Røntgen følsomhed af kræft stamceller i lungekræft cellelinjer
Summary
Tilstedeværelsen af kræft stamceller har været forbundet med tilbagefald eller dårlige resultater efter strålebehandling. Dette manuskript beskriver metoderne til undersøgelse af Cancer stamcellernes radio følsomhed i cellelinjer i lungecancer.
Abstract
Tilstedeværelsen af kræft stamceller (CSCs) har været forbundet med tilbagefald eller dårlige resultater efter strålebehandling. At studere radioaktive CSCs kan give ledetråde til at overvinde radioresistance. Spændings gated calcium kanal α2δ1 underenhed isoform 5 er blevet rapporteret som en markør for radioaktive CSCS i cellelinjer, der ikke er af småcellet lungecancer (NSCLC). Ved hjælp af calcium kanal α2δ1 underenhed som et eksempel på en CSC markør, metoder til at studere radiofølsomhed af CSCs i NSCLC cellelinjer præsenteres. CSCs er sorteret med formodede markører ved flow cytometri, og den selv fornyelseskapacitet af sorterede celler evalueres ved Sphere formation assay. Koloni dannelse assay, som bestemmer, hvor mange celler mister evnen til at generere efterkommere danner kolonien efter en vis dosis af stråling, er derefter udføres for at vurdere radiofølsomhed af sorteret celler. Dette manuskript giver de første skridt til at studere radio følsomheden af CSCs, som danner grundlag for yderligere forståelse af de underliggende mekanismer.
Introduction
Strålebehandling spiller en vigtig rolle i kræftbehandlingen. Eksistensen af radioaktive Cancer stamceller (CSCS) kan dog føre til tilbagefald eller dårlige resultater efter strålebehandling1,2. CSCs er karakteriseret ved deres selv fornyelsesevne og evne til at generere heterogene cancerceller3. Pansret med en mere effektiv DNA-skade reparations kapacitet eller højere niveauer af frie radikaler skylle systemer eller andre mekanismer, er CSCS relativt modstandsdygtige over for strålebehandling4,5,6,7 , 8. identificering af CSC-markører og udforskning af deres mekanismer vil lette udviklingen af lægemidler, der vil overvinde radioresistance uden at øge den normale vævsskade.
Spændings gated calcium kanal α2δ1 underenhed isoform 5 er blevet rapporteret som en markør for radioaktive CSCS i NSCLC cellelinjer9. α2δ1 blev oprindeligt identificeret som en CSC-markør for hepatocellulært karcinom (HCC)10. Ved hjælp af subtraktiv immunisering med et par HCC-cellelinjer afledt af de primære og tilbagevendende tumorer i den samme patient, blev et antistof ved navnet 1B50-1 identificeret til at målrette tilbagevendende HCC-celler specifikt. 1B50-1-positive celler viste høj sfære dannelse effektivitet in vitro og høj tumorigenicitet in vivo. Dets antigen blev identificeret ved massespektrometri, som calcium kanal α2δ1 underenhed isoform 5. α2δ1 udtrykker specifikt i CSCs og er ikke målbart i de fleste normale væv, hvilket gør det til en potentiel kandidat til målretning af CSCs10. α2δ1 kan også fungere som en CSC-markør for NSCLC-cellelinjer, og det har vist sig at give radioresistance til NSCLC-celler delvist ved at øge effektiviteten af reparation af DNA-skader som reaktion på stråling9.
At studere radioaktive CSCs kan give ledetråde til at overvinde radioresistance. Brug af α2δ1 i NSCLC som et eksempel, er vigtige metoder til at studere radio følsomheden af CSCs præsenteret. Normalt er CSCs isoleret med en formodet overflade markør, og stamcelle egenskaberne og radio følsomheden af de positive og negative cellepopulationer sammenlignes. Kugle dannelse i et serumfrit medium suppleret med vækstfaktorer, der understøtter selvfornyelse er en nyttig analyse til at evaluere stemhed af celler in vitro. Celler med høj sfære dannelse kapacitet vil sandsynligvis vise høj tumorgenicitet når injiceres i immundefekt mus10,11,12. Koloni dannelse assay bruges derefter til at vurdere radiofølsomhed af celler, som afgør, hvor mange har mistet evnen til at generere efterkommere danner kolonien efter en dosis af stråling13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver metoder til at studere radio følsomheden af CSCs i Cancer cellelinjer in vitro. I dette studie er ekspression af α2δ1 kontinuerlig i NSCLC-cellelinjer. Derfor er gating baseret på en isotype kontrol. Før sortering skal α2δ1-ekspression undersøges i flere cellelinjer ved flow cytometri og valideres af QPCR eller Western blot. Det anbefales at re-analysere α2δ1 ekspression af de sorterede α2δ1-høje og α2δ1-Low-celler ved flow cytometri, ved at observere fluorescens under et fluoresce…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation i Kina (81402535 og 81672969) og nationalt nøgle forsknings-og udviklingsprojekt (2016YFC0904703).
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red | Thermo Fisher | 15400054 | Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water |
| 1B50-1 | This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097) | ||
| 4% formaldehyde solution | Solarbio | G2160 | |
| A549 | ATCC | RRID: CVCL_0023 | |
| B27 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher | 1336 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 12500062 | |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16140071 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0261 | |
| Flow cytometer/cell sorter | BD | FACSARIA III | |
| H1299 | ATCC | RRID: CVCL_0060 | |
| H1975 | ATCC | RRID: CVCL_1511 | |
| Lightning-Link Fluorescein Kit | Innova Biosciences | 310-0010 | |
| linear accelerator | VARIAN | CLINAC 600C/D | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M7027 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 11875093 | |
| SYBRGREEN | TOYOBO | QPK-201 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Violet crystal staining solution | Solarbio | G1062 |
References
- Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells–perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Recherche en cancérologie. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Wang, W. J., et al. MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells. Recherche en cancérologie. 73 (3), 1219-1231 (2012).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Gomez-Casal, R., et al. Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes. Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).
- Mihatsch, J., et al. Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro. Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).
- Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. Calcium channel α2δ1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines. Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).
- Zhao, W., et al. 1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel α2δ1 subunit. Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).
- Zhang, W. C., et al. Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis. Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- O’Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. Cancer stem cells and self-renewal. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).
- Morgan, M. A., Lawrence, T. S. Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways. Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).
- Yu, J., et al. Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel α2δ1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer. Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).
