Radiosensibilità delle cellule staminali tumorali nelle linee cellulari del cancro del polmone
Summary
La presenza di cellule staminali tumorali è stata associata a ricadute o scarsi esiti dopo la radioterapia. Questo manoscritto descrive i metodi per studiare la radiosensibilità delle cellule staminali tumorali nelle linee cellulari del cancro polmonare.
Abstract
La presenza di cellule staminali tumorali (CSC) è stata associata a ricadute o scarsi esiti dopo la radioterapia. Lo studio dei CSC radioresistenti può fornire indizi per superare la radioresistenza. Il canale di calcio con cancello di tensione n. 2 è stato segnalato come marcatore per i CSC radioresistenti nelle linee cellulari del cancro del polmone non piccolo (NSCLC). Utilizzando il canale di calcio di 1 o più come esempio di marcatore CSC, vengono presentati metodi per studiare la radiosensibilità dei CSC nelle linee cellulari NSCLC. I CSC sono ordinati con marcatori putativi in base alla citometria di flusso e la capacità di auto-rinnovamento delle cellule ordinate viene valutata in base all’espressione di esempio di formazione. Il saggio di formazione della colonia, che determina quante cellule perdono la capacità di generare discendenti formando la colonia dopo una certa dose di radiazioni, viene quindi eseguito per valutare la radiosensibilità delle cellule ordinate. Questo manoscritto fornisce i primi passi per studiare la radiosensibilità dei CSC, che stabilisce le basi per un’ulteriore comprensione dei meccanismi sottostanti.
Introduction
La radioterapia svolge un ruolo importante nel trattamento del cancro. Tuttavia, l’esistenza di cellule staminali tumorali radioresistenti (CSC) può portare a ricadute o a scarsi esiti dopo la radioterapia1,2. I CSC sono caratterizzati dalla loro capacità di auto-rinnovamento e dalla capacità di generare cellule tumorali eterogenoe3. Corazzati con una capacità di riparazione dei danni al DNA più efficiente o livelli più elevati di sistemi di scavenging a radicali liberi o altri meccanismi, i CSC sono relativamente resistenti alla radioterapia4,5,6,7 , 8. L’identificazione dei marcatori CSC e l’esplorazione dei loro meccanismi faciliterà lo sviluppo di farmaci che supereranno la radioresistenza senza aumentare i normali danni ai tessuti.
Il canale di calcio con tensione-gated n. 2 – 1 isoforme 5 è stato segnalato come marcatore per i CSC radioresistenti nelle linee cellulari NSCLC9. L’H2-1 è stato originariamente identificato come marcatore CSC per il carcinoma epatocellulare (HCC)10. Utilizzando l’immunizzazione sottrattiva con una coppia di linee cellulari HCC derivate dai tumori primari e ricorrenti nello stesso paziente, è stato identificato un anticorpo denominato 1B50-1 per colpire specificamente le cellule HCC ricorrenti. 1B50-1-positivo le cellule hanno mostrato un’elevata efficienza di formazione della sfera in vitro e un’elevata tumorigenicità in vivo. Il suo antigene è stato identificato dalla spettrometria di massa, come isometria di sottounità di calcio 2 . L’espresso da 2 a 1 espressamente nei CSC non è rilevabile nella maggior parte dei tessuti normali, rendendolo un potenziale candidato per il targeting dei CSC10. Il numero 2 può anche fungere da marcatore CSC per le linee cellulari NSCLC, ed è stato dimostrato che impartisce parzialmente la radioresistenza alle cellule NSCLC migliorando l’efficienza della riparazione dei danni al DNA in risposta alle radiazioni9.
Lo studio dei CSC radioresistenti può fornire indizi per superare la radioresistenza. Come esempio, l’uso di .2-1 nel NSCLC, vengono presentati i principali metodi per studiare la radiosensibilità dei CSC. Di solito, i CSC sono isolati con un marcatore di superficie putativo e vengono confrontate le caratteristiche delle cellule staminali e la radiosensibilità delle popolazioni cellulari positive e negative. La formazione di sfere in un mezzo privo di siero integrato con fattori di crescita che supportano l’auto-rinnovamento è un utile saggio per valutare lo stelo delle cellule in vitro. Le cellule con elevata capacità di formazione della sfera possono mostrare un’elevata tumoripotenza quando iniettate in topi immunodeficienti10,11,12. Il saggio di formazione della colonia viene quindi utilizzato per valutare la radiosensibilità delle cellule, che determina quanti hanno perso la capacità di generare discendenti formando la colonia dopo una dose di radiazioni13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive i metodi per studiare la radiosensibilità dei CSC nelle linee cellulari tumorali in vitro. In questo studio, l’espressione di “2” è continua nelle righe cellulari NSCLC. Pertanto, gating si basa su un controllo isotipo. Prima dell’ordinamento, l’espressione n. 2 s1 deve essere esaminata in più linee cellulari per citometria di flusso e convalidata da QPCR o macchia occidentale. Si raccomanda di analizzare nuovamente l’espressione di , 1, delle cellule ordinate di 1-alto e di 1-basso per cito…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81402535 e 81672969) e dal National Key Research and Development Project (2016YFC0904703).
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red | Thermo Fisher | 15400054 | Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water |
| 1B50-1 | This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097) | ||
| 4% formaldehyde solution | Solarbio | G2160 | |
| A549 | ATCC | RRID: CVCL_0023 | |
| B27 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher | 1336 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 12500062 | |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16140071 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0261 | |
| Flow cytometer/cell sorter | BD | FACSARIA III | |
| H1299 | ATCC | RRID: CVCL_0060 | |
| H1975 | ATCC | RRID: CVCL_1511 | |
| Lightning-Link Fluorescein Kit | Innova Biosciences | 310-0010 | |
| linear accelerator | VARIAN | CLINAC 600C/D | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M7027 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 11875093 | |
| SYBRGREEN | TOYOBO | QPK-201 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Violet crystal staining solution | Solarbio | G1062 |
References
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