקת תאים והיעילות שלהם תלויה מאוד בשלב מחזור התא. הזמינות של תהליכי תיקון dsb שונים תלויה גם בשלב מחזור התא ובחירת מסלול שהיא קריטית לדיוק התיקון, ובתורו קובע את גורלו של התא9,10,11, . שתיים עשרה בנוסף, מדידה ספציפית למחזור תאים של רמות DSB מדויקת יותר מניתוח במאגר, מכיוון שרמות DSB אינן תלויות רק במינון של תרכובת מגנטית או קרינה, אלא גם בתוכן הדנ א של התא.

השיטה שימש כדי להשוות את היעילות של רדיותרפיות שונות כדי להתגבר על מנגנוני ההתנגדות ב גלינובלסטומה13 ולנתח את הגומלין בין קרינה מייננת תרופות ממוקדות אוסטאוסרקומה14,15 וסרטן השרירים הטיפוסי... בנוסף, השיטה המתוארת שימש רבות כדי לנתח תופעות לוואי של רדיו-וכימותרפיה על תאי גזע mesenchymal17,18,19,20,21, 22,23,24, אשר חיוניים לתיקון של טיפול המושרה נזק רקמות נורמלי יש יישום פוטנציאלי ברפואה רגנרטיבית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה

  1. הכן ≥ 1 x 105 תאים/מדגם בכל סוג של כלי התרבות כחומר התחלתי.
    1. לדוגמה, התנהלות ניסוי זמן-קורס לאחר חשיפת התאים U87 גליסטומה לקרינה מייננת: Irradiate קרנת U87 תאים sub-confluent בצלוחיות T25 ב טרילקטים עבור כל נקודת זמן. בחר בזמן מוקדם נקודות (15 דקות עד 8 h לאחר ההקרנה) כדי לעקוב אחר קינטיקה של תיקון DSB (γH2AX level) ונקודות זמן מאוחר (24 h עד 96 h) כדי להעריך רמות DSB שיורית, השפעות מחזור התא ואפופטוזיס.
      הערה: הפרוטוקול אינו מוגבל לניסויי הקרנה או לקו תא ספציפי. הוא נבדק עם קווי תאים רבים מכל הסוגים, ממינים שונים ולתנאי טיפול שונים.
  2. הכן את הפתרונות הבאים כולל נפח עודף של 10%.
    1. הכינו 2 מ ל לכל מדגם של פתרון קיבעון המורכב מ-4.5% פאראפורמלדהיד (בתחתית) בתמיסת מלח מוזרמת פוספט (PBS). . הכן את הפתרון טרי באמצעות חימום ל-80 מעלות צלזיוס, מתחת למכסה המנוע, יש לדלל את הג. לכסות את הבקבוקון עם רדיד אלומיניום כדי למנוע אובדן חום. תן לפתרון להתקרר לטמפרטורת החדר ולהתאמת אמצעי האחסון הסופי. להעביר את הפתרון דרך מסנן תאית מקופל, כיתה 3hw (לראות את הטבלה של חומרים).
      זהירות: . אדי הכדורגלן רעילים בצעו שלב זה תחת מכסה המנוע והיפטרו מפסולת הרחוב בהתאם.
    2. הכינו 3 מ ל לכל מדגם של פתרון חדירות המורכב מ-70% אתנול בקרח קר H2O. Store ב-20 ° c.
    3. הכינו 7 מ ל לכל מדגם של פתרון כביסה המורכב מ-0.5% בסרום (BSA) בערוץ הPBS.
    4. להכין 100 μL לכל מדגם של 3% BSA ב-PBS כמו מדלל נוגדן.
    5. להכין 100-250 μL לכל מדגם של פתרון כתמים DNA המורכב 1 μg/mL 4, 6-diamidin-2-פניינידול (DAPI) ב PBS.
  3. הגדר את הצנטריפוגה עבור 15 צינורות mL ל 5 דקות ב 200 x ו -7 ° c. תן את הצנטריפוגה להתקרר ולהשתמש הגדרות אלה עבור כל השלבים צנטריפוגה.

2. אוסף דוגמאות

  1. אם עיבוד תאים מחסיד (למשל, U87 גליובלסטומה של תאים גדל ב T25 מבחנות עם 5 מ ל של מדיום שונה של הנשר של דולבקה שנוספו עם 10% סרום העוברי העובר ב 37 ° צ' ו 5% פחמן דו חמצני אווירה), להמשיך עם שלבים 2.1.1. ו2.1.2. עבור תאים ההשעיה להמשיך ישירות לשלב 2.1.2.
    1. לאסוף את המדיום בצינור צנטריפוגה. נתק את התאים באמצעות שיטה של תרבות תא שגרתית, העשויה לכלול את השימוש בטריפסין, בחומצה האצתית (EDTA) או בסוכני ניתוק תאים אחרים.
      1. עבור תאים U87, לחמם את PBS ו טריפסין/EDTA (לראות את הטבלה של חומרים) עד 37 ° c, לשטוף את שכבת התא עם 1 מ ל של PBS, דגירה את התאים עבור 1-2 דקות עם 1 מ ל טריפסין/edta ותמיכה תא הניתוק על ידי הקשה על הבקבוקון. לאסוף את כל הפתרונות כביסה ואת ההשעיה התא בצינור עם המדיום.
    2. צנטריפוגה את התאים, למחוק את המדיום ולהשעות מחדש את התאים 1 מ ל של PBS.
  2. Pipet התאים למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להבטיח השעיה תא בודד ולהעביר את ההשעיה התא לתוך צינור עם 2 מ ל של פתרון קיבעון (4.5% התחתית/PBS, 3% הריכוז הסופי).
    זהירות: . אדי הכדורגלן רעילים בצעו שלב זה תחת מכסה המנוע והיפטרו מפסולת הרחוב בהתאם.
  3. דגירה את התאים 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. צנטריפוגה את התאים והשמט את הסופרנטנט באמצעות שפייה.
  5. שחרר את הגלולה על ידי הקשה על הצינור להשעות מחדש את התאים 3 מ ל של 70% אתנול. המשך ישירות עם השלב הבא או אחסן את הדגימות ב-4 ° צ' למשך עד מספר שבועות.

3. כביסה וכתמים

  1. צנטריפוגה את התאים והשמט את הסופרנטנט באמצעות שפייה.
  2. שחרר את הגלולה הסלולרית באמצעות הקשה על השפופרת. להשעות את התאים ב 3 מ ל של פתרון כביסה (0.5% BSA/PBS), צנטריפוגה ולמחוק את הסופרנטאנט.
  3. חזור על שלב כביסה 1x עם 3 מ ל, ולאחר מכן 1x עם פתרון כביסה 1 mL. בשלב האחרון, מחק את הסופרנטנט בזהירות על ידי ליטוף. . תדאג לא להוריד את הגלולה
  4. לדלל את הנוגדנים נגד γH2AX, פוספהו-histone H3 (Ser10) ו caspase-3 (לראות את הטבלה של חומרים) ב 100 μl/מדגם עם נוגדן דילול (3% BSA/PBS).
  5. שחרר את הגלולה התא על ידי הקשה על הצינור ולהשעות מחדש את התאים ב-100 μL של פתרון הנוגדן שהוכן בשלב 3.4. השאר את הדגימות בחשכה משלב זה ואילך.
  6. מודב את הדגימות בטמפרטורה. של 1 שעות בחדר
  7. צנטריפוגה את התאים ולמחוק את הסופרנטאנט בזהירות על ידי ליטוף. . תדאג לא להוריד את הגלולה
  8. לשחרר את הגלולה התא על ידי הקשה על הצינור ולהשעות מחדש את התאים ב-100-250 μL של פתרון בצביעת DNA (1 μg/mL DAPI/PBS).
    1. השתמש 100 μL אם 1-2 x105 תאים קיימים ולהגדיל את עוצמת הקול עבור מספרי תאים גבוהים יותר (250 μl עבור ≥ 1 x 106 תאים). המשיכו ישירות עם השלב הבא או אחסנו את הדגימות בחשכה ב -4 ° c עד 2 שבועות.
      הערה: עבור סוגי תאים מסוימים מיטוב ריכוז DAPI יכול לעזור לשפר את הפרדת השלבים של מחזור התא.
  9. Pipet דגימות דרך הכובע מסננת התא של צינור מדגם עם גודל נקבובית של שינוי של 35 μm.

