Radiosensibilidade de células-tronco cancerosas em linhas celulares de câncer de pulmão
Summary
A presença de células-tronco cancerosas tem sido associada com recidiva ou desfechos ruins após a radioterapia. Este manuscrito descreve os métodos para estudar a radiosensibilidade de células-tronco cancerosas em linhagens celulares de câncer de pulmão.
Abstract
A presença de células-tronco cancerosas (CSCs) tem sido associada à recidiva ou a desfechos ruins após a radioterapia. Estudar CSCs radioresistant pode fornecer indícios a superar o radioresistance. O canal de cálcio tensão-fechado α2δ1 o isoforma 5 da subunidade foi relatado como um marcador para CSCs radioresistant em linhas de pilha do cancro do pulmão da não-pequena pilha (NSCLC). Usando o canal de cálcio α2δ1 subunidade como um exemplo de um marcador do CSC, os métodos para estudar a radiosensibilidade de CSCs em linhas de pilha de NSCLC são apresentados. Os CSCs são classificados com marcadores putativos por citometria de fluxo, e a capacidade de autorenovação das células classificadas é avaliada pelo ensaio de formação da esfera. O ensaio de formação de colônias, que determina quantas células perdem a capacidade de gerar descendentes formando a colônia após uma certa dose de radiação, é então realizada para avaliar a radiosensibilidade das células classificadas. Este manuscrito fornece os passos iniciais para o estudo da radiosensibilidade das CSCs, que estabelece a base para uma maior compreensão dos mecanismos subjacentes.
Introduction
A radioterapia desempenha um papel importante no tratamento do câncer. No entanto, a existência de células-tronco de câncer radioresistente (CSCS) pode levar a recidiva ou a desfechos ruins após a radioterapia1,2. As CSCs são caracterizadas por sua capacidade de autorenovação e capacidade de gerar células cancerosas heterogéneas3. Blindado com uma capacidade de reparo de dano de DNA mais eficiente ou níveis mais altos de sistemas de eliminação de radicais livres ou outros mecanismos, CSCS são relativamente resistentes à radioterapia4,5,6,7 , 8. identificar os marcadores CSC e explorar seus mecanismos facilitará o desenvolvimento de fármacos que superarão a radiorresistência sem aumentar o dano tecidual normal.
O canal de cálcio tensão-fechado α2δ1 o isoforma 5 da subunidade foi relatado como um marcador para CSCs radioresistant em linhas de pilha de NSCLC9. α2δ1 foi originalmente identificado como um marcador CSC para carcinoma hepatocelular (HCC)10. Usando a imunização subtrativas com um par de linhas de pilha de HCC derivadas dos tumores preliminares e periódicos no mesmo paciente, um anticorpo nomeado 1b50-1 foi identificado para alvejar pilhas periódicas do HCC especificamente. as pilhas 1b50-1-positive mostraram a eficiência elevada da formação da esfera in vitro e o tumorigenicidade elevado in vivo. Seu antígeno foi identificado por espectrometria de massas, como canal de cálcio α2δ1 subunidade isoforma 5. α2δ1 expressa especificamente em CSCs e é indetectável em a maioria de tecidos normais, fazendo lhe um candidato potencial para alvejar CSCs10. α2δ1 pode igualmente servir como um marcador do CSC para linhas de pilha de NSCLC, e foi mostrado para transmitir radioresistance às pilhas de NSCLC parcialmente realçando a eficiência do reparo dos danos do ADN em resposta à radiação9.
Estudar CSCs radioresistant pode fornecer indícios a superar o radioresistance. Usando α2δ1 no NSCLC como um exemplo, os métodos principais para estudar a radiosensibilidade de CSCs são apresentados. Geralmente, CSCS são isolados com um marcador de superfície putativo, e as características da pilha de haste e a radiosensibilidade das populações positivas e negativas da pilha são comparadas. A formação da esfera em um meio soro-livre suplementado com os fatores de crescimento que apoiam a Self-renovação é um ensaio útil para avaliar o células das pilhas in vitro. Células com alta capacidade de formação de esfera são susceptíveis de apresentar tumorigenicidade elevada quando injetadas em camundongos imunodeficientes10,11,12. O ensaio de formação de colônias é então usado para avaliar a radiosensibilidade das células, o que determina quantos perderam a capacidade de gerar descendentes formando a colônia após uma dose de radiação13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve métodos para estudar a radiosensibilidade de CSCs em linhas de células cancerosas in vitro. Neste estudo, a expressão de α2δ1 é contínua em linhagens de células NSCLC. Portanto, a gating é baseada em um controle isotipo. Antes da triagem, a expressão de α2δ1 deve ser examinada em várias linhas celulares por citometria de fluxo e validada por QPCR ou Western Blot. Recomenda-se a reanálise da expressão α2δ1 das células α2δ1-High e α2δ1-Low classificadas por citometria de fluxo,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (81402535 e 81672969) e pelo projeto de pesquisa e desenvolvimento chave nacional (2016YFC0904703).
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red | Thermo Fisher | 15400054 | Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water |
| 1B50-1 | This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097) | ||
| 4% formaldehyde solution | Solarbio | G2160 | |
| A549 | ATCC | RRID: CVCL_0023 | |
| B27 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher | 1336 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 12500062 | |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16140071 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0261 | |
| Flow cytometer/cell sorter | BD | FACSARIA III | |
| H1299 | ATCC | RRID: CVCL_0060 | |
| H1975 | ATCC | RRID: CVCL_1511 | |
| Lightning-Link Fluorescein Kit | Innova Biosciences | 310-0010 | |
| linear accelerator | VARIAN | CLINAC 600C/D | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M7027 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 11875093 | |
| SYBRGREEN | TOYOBO | QPK-201 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Violet crystal staining solution | Solarbio | G1062 |
References
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