Radiosensibilité des cellules souches cancéreuses dans les lignées cellulaires du cancer du poumon
Summary
La présence de cellules souches cancéreuses a été associée à une rechute ou à de mauvais résultats après la radiothérapie. Ce manuscrit décrit les méthodes d’étude de la radiosensibilité des cellules souches cancéreuses dans les lignées cellulaires cancéreuses du poumon.
Abstract
La présence de cellules souches cancéreuses (CSC) a été associée à une rechute ou à de mauvais résultats après la radiothérapie. L’étude des CCS radiorésistants peut fournir des indices pour surmonter la radiorésistance. Le canal de calcium à porte de tension no 2 1 isoforme sous-unité 5 a été rapporté comme marqueur pour les CSC radiorésistants dans les lignées cellulaires non à petites cellules du cancer du poumon (NSCLC). À l’aide du canal calcique no 2, comme exemple de marqueur CSC, des méthodes d’étude de la radiosensibilité des CSC dans les lignées cellulaires du NSCLC sont présentées. Les CCS sont triés avec des marqueurs putatifs par cytométrie de flux, et la capacité d’auto-renouvellement des cellules triées est évaluée par essai de formation de sphère. L’analyse de formation des colonies, qui détermine combien de cellules perdent la capacité de générer des descendants formant la colonie après une certaine dose de rayonnement, est ensuite effectuée pour évaluer la radiosensibilité des cellules triées. Ce manuscrit fournit des étapes initiales pour l’étude de la radiosensibilité des CCS, qui établit la base pour une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents.
Introduction
La radiothérapie joue un rôle important dans le traitement du cancer. Cependant, l’existence de cellules souches cancéreuses radiorésistantes (CSC) peut entraîner une rechute ou de mauvais résultats après la radiothérapie1,2. Les CCS se caractérisent par leur capacité d’auto-renouvellement et leur capacité à générer des cellules cancéreuses hétérogènes3. Armés d’une capacité de réparation des dommages à l’ADN plus efficace ou de niveaux plus élevés de systèmes de récupération de radicaux libres ou d’autres mécanismes, les CCS sont relativement résistants à la radiothérapie4,5,6,7 , 8. L’identification des marqueurs du SCC et l’exploration de leurs mécanismes faciliteront le développement de médicaments qui surmonteront la radiorésistance sans augmenter les lésions tissulaires normales.
Le canal de calcium à la tension no 2 1 estoforme sous-unité 5 a été signalé comme marqueur pour les CSC radiorésistants dans les lignées cellulaires NSCLC9. À l’origine, le carcinome hépatocellulaire (HCC)aété identifié comme marqueur du SCC 10 . Utilisant l’immunisation soustractive avec une paire de lignées cellulaires de HCC dérivées des tumeurs primaires et récurrentes dans le même patient, un anticorps appelé 1B50-1 a été identifié pour cibler les cellules récurrentes de HCC spécifiquement. Les cellules 1B50-1-positives ont montré l’efficacité élevée de formation de sphère in vitro et la tumorigenicity élevée in vivo. Son antigène a été identifié par spectrométrie de masse, comme canal de calcium ‘2 ‘1 sous-unité isoforme 5. Les CSC sont expressément exprimés dans les CCS et sont indétectables dans la plupart des tissus normaux, ce qui en fait un candidat potentiel pour cibler les CCS10. Il est également démontré qu’il peut servir de marqueur CSC pour les lignées cellulaires du NSCLC, et il a été démontré qu’il transmet une radiorésistance aux cellules du NSCLC en partie en améliorant l’efficacité de la réparation des dommages à l’ADN en réponse au rayonnement9.
L’étude des CCS radiorésistants peut fournir des indices pour surmonter la radiorésistance. À titre d’exemple, on présente à titre d’exemple les principales méthodes d’étude de la radiosensibilité des CCS. Habituellement, les CCS sont isolés avec un marqueur de surface putatif, et les caractéristiques des cellules souches et la radiosensibilité des populations de cellules positives et négatives sont comparées. La formation de sphère dans un milieu sans sérum complété par des facteurs de croissance qui soutiennent l’auto-renouvellement est un résultat utile pour évaluer la tige des cellules in vitro. Les cellules avec la capacité élevée de formation de sphère sont susceptibles de montrer la tumorigenicité élevée une fois injectées dans les souris immunodéficientes10,11,12. L’analyse de formation des colonies est ensuite utilisée pour évaluer la radiosensibilité des cellules, qui détermine combien ont perdu la capacité de générer des descendants formant la colonie après une dose de rayonnement13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit des méthodes pour étudier la radiosensibilité des CCS dans les lignées de cellules cancéreuses in vitro. Dans cette étude, l’expression de la 2e 1 est continue dans les lignées cellulaires du NSCLC. Par conséquent, le gating est basé sur un contrôle isotype. Avant le tri, l’expression de 2 o1 doit être examinée en plusieurs lignées cellulaires par cytométrie de flux et validée par QPCR ou western blot. Il est recommandé de réanalyser l’expression de la cellule triée de 2 et 1-bas pa…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par la National Natural Science Foundation of China (81402535 et 81672969) et le National Key Research and Development Project (2016YFC0904703).
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red | Thermo Fisher | 15400054 | Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water |
| 1B50-1 | This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097) | ||
| 4% formaldehyde solution | Solarbio | G2160 | |
| A549 | ATCC | RRID: CVCL_0023 | |
| B27 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher | 1336 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 12500062 | |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16140071 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0261 | |
| Flow cytometer/cell sorter | BD | FACSARIA III | |
| H1299 | ATCC | RRID: CVCL_0060 | |
| H1975 | ATCC | RRID: CVCL_1511 | |
| Lightning-Link Fluorescein Kit | Innova Biosciences | 310-0010 | |
| linear accelerator | VARIAN | CLINAC 600C/D | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M7027 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 11875093 | |
| SYBRGREEN | TOYOBO | QPK-201 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Violet crystal staining solution | Solarbio | G1062 |
References
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