4. מדידה

  1. מניחים את הדגימות על הקרח, להתחיל את cytometer הזרימה (לראות את הטבלה של חומרים) מוגדר עם התקנה אופטית לפי לוח 1 ולחץ על הלחצן הראשי . אם נדרש, להחליף את הלייזר האולטרה סגול (355 ננומטר גל) בנפרד ולהגדיר את הכוח ל 10 mW באמצעות התוכנה המתאימה.
  2. פתח את תוכנת הרכישה (ראה טבלת חומרים), היכנס למערכת וצור ניסוי חדש על-ידי לחיצה על לחצן הניסוי החדש בסרגל הכלים של הדפדפן.
  3. השתמש בחלון המפקח כדי להתאים אישית את שם הניסוי ובחר ' 5 יומן רישום עשורים ' עבור תצוגת התוויה.
  4. לחץ על לחצן הדגימה החדשה בסרגל הכלים של הדפדפן והרחב את הערך החדש על-ידי לחיצה על סימן ' + ' בצידו השמאלי כדי להציג את השפופרת הראשונה. בחר את הסמל המתאים והקלד כדי לשנות את שם המדגם (למשל, סוג תא) ואת הצינור (מזהה דגימה). לחץ על מצביע הצינור של הצינורית הראשונה (סמל בדומה לחץ משמאל) כדי להפוך אותו לירוק (פעיל).
  5. פתח את הכרטיסיה פרמטרים בחלון cytometer ובחר את הפרמטרים לפי לוח 1. מחק את כל הפרמטרים המיותרים.
    הערה: שמות הפרמטרים עשויים להשתנות בהתאם להגדרות הקבועות מראש המותאמות אישית (לדוגמה, Cy3 במקום Alexa555). ודא שהבחירה תואמת למסננים ולגלאים האופטיים בטבלה 1. שבילי האור של כל fluorophores הם עצמאיים לחלוטין התקנה זו פיצוי של חפיפה ספקטרלית אינו נדרש; עם זאת, ייתכן שיהיה צורך בכך אם נעשה שימוש בכיוונון אופטי אחר.
  6. פתח את חלון גליון העבודה וצור מגרשים לפי איור 1. צייר 2 מגרשים ו 4 היסטגרמות באמצעות הלחצנים המתאימים בסרגל הכלים ולחץ על תוויות הציר כדי לבחור את הפרמטרים המתאימים (פיזור קדמי (FSC-A) לעומת פיזור הצד (מהאס-אס-אס), DAPI-W לעומת DAPI-A ו היסטוגרמה עבור DAPI-A וכל נוגדן מצמידים . בסדר, שיהיה
  7. צרף דגימת בקרה לציטוטומטר ולחץ על כפתור ההפעלה על המכשיר. בחר את הצינורית הראשונה בחלון הדפדפן של התוכנה ולחץ על לחצן רכישת נתונים בלוח המחוונים לרכישה. כוונן את עוצמת ההזרקה לדוגמה באמצעות הלחצנים נמוך, בינוני או גבוה וגלגל הכוונון העדין במכשיר. רצוי לעבוד בהגדרה נמוכה , אך נסו לרכוש לפחות 100 אירועים/שנייה (ראו לוח מחוונים לרכישה).
  8. התאם את המתח הגלאי עבור FSC, מדינת האס-אס ו-DAPI בכרטיסיה פרמטרים של חלון המפקח באמצעות מחלקות הנקודה באיור 1 כמנחה. עבור לקנה מידה לוגריתמי עבור הפרמטרים של FSC ו-אס. אס. אם אוכלוסיית התא מופיעה מפוזרת מדי בקנה מידה ליניארי.
  9. לחץ על לחצן ' המתנה ' בציטוטומטר והמשך בהתקנת גליון העבודה בתוכנה.
    1. השתמש בכלי ' שער מצולע ' כדי להגדיר את אוכלוסיית התאים בחלקה fsc-a לעומת מחלקת האס-אס-אס והכלי שער המלבן כדי להגדיר את אוכלוסיית התאים המרובים ב-Dapi-W לעומת ההתוויה של Dapi-a. הקש Ctrl + G keys כדי להציג את הירארכיית האוכלוסיה ולחץ על שמות השערים המהווים ברירת מחדל כדי לשנות את שמם.
    2. לאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על כל היסטגרמות ובחר הצג אוכלוסיות | תאים בלבד מהתפריט תלוי-ההקשר.
  10. למטב את המתח גלאי עבור הנוגדן מצמידים fluorophores כדי לכסות את טווח דינמי מלא על ידי רכישת שליטה לאחר מכן דגימות. למקסם את היחס אות לרעש ולהימנע הרוויה גלאי. ודא שהשיא Alexa488 באוכלוסיה בלבד של תאים אינו נחתך בפקד ולא במדגם שטופל.
  11. לחץ על לחצן המתנה על cytometer ובאופן אופציונלי לבצע שלבים 4.11.1-4.11.3 בחלון גליון העבודה של התוכנה כדי לקבל אומדן מחוספס של אפקטי הטיפול במהלך רכישת לדוגמה.
    1. בחר באפשרות ' תאים בלבד ' בהירארכיית האוכלוסיה והשתמש בכלי ' שער מלבן ' כדי להגדיר את אוכלוסיית G1 ב-dapi-W לעומת ההתוויה של dapi-A. לחצו לחיצה ימנית בהיסטוגרמה Alexa488 ובחרו באפשרות ' הצג אוכלוסיות ' | G1 מהתפריט תלוי-ההקשר.
    2. לחצו לחיצה ימנית בהיסטוגרמה Alexa488 ובחרו ' צור תצוגת סטטיסטיקה ' מהתפריט תלוי-ההקשר. לחצו לחיצה ימנית בתצוגת הסטטיסטיקה ובחרו ' עריכת תצוגת סטטיסטיקה '. עבור אל הכרטיסיה סטטיסטיקה והפעל את תיבת הסימון עבור החציון של אות Alexa488 באוכלוסיה של G1 (בטל את כל האפשרויות האחרות).
    3. בחר באפשרות ' תאים בלבד ' בהירארכיית האוכלוסיה והשתמש בכלי שער מרווח כדי להגדיר את האוכלוסיות subG1, M ו- Casp3 + ב-dapi-a, Alexa555-a (Cy3-a באיור 1) ו Alexa647...
  12. לחץ על לחצן הפעלה על cytometer ולמדוד את הדגימות באמצעות לוח המחוונים לרכישת בתוכנה. הגדר את שער העצירה לכל האירועים או לשער התאים (אם קיימים חלקיקים קטנים רבים) ומספר האירועים שיש לרשום ל-10,000.
  13. לחץ על השפופרת הבאה כדי ליצור מדגם חדש, שנה את שמו בחלון הדפדפן, לחץ על רכישת נתונים כדי להתחיל את הרכישה ולהקליט נתונים כדי להתחיל בהקלטה.
  14. בחר קובץ | ייצוא | ניסויים משורת התפריטים ובחרו ' ייצוא ספריות ' בתיבת הדו כדי לשמור את הנתונים כקבצי '. fcs '. באפשרותך לשמור את הניסוי כקובץ zip נוסף אם לאפשר ייבוא מחדש של הניסוי בנקודת זמן מאוחרת יותר.
    הערה: הכיוונון של ניסויים קיימים ניתן לשימוש חוזר בקלות עם עריכת | שכפל ללא נתונים.

5. הערכת נתונים

  1. גרור ושחרר את הקבצים '. fcs ' לתוך הדפדפן לדוגמה של תוכנת הניתוח של הזרימה cy, (ראה טבלת חומרים). החל את אסטרטגיית הפעולה המוצגת באיור 2. ודאו שהשערים מתאימים לאוכלוסייה המתאימה בכל הדגימות לפני שממשיכים עם שער הבת הבא.
    1. כדי להחיל שינויים על כל הדגימות, בחר את השער שהשתנה בדפדפן לדוגמה, העתק אותו על-ידי הקשת ctrl + C, בחר את שער האב, הקש ctrl + Shift + E כדי לבחור את הצמתים המקבילים בכל הדגימות ולאחר מכן הקש ctrl + V כדי להדביק או להחליף השער . אל תשתמשו בשערי הקבוצה
    2. לחץ פעמיים על המדגם הראשון בדפדפן כדי לפתוח את העלילה של מחלקת הקרקע לעומת FSC-a. השתמש בכלי מצולע בסרגל הכלים כדי להגדיר את אוכלוסיית התאים (איור 2, עלילה 1), ללא הריסות מהניתוח. ודא שהשער רחב מספיק לכיוון הפינה הימנית העליונה כדי להתאים למשמרות הקשורות לטיפול, אך הגבל את הגבול הפונה לפינה השמאלית התחתונה של העלילה כדי לשלול באופן אמין את התא.
    3. לחץ פעמיים על שער התאים כדי לפתוח חלון עלילה חדש ולשנות את הצירים ל-Dapi-W (אנכי) לעומת Dapi-a (אופקי) על-ידי לחיצה על תוויות הצירים. השתמש בכלי מלבן כדי להגדיר את האוכלוסיה של תאים בלבד (איור 2, עלילה 2), למעט כמות התאים או הגושים של הניתוח (כמות התאים של G1 כוללים את אותה עוצמת Dapi-A כתאים של G2 ו-M, אבל Dapi גבוה במידה ניכרת-W ערך).
      הערה: ספירת תאים משתנים בדגימות שונות תגרום לשינויים ב-DAPI הכולל-עוצמת אות בשל הכריכה השיווי משקל של DAPI ל-DNA. פעולה זו לא תשפיע על ניתוח מחזור התא, אך ייתכן שיהיה צורך להתאים את הגבול הימני של דגימת שער התא היחיד במדגם לחשבון עבור משמרות אלה.
    4. לחץ פעמיים על השער בלבד כדי לפתוח חלון עלילה חדש ולשנות את הצירים כדי להציג את ההיסטוגרמה של Dapi-a. השתמש בכלי ביקטור כדי להבחין בין תאים בודדים לבין תוכן dna רגיל (אוכלוסייתcellcycle ) מתאים אפוטוטיים עם דנ א מושפל (subG1 אוכלוסיה). לאחר מכן בחר את השערים החדשים בדפדפן והקש Ctrl + R כדי לשנות את שמם בהתאם (איור 2, עלילה 3).
    5. בחר את השער Cellcycle בדפדפן ובחר כלי | ביולוגיה | מחזור תאים. .. משורת התפריטים כדי לפתוח את כלי הדוגמנות של מחזור התא. בחר דין-jett-Fox25,26 בסעיף המודל כדי להעריך את תדירות התאים ב-G1, S ו-G2/M שלב (איור 2, עלילה 4). השתמש באילוצים רק במקרה של ביצועי מודלים ירודים (מזער את סטיית ממוצע השורש בין מודל לנתונים).
    6. יצירת שערים ל- G1 (כליאליפסה ), S (כלי מצולע) ו- G2 + M (הכליאליפסה ) ב-dapi-W Vs. dapi-מזימה של אוכלוסיית cellcycle כדי לאפשר מדידה γH2AX ספציפי למחזור תאים ( איור 2, עלילה 5). אין להשתמש בכלי הדוגמנות לביצוע מחזור תאים אוטומטי בהתבסס על היסטוגרמה DAPI-A, מאחר שפעולה זו עשויה להיות לא מדויקת.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך להעביר את השערים לאורך מדגם DAPI-A על-ידי דוגמה לחשבון עבור השינויים האמורים בחוזק האותות הכולל של DAPI. הזיזו את שלושת השערים כקבוצה ואל תשנו את צורת השערים הבודדים כדי להימנע מהטיה.
    7. השתמש בכלי ביסקטור כדי להבדיל בין פוספאו-Histone H3-חיובי (m) ו-שלילי (m-) תאים בAlexa555-היסטוגרמה של האוכלוסייה cellcycle (איור 2, עלילה 6). החזק את המקשים Ctrl ובחר את השערים G2 + m ו -m. הקש Ctrl + Shift + A כדי ליצור את השער g2 (G2 + m & m-).
    8. השתמש בכלי ביקטור כדי להבדיל בין תאים (Casp3 +) ושליליים (Casp3-) בAlexa647-היסטוגרמה של אוכלוסיית התאים הסינגניים ( איור 2, עלילה 7). הגדר את הסף כך שהממוצע של האוכלוסיה Casp3 + בפקדים שאינם מטופלות מסתכם ב-~ 0.8% כדי להבטיח רגישות גבוהה ולמזער את הווריאציות של הקביעה-לתוך-שיטת הטיפול.
    9. הקש Ctrl + T כדי לפתוח את עורך הטבלה ולקבוע את תצורתו לפי איור 3. גרור ושחרר את האוכלוסיות השונות מהדפדפן לדוגמה לעורך הטבלה ולחץ פעמיים על השורות כדי לשנות את הגדרות הסטטיסטיקה, הפרמטרים והשמות. הסר את השורות הלא נחוצות הנוספות באופן אוטומטי לאחר הגרירה והשחרור של סמל דגמי מחזור התא על-ידי בחירת השורות וההקשה על Del.
    10. בחר בקובץ, בתבנית וביעד במקטע הפלט של רצועת הכלים של התפריט ולחץ על צור טבלה כדי לייצא את הנתונים כקובץ '. xlsx '.
  2. השתמש בתוכנת חישוב טבלה (ראה טבלת חומרים) לניתוח נתונים נוסף בהתאם לקובץ המשלים 1 (FACS_Analysis_Template_ (1). xlsx).
    1. תקן את תדרי התאים בשלבי מחזור התא השונים, כך שהסכום שלהם מסתכם ב-100% על-ידי החלת הנוסחה X ' = X * 100/Σ (כל שלבי מחזור התא), עם X ': ערך מתוקן, X: ערך גולמי, לכל שלב של מחזור התא.
      הערה: סטיות מסכום של 100% מתרחשות עקב אי-דיוקים בדגמי מחזור התא, אך בדרך כלל קטנים (< 5%).
    2. לנרמל את עוצמות הγH2AX החציוני לתוכן ה-DNA בשלבי מחזור התא השונים על-ידי חלוקת הערכים בשלב S ב-1.5 ובשלב G2 ו-M-2.0.
    3. כדי לחשב את רמת הγH2AX המנורמלת המשולבת באוכלוסיית התאים כולה, השתמש בנוסחה IA = אניg1 * g1 + is * s + אניg2 * g2 +i * m , שםאני, אניG1, אניS, אניG2, אני הם מנורמל γH2AX עוצמות החציוני של כל, G1, S, G2, M תאים בהתאמה ו-G1, S, G2, M הם מתוקנים תדירות של תאים בשלב מחזור התא בהתאמה.
    4. עבור רמות γH2AX מנורמלות ותדירות התאים של subG1 ו caspase-3-חיוביים, הפחת את הערך הממוצע של הפקדים שאינם מטופלות מכל מדגם.
    5. לחשב את הממוצע ואת סטיית התקן של כל פרמטר מכל הדגימות לשכפל ולהתוות את התוצאות לתוך דיאגרמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

