Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

توصيف الحويصلات خارج الخلية المشتقة من الخلايا المناعية ودراسة التأثير الوظيفي على بيئة الخلية

Published: June 2, 2020 doi: 10.3791/60118
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

Summary

يسلط هذا التقرير الضوء على المتطلبات الزمنية لعزل الحويصلات خارج الخلية (EV) عن الميكروجليا أو الضامة الدموية. تم تقييم المركبات الكهربائية المشتقة من Microglia كجهات تنظيمية للنمو النيوريفي في حين تمت دراسة المركبات الكهربائية المشتقة من الضامة الدم في السيطرة على غزو خلايا الدبقي C6 في الاختبارات المختبرية. والهدف هو فهم أفضل لهذه الوظائف EV كوسطاء المناعة في بيئات دقيقة محددة.

Abstract

تلعب الحالة العصبية العصبية للجهاز العصبي المركزي (CNS) دورًا رئيسيًا في الحالات الفسيولوجية والمرضية. Microglia، والخلايا المناعية المقيمة في الدماغ، وأحيانا الضامة المشتقة من نخاع العظم التسلل (BMDMs)، وتنظيم الشخصية الالتهابية من بيئتها الدقيقة في الجهاز العصبي المركزي. ومن المسلم به الآن أن الحويصلات خارج الخلية (EV) السكان من الخلايا المناعية بمثابة وسطاء المناعة. وبالتالي، فإن جمعها وعزلها مهمان لتحديد محتوياتها ولكن أيضا تقييم آثارها البيولوجية على الخلايا المتلقية. تسلط البيانات الحالية الضوء على المتطلبات الزمنية لعزل EV من خلايا microglia أو الضامة الدموية بما في ذلك خطوات الترفيع والكروماتوغرافيا للحجم الاستبعاد (SEC). وسمح تحليل بروتوميلي غير مستهدف بالتحقق من صحة توقيعات البروتين كعلامات EV ووصف محتويات EV النشطة بيولوجياً. كما استخدمت المركبات الكهربائية المشتقة من الميكروجليا وظيفيا على الثقافة الأولية للخلايا العصبية لتقييم أهميتها كوسطاء المناعة في نمو neurite. وأظهرت النتائج أن المركبات الكهربائية المشتقة من الميكروغليا تساهم في تسهيل نمو النيورايت في المختبر. في موازاة ذلك، تم استخدام المركبات الكهربائية المشتقة من الضامة الدم وظيفيا كوسطاء مناعية في الثقافات الكروية لخلايا الورم الدبقي C6، وتظهر النتائج أن هذه المركبات الكهربائية تتحكم في غزو خلايا الورم الدبقي في المختبر. يسلط هذا التقرير الضوء على إمكانية تقييم وظائف الخلايا المناعية بوساطة EV ولكن أيضًا فهم الأسس الجزيئية لمثل هذا الاتصال. يمكن أن يعزز هذا فك التشفير استخدام الحويصلات الطبيعية و / أو الإعداد في المختبر للحويصل العلاجية من أجل تقليد الخصائص المناعية في البيئة الدقيقة لباثولوجيا CNS.

Introduction

ترتبط العديد من الأمراض العصبية بحالة الالتهاب العصبي وهي آلية معقدة يتم النظر فيها بشكل متزايد ، ولكنها لا تزال غير مفهومة بشكل جيد لأن العمليات المناعية متنوعة وتعتمد على بيئة الخلية. في الواقع ، لا تنطوي اضطرابات الجهاز العصبي المركزي بشكل منهجي على نفس إشارات التنشيط وخلايا الخلايا المناعية ، وبالتالي يصعب تقييم الاستجابات المؤيدة أو المضادة للالتهابات كأسباب أو عواقب للأمراض. الضامة المقيمين في الدماغ ودعا "microglia" ويبدو أن في واجهة بين الجهاز العصبي والجهاز المناعي1. Microglia لها أصل النخاع وتستمد من كيس صفار خلال الهيماتوبوسيات البدائية لاستعمار الدماغ، في حين يتم اشتقاق الضامة المحيطية من الكبد الجنيني خلال الهيماتوبوسيات النهائية لتصبح الضامة الطرفية2. الخلايا microglia التواصل مع الخلايا العصبية والخلايا الدبقية المستمدة من الخلايا العصبية مثل الخلايا الفلكية وoligodendrocytes3. وقد أظهرت العديد من الدراسات الحديثة أن microglia تشارك في اللدونة العصبية خلال تطوير الجهاز العصبي المركزي وتناط الأنسجة الكبار، وأيضا في حالة التهابية المرتبطة الأمراض العصبية التنكسية4,,5. خلاف ذلك ، يمكن أن تتعرض سلامة حاجز الدم في الدماغ للخطر في أمراض CNS الأخرى. الاستجابات المناعية، وخاصة في سرطان الورم الأرومي الدبقي المتعدد، لا تدعمها فقط خلايا microglia كما يتم إعادة تنظيم حاجز الدم في الدماغ من خلال العمليات الوعائية ووجود الأوعية اللمفاوية6,7. لذلك ، يحدث تسلل كبير مشتق من نخاع العظم (BMDMs) في ورم الدماغ في جميع أنحاء آليات تولد الأوعية المعتمدة على الورم8. الخلايا السرطانية ممارسة تأثير كبير على BMDMs تسلل مما يؤدي إلى خصائص مثبطة للمناعة ونمو الورم9. وبالتالي فإن الاتصال بين الخلايا المناعية والبيئة الدقيقة في الدماغ من الصعب فهمه حيث أن أصل الخلية وإشارات التنشيط متنوعة10،11. ومن ثم فمن المثير للاهتمام للقبض على وظائف التوقيعات الجزيئية المرتبطة بالخلايا المناعية في الظروف الفسيولوجية. في هذا الصدد ، يمكن دراسة الاتