Akciğer Kanseri Hücre Hatlarında Kanser Kök Hücrelerinin Radyosensitivite
Summary
Kanser kök hücrelerinin varlığı radyoterapi sonrası nüks veya kötü sonuçlar ile ilişkili olmuştur. Bu el yazması akciğer kanseri hücre hatlarında kanser kök hücrelerinin radyosensitivite çalışma yöntemleri açıklar.
Abstract
Kanser kök hücrelerinin varlığı (CSCs) radyoterapi sonrası nüks veya kötü sonuçlar ile ilişkili olmuştur. Radyodirençli CSC’lerin incelenmesi radyodirencini aşmaya ipucu verebilir. Voltaj kapılı kalsiyum kanal α2δ1 alt birim isoform 5 küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hücre hatlarında radyodirençli CSC’ler için bir belirteç olarak bildirilmiştir. Kalsiyum kanal α2δ1 alt ünitesi bir CSC belirteci örneği olarak kullanılarak, NSCLC hücre hatlarındaki CSC’lerin radyosensitliyi inceleme yöntemleri sunulmuştur. CSC’ler akış sitometrisine göre putatif belirteçlerle sıralanır ve sıralanmış hücrelerin kendini yenileme kapasitesi küre oluşumu tetkikleriyle değerlendirilir. Belirli bir doz radyasyondan sonra koloniyi oluşturan soyundan gelen leri üretme yeteneğini kaç hücrenin kaybettiğini belirleyen koloni oluşumu teşhebi, daha sonra sıralanmış hücrelerin radyosenliğini değerlendirmek için gerçekleştirilir. Bu makale, temel mekanizmaların daha iyi anlaşılması için temel oluşturan CSC’lerin radyoduyarlılığının incelenmesi için ilk adımları sağlar.
Introduction
Radyoterapi kanser tedavisinde önemli bir rol oynar. Ancak, radyodirençli kanser kök hücrelerinin varlığı (CSCs) radyoterapi sonrası nüks veya kötü sonuçlara yol açabilir1,2. CSC’ler kendi kendini yenileme kapasiteleri ve heterojen kanser hücrelerini üretme yetenekleriilekarakterizedir 3. Daha verimli bir DNA hasar onarım kapasitesi veya serbest radikal atma sistemleri veya diğer mekanizmalar daha yüksek düzeyde zırhlı, CSCs radyoterapi nispeten dayanıklı4,5,6,7 , 8. CSC belirteçlerinin belirlenmesi ve mekanizmalarının araştırılması, normal doku hasarını artırmadan radyodirencinin üstesinden gelecek ilaçların gelişimini kolaylaştıracaktır.
Voltaj kapılı kalsiyum kanal α2δ1 alt birim isoform 5 NSCLC hücre hatlarında radyoya dirençli CSC’ler için bir belirteç olarak bildirilmiştir9. α2δ1 başlangıçta hepatosellüler karsinom (HCC)10için csc belirteci olarak tanımlanmıştır. Aynı hastada primer ve tekrarlayan tümörlerden elde edilen bir çift HCC hücre hattı ile subtraktif bağışıklama kullanılarak özellikle tekrarlayan HCC hücrelerini hedef almak için 1B50-1 adlı bir antikor tespit edildi. 1B50-1-pozitif hücreler de in vitro ve yüksek tümörijenite in vivo yüksek küre oluşumu verimliliği gösterdi. Antijeni kütle spektrometresi ile tanımlanmıştır, kalsiyum kanal α2δ1 alt birim isoform 5 olarak. α2δ1 özellikle CSC’lerde ifade edilir ve çoğu normal dokuda tespit edilemez, bu da cscs10hedefleme için potansiyel bir aday yapma. α2δ1 ayrıca NSCLC hücre hatları için csc belirteci olarak da hizmet verebilir ve radyasyona yanıt olarak DNA hasar onarım verimliliğini artırarak kısmen NSCLC hücrelerine radyodirenç vermek için gösterilmiştir9.
Radyodirençli CSC’lerin incelenmesi radyodirencini aşmaya ipucu verebilir. Örnek olarak NSCLC’de α2δ1 kullanılarak, CSC’lerin radyosenliğini incelemek için önemli yöntemler sunulmuştur. Genellikle, CSC’ler putatif yüzey belirteci ile izole edilir ve pozitif ve negatif hücre popülasyonlarının kök hücre özellikleri ve radyosensitivitesi karşılaştırılır. Kendini yenilemeyi destekleyen büyüme faktörleri ile desteklenen serumsuz bir ortamda küre oluşumu, hücrelerin köksünün in vitro olarak değerlendirilmesinde yararlı bir tahkikattır. Yüksek küre oluşum kapasitesine sahip hücreler immünoeksik fareler içine enjekte edildiğinde yüksek tümörijenite göstermek olasıdır10,11,12. Koloni oluşumu tahsin daha sonra hücrelerin radyosensitliyi değerlendirmek için kullanılır, hangi kaç radyasyon bir doz sonra koloni oluşturan torunları oluşturmak için yeteneğini kaybetmiş belirler13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, kanser hücre hatlarındaki CSC’lerin in vitro radyosensitifliğini inceleme yöntemlerini açıklamaktadır. Bu çalışmada NSCLC hücre hatlarında α2δ1 ifadesi süreklidir. Bu nedenle, gating bir iyotip kontrolüne dayanır. Sıralamadan önce α2δ1 ifadesi akış sitometrisi ile birden fazla hücre hattında incelenmeli ve QPCR veya western blot tarafından doğrulanmalıdır. Α2δ1 ekspresyonunun akış sitometrisi tarafından, floresan mikroskobun altında veya QPCR (sıralamadan sonra) tarafında…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81402535 ve 81672969) ve Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Projesi (2016YFC0904703) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red | Thermo Fisher | 15400054 | Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water |
| 1B50-1 | This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097) | ||
| 4% formaldehyde solution | Solarbio | G2160 | |
| A549 | ATCC | RRID: CVCL_0023 | |
| B27 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher | 1336 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 12500062 | |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16140071 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0261 | |
| Flow cytometer/cell sorter | BD | FACSARIA III | |
| H1299 | ATCC | RRID: CVCL_0060 | |
| H1975 | ATCC | RRID: CVCL_1511 | |
| Lightning-Link Fluorescein Kit | Innova Biosciences | 310-0010 | |
| linear accelerator | VARIAN | CLINAC 600C/D | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M7027 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 11875093 | |
| SYBRGREEN | TOYOBO | QPK-201 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Violet crystal staining solution | Solarbio | G1062 |
References
- Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells–perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Recherche en cancérologie. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Wang, W. J., et al. MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells. Recherche en cancérologie. 73 (3), 1219-1231 (2012).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Gomez-Casal, R., et al. Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes. Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).
- Mihatsch, J., et al. Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro. Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).
- Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. Calcium channel α2δ1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines. Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).
- Zhao, W., et al. 1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel α2δ1 subunit. Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).
- Zhang, W. C., et al. Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis. Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- O’Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. Cancer stem cells and self-renewal. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).
- Morgan, M. A., Lawrence, T. S. Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways. Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).
- Yu, J., et al. Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel α2δ1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer. Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).