U87 אנושיים או LN229 התאים הגלינובללי היו לקרינה עם 4 Gy של פוטון או קרינת יון פחמן. מחזור תא ספציפי γH2AX רמות ו אפופטוזיס נמדדו בזמן נקודות שונות עד 48 h לאחר ההקרנה באמצעות שיטת הזרימה cy, הציג כאן (איור 3). בשני קווי התא, יוני פחמן המושרה גבוה יותר γH2AX השיא רמות שנדחו לאט יותר ונשארה מוגבה באופן משמעותי ב -24 כדי 48 h בהשוואה לקרינת פוטון באותה מנה פיזית (איור 4א). זה הצביע על כך יוני פחמן המושרה רמות שיא גבוה יותר של דנ א כפול משברים (DSBs) מאשר פוטונים שתוקנו פחות ביעילות. עבור שני סוגי הקרינה, רמות γH2AX היו הגבוהים ביותר בתאים G1, כנראה בגלל תיקון DSB מוגבל לנתיב של הצטרפות לא הומוולוגי בשלב זה של מחזור התא.

בקנה אחד עם שיעור האינדוקציה DSB גבוה יותר קינטיקה תיקון איטי יותר, יוני פחמן הנגרמת מעצר חזק וארוך יותר מחזור התא בשלב G2 (איור 3ב) ושיעור גבוה יותר של אפופטוזיס מאשר פוטונים (איור 4ג). קרינת הפחמן עשוי לפיכך לסייע להתגבר על מנגנונים רדיווריסיפית נצפתה גליובלסטומה על הקרנות קלאסיות עם פוטונים (ראה לופז פרז, ואח '.1 לדיון מפורט).

התוצאות המוצגות באיור 4 הן דוגמאות לתוצאה אופטימלית של שיטה זו, המציגה הבדלים ברורים בין תאים שאינם מטופלות ושעברו הקרינה ואפקטים משמעותיים מבחינה סטטיסטית בין טיפולים שונים. במקרים שבהם אינדוקציה של DSBs ו אפופטוזיס פחות ברור, חשוב לכלול פקדים חיוביים. כפי שמוצג כאן, תאים קבוע 1 h לאחר הקרנה פוטון הם שליטה חיובית טובה עבור γH2AX אינדוקציה. קרינת פוטון ידוע גם ביעילות לגרום אפופטוזיס ב לימפוציטים, מה שהופך אותם שימושיים כמו פקדים חיוביים עבור אפופטוזיס 2-4 ימים לאחר ההקרנה. אפשרות נוספת היא להשתמש בסמים עבור ואפופטוזיס אינדוקציה, כגון מעכב פרוטאסדום MG132 או קולטן למוות ליגו (איור 5).

היבט חשוב נוסף לתוצאה אופטימלית של הבחינה הוא האיכות של פרופילי מחזור התא. באיור 4ב הפסגות G1 ו G2 היו צרים והופרדו בבירור, מה שהופך אותו קל להחיל דגמי מחזור התא ולהגדיר את השערים עבור מדידה מחזור התא ספציפי של γH2AX. בהתאם לסוג התא וכוח אפקט הטיפול (איור 6A, B), הרזולוציה של שלבי מחזור התא השונים יכולים להיות גרועים באופן משמעותי. במקרים מסוימים, לריכוז DAPI יש השפעה גדולה על איכות פרופיל מחזור התא ויש צורך לכוונן (איור 6ג). במקרים שבהם לא ניתן לגילוי שיא ברור של G1 בשל הטיפול, אין אפשרות להחיל את כלי הדוגמנות של מחזור התא באופן מדויק. מומלץ אז להשתמש רק לדפדף ידני ב DAPI-A לעומת DAPI-W העלילה מבוסס על פקדים עם פרופיל מוגדר היטב מחזור התא, כפי שמתואר בפרוטוקול.

ניתוח של פרופיל מחזור התא ללא שיא ברור של G1 יכול להיות מורכב יותר אם הטיפול מוביל למספרי תאים נמוכים הנובעים משינויים גדולים בחוזק הכולל של האות DAPI. במצב זה, קשה לשפוט, אם שיא הוא ה-G1 או הפסגה של G2. כדי למנוע בעיה זו, ניתן לספור את התאים באמצעות תא נויבאואר או באמצעים אחרים לאחר שלב הכביסה האחרון (שלב 3.3) וניתן לכוונן את מספרי התאים. מיקומי השיא בתאים המתייחסים לאחר מכן יתאימו לפקדים.

Figure 1
איור 1 : הגדרת גליון עבודה עבור רכישה לדוגמה. מגרשים ושערים לתצוגת אות בחלון גליון העבודה של תוכנת הזרימה cytometer (ראה טבלת חומרים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : מערכת אסטרטגיה להערכת נתונים. עץ האוכלוסייה ודיאגרמות המראים כיצד השערים מוגדרים להגדיר את תתי-האוכלוסיות השונות בתוכנת הניתוח של הזרימה ציטוטומטלי. Djf מתייחס הכלי דגמי מחזור התא באמצעות שיטת דיקן-jett-Fox25,26. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : שולחן ייצוא נתונים גולמיים. הכיוונון של ' עורך הטבלה ' לייצוא נתונים גולמיים בתוכנת הניתוח של הזרימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : נזק DNA התגובה של האדם U87 ו LN229 גליובלסטומה של תאים לאחר הקרנה עם 4 Gy של פוטון לעומת קרינת יון פחמן. (א) dsb אינדוקציה ותיקון נמדד על ידי רמות γH2AX. עוצמת הקרינה החציונית החציוני הייתה מנורמלת לתוכן ה-DNA היחסי בכל שלב של מחזור התא (G1 = 1.0, S = 1.5, G2 = 2.0) ורמות הבקרה המופלו. סימנים מציינים ממוצע וקווי שגיאה מציינים ערכי SD. קווים אחידים מייצגים מתאים בהתאם לפונקציה I (t) = (p1 * t ² + p2 * t)/(t ² + q1 * t + q2) | t ≥ 0, p1 < 0, p1, q1, רבעון > 0. (ב) מחזור התא התפלגות (ממוצע ו-SD) ונציג היסטגרמות של סמן תוכן ה-DNA dapi ב 24 שעות לאחר פוטון או הקרנה יון פחמן. (ג) האינדוקציה אפופטוזיס, כפי שנמדד על ידי caspase-3 ו subG1 תאים חיוביים (ממוצע ו-SD). * P < 0.05, * * P < 0.01, * * * P < 0.001 (t מבחן דו צדדי של סטודנט). דמות זו שונתה מלופז, ואח '.1 עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5 : תרופות בתיווך אפופטוזיס-אינדוקציה ב U87 גליובלסטומה תאים. U87 תאים טופלו עם 5 ng/mL של שונה TNF הקשורות אפופטוזיס-גרימת ליגו (ראה טבלה של חומרים) בתוספת 2.5 ΜM MG132 עבור 20 h לפני הקיבעון כדי לאמת את המדידה אפופטוזיס על ידי active caspase-3 ו subG1 ניתוח. (א) היסטוגרמה של האות caspase-3 של מטופלים לעומת תאים לא מטופלים. (ב) dapi היסטוגרמה של תאים מטופלים עם אוכלוסיה subG1, המציינת השפלה DNA. ההיסטוגרמה של caspase-3-אירועים חיוביים מצופה באדום, הממחיש כי רוב התאים האפוטוטיים עדיין לא השפילו את הדנ א שלהם בשלב זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6 : גורמים המשפיעים על איכות פרופילי מחזור התא. טיפולים קשים מדי מסבכים. את ניתוח מחזור התא (A) אין G1 שיא הוא לגילוי 48 h לאחר הטיפול של התאים LLC (לואיס קרצינומה של הריאות) עם 20 Gy של קרינת פוטון או (ב) 96 h לאחר הטיפול של HS68 פיברותקיעות עם 100 mJ של קרינת UV. (ג) dapi ריכוז בקווי תאים שונים: ב HS68 פיברותקיעות (הפאנל העליון) את הפסגה G2/M (ראה חיצים) היה מופרד באופן שווה מפסגת G1 עבור ריכוזי dapi בין 0.01 ו 1.0 μg/mL. לעומת זאת, ריכוזי DAPI מתחת 0.75 μg/mL הביאו להפרדה ירודה ולהגדרת צורה של פסגת G2/M (ראה חיצים) ב-MRC-5 פיברותקיעות (פאנל תחתון). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Table 1
טבלה 1: תצורה אופיינית של cytometer זרימה. λ = אורך הגל של לייזר עירור, U = מתח גלאי, log = קנה מידה לוגריתמי (אחרת ליניארי),-A = אזור האות,-H = גובה האות המקסימלי,-W = רוחב האות (משך), FSC = החזית פיזור, המרכז הגבוה = בצד פיזור. מפרטים מסנן אופטי ניתנים כמו אורך הגל/רוחב פס מרכזי ב nanometers. הגדרות עשויות להיות שונות עבור cytomטומטריים זרימה שונים וממתח גלאי צריך להיות מותאם עבור קווי תאים שונים.

Figure 1
איור משלים 1: תמונות מיקרוסקופיים של γH2AX foci. U87 תאים הוקרן עם מינונים שונים של קרינת פוטון, קבוע ומוכתם לאחר 30 דקות על פי הפרוטוקול המוצג והכין מיקרוסקופ כפי שמתואר בדיון. ב 2 Gy, וקדי הפרט יכול להיות מכובד בקלות, בעוד ב 8 Gy הספירה של וקדי היה מוטה עקב חפיפה ניכרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה הכוללת היא קלה לשימוש ומציעה מדידה מהירה, מדויקת ומתחודש של התגובה נזק DNA כולל הפסקה כפולה הגדיל (DSB) אינדוקציה ותיקון, מחזור התא אפקטים מוות תאים האפוטוטיים. השילוב של נקודות קצה אלה מספק תמונה מלאה יותר של יחסי הגומלין שלהם מאשר הפרט היחיד. השיטה יכולה להיות מיושמת באופן נרחב כשיקול הרעילות מקיף בתחומים של ביולוגיה קרינה, טיפול והגנה, ובאופן כללי יותר באונקולוגיה (למשל, להערכת גורמי סיכון סביבתי, הקרנת סמים והערכה גנטית אי-יציבות של תאי הגידול).

הצעד הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא קיבוע התאים. כדי לקבל מדגם נקי עם אוכלוסיית תאים מוגדרת בבירור ורזולוציה אופטימלית של שלבים במחזור התאים השונים, חשוב להעניק לתאים החסיד מספיק זמן כדי להתנתק מכלי התרבות וליצור צורה עגולה לחלוטין. התאים צריכים להיות מועברים לתוך פתרון הקיבעון כמו תא אחד ההשעיה ללא גושי תאים. כדי להפריד ביניהן, התאים חייבים להיות מוזרקים למעלה ולמטה או לעבור דרך מחט עדינה מספר פעמים במקרים קשים. את זמן הקיבעון יש לשמור קבוע בין כל הדגימות ולא יעלה על 20 דקות כולל את הזמן עבור צנטריפוגה לפני השעיה של התאים 70% אתנול. קיבעון ממושך יוביל לאובדן אפיסקופים נגישים עבור כריכת נוגדנים ויקטין את עוצמת האות ואת הרגישות של השיטה.

המגבלה העיקרית של הטכניקה היא כי הוא אינו מספק מידע על איכות γH2AX וקדי מלבד האינטנסיביות בגרעין כולו. גדול במיוחד γH2AX וקדי, כמו גם התרחשות של γH2AX כתמים פאן-גרעיניים נקשרו באשכולות dsbs1,27,28,29, שהם נגעים מורכבים מאוד קשה מאוד לתקן30. נגעים כאלה באשכולות נראה אופייני לקרינת החלקיקים כגון קרינת הפחמן שהוחלו קלינית והיא עשויה להיות הסיבה לאפקטיביות ביולוגית מעולה של קרינת יון כבד לעומת פוטונים31,32 ,33. ניתוח של גודל γH2AX וקדי עשוי אפוא להיות מעניין כאינדיקטור של מורכבות הנזק. למרות שניתן להשתמש בפרוטוקול הנוכחי עם cytometer זרם התמונה כדי להמחיש את γH2AX foci, החלטה השגה לא יכול להתחרות עם גישה מיקרוסקופיים קלאסית. עם זאת, יש לנו הכין בהצלחה שקופיות מיקרוסקופיים מן הדגימות הנותרות לאחר זרימת מדידה cytometric (המשלים איור 1) והעריכו מספר תכונות כולל ספירת γH2AX וקדי, גודל ועוצמה הפאן-גרעינית באמצעות מערכת הדמיה וניתוח למחצה אוטומטיות. כדי להכין את דגימות עבור מיקרוסקופ, 30-50 μL של תאים ויטראז ' התפשטו על פני השטח של 24 מ"מ x 24 מ"מ זכוכית לכסות, האוויר מיובש לילה בטמפרטורת החדר בחושך ולאחר מכן מוטבע עם הרכבה בינונית על שקופית זכוכית.

בהשוואה להערכה מיקרוסקופית של רמות dsb על-ידי ספירת γH2AX וקדי, המדידה הציטוטומטפית מעולה בתפוקה, קצב דגימה, טווח דינמי ודיוק. טווח דינמי של ספירת וקדי מיקרוסקופיים מוגבל על ידי הרזולוציה האופטית, המוביל חוסר יכולת להבחין חופפים וקדי29,34. בפועל, אנו שנצפו קשר ליניארי בין המינון הקרינה ו γH2AX וקדי מספרים מתחת 2 gy, ואת השפעה רוויה חזקה מעל 2 gy ב U87 גליובלסטומה תאים1. לעומת זאת, את העוצמה של אות γH2AX נמדד על ידי cy, הזרימה ציטותינסה מוגברת ליניארי עם מינון עבור טווח המינון כולו נבדק (0-8 Gy).

הדיוק של ספירת וקדי מיקרוסקופיים מוגבל על-ידי חוסר יכולת להבחין בין שלבים שונים מחזור תאים ללא הסטטינוגים נוספים35. מספר ה-DSBs המושרה בתא אינו תלוי רק במינון הקרינה, אלא גם בתוכן הדנ א, ומכאן השלב במחזור התאים. תאים g2 למשל יש פי שניים דנ א כמו תאים G1 ואת המספר הממוצע של DSBs המושרה במינון קרינה מסוימת הוא גבוה פי שניים עבור תאים G2 לעומת G1. זה משתקף בבירור את עוצמת האות γH2AX של G2 לעומת G1 תאים בזמן מוקדם נקודות לאחר הקרינה הנמדדת על ידי cy try זרימה. לכן, חשוב להעריך רמות DSB באופן ספציפי למחזור תאים כדי לקבל תוצאות מדויקות. ניתוח במאגר של תאים בשלבים שונים של מחזור התא, כמו כרגיל בגישות מיקרוסקופיים, יכול להיות מוטה על ידי משמרות בהפצה מחזור התא במיוחד עקב מעצר מושרה הקרינה G2. כדי להסביר אפקט זה וכדי להשוות מאפייני תיקון DSB בין שלבים שונים של מחזור התא, רמות γH2AX יכול בקלות להיות מנורמל לתוכן ה-DNA בשיטה הזרימה cy, כפי שמצוין בפרוטוקול.

הרחבות של הפרוטוקול הנוכחי אפשריות עם מאמץ נוסף קטן יחסית. נוגדנים נוספים עם תוויות fluorophores תואם ניתן לכלול בשלב 3.4 ללא צורך בצעדים נוספים במהלך הכנת המדגם. אם ניתוח מפורט יותר של אפופטוזיס רצוי, caspase-7,-9 ו-8 נוגדנים יכול להיכלל. כתוספת נוספת, לאחרונה כללנו צבע תא חי ומת, הטרופונב T נוגדן וחרוזים לספור בפרוטוקול כדי לנתח במיוחד קרדיונטציטים שיתוף תרבותי עם פיברוטים לאחר ההקרנה. הוספת כתם חי/מת התא ואת חרוזי הספירה מרחיב את היכולת של השיטה לכלול התפשטות פיברובלסט ומוות תאים לא אפוטוטיים של הקרדיוציטים כנקודות קצה נוספות המספקות מידע שימושי נוסף על התא גורל. לאחר מצוקה הפרוטוקול המורחב זמין על פי בקשה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו מודים לצוות המתקן הרפואי של המרכז לחקר הסרטן הגרמני (DKFZ) על תמיכתם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,000 µL filter tips Nerbe plus 07-693-8300
100-1,000 µL pipette Eppendorf 3123000063
12 mm x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size BD Falcon 352235
15 mL tubes BD Falcon 352096
200 µL filter tips Nerbe plus 07-662-8300
20-200 µL pipette Eppendorf 3123000055
4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 Dissolve in water at 200 µg/mL and store aliquots at -20 °C
Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 BioLegend 613406 Dilute 1:20
Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 BD Pharmingen 560626 Dilute 1:20
BD FACSClean solution BD Biosciences 340345 For cytometer cleaning routine after measurement
BD FACSRinse solution BD Biosciences 340346 For cytometer cleaning routine after measurement
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Biochrom L 182 Dissolve in water to 1x concentration
Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin Biochrom FG 0415 Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
Ethanol absolute VWR 20821.330
Excel software Microsoft
FBS Superior (fetal bovine serum) Biochrom S 0615 Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
FlowJo v10 software LLC online order
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01 Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples
Folded cellulose filters, grade 3hw NeoLab 11416
LSRII or LSRFortessa cytometer BD Biosciences
MG132 Calbiochem 474787 optional drug for apoptosis positive control
Multifuge 3SR+ Heraeus
Paraformaldehyde AppliChem A3813 Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter.
Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 Cell Signaling Technology #3475 Dilute 3:200
PIPETBOY acu 2 Integra Biosciences 155 016
Serological pipettes, 10 mL Corning 4488
Serological pipettes, 25 mL Corning 4489
Serological pipettes, 5 mL Corning 4487
SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) Biomol AG-40T-0002-C020 optional drug for apoptosis positive control
T25 cell culture flasks Greiner bio-one 690160 Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
Trypsin/EDTA PAN Biotech P10-025500 Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
U87 MG glioblastoma cells ATCC ATCC-HTB-14 Example cell line used in the protocol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jensen, A., et al. Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518). BMC Cancer. 6, 122 (2006).
  2. Oertel, S., et al. Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec). Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).
  3. Timke, C., et al. Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy. Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).
  4. Zhang, M., et al. Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761. Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).
  5. Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
  6. Hoeijmakers, J. H. DNA Damage, Aging, and Cancer. New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).
  7. Rodgers, K., McVey, M. Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).
  8. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  9. Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle. Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).
  10. Escribano-Díaz, C., et al. A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice. Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
  11. Bakr, A., et al. Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice. Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).
  12. Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation. Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).
  13. Lopez Perez, R., et al. DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells. Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).
  14. Oertel, S., et al. Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines. Radiation oncology. 6 (1), 119 (2011).
  15. Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
  16. Thiemann, M., et al. In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model. Radiation Oncology. 7 (1), 52 (2012).
  17. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).
  18. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy. Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).
  19. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition. Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).
  20. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin. Scientific Reports. 6, 20035 (2016).
  21. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment. Scientific Reports. 6, 26645 (2016).
  22. Rühle, A., et al. Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells. Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).
  23. Münz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
  24. Rühle, A., et al. The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).
  25. Dean, P. N., Jett, J. H. Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry. Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).
  26. Fox, M. H. A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry. Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).
  27. Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts. Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).
  28. Meyer, B., Voss, K. -O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  29. Lopez Perez, R., et al. Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci. FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).
  30. Schipler, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice. Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).
  31. Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. DNA fragmentation by charged particle tracks. Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).
  32. Friedland, W., et al. Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping. Scientific Reports. 7, 45161 (2017).
  33. Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy. Frontiers in Oncology. 6, 130 (2016).
  34. Böcker, W., Iliakis, G. Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells. Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).
  35. Löbrich, M., et al. γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization. Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).

Tags

סרטן מחקר סוגיה 151 דנ א כפול משברים הפסקות מחזור התא הפצה אפופטוזיס התגובה נזק DNA קרינה מייננת קרינת יון פחמן מתחים גנוטוקסינים לזרום cy לנסות
מחזור התא-מדידה ייחודית של γH2AX ו אפופטוזיס לאחר הלחץ הגנוטוקסיידי זרימה Cyהמטריה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lopez Perez, R., Münz, F.,… More

Lopez Perez, R., Münz, F., Kroschke, J., Brauer, J., Nicolay, N. H., Huber, P. E. Cell Cycle-specific Measurement of γH2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (151), e59968, doi:10.3791/59968 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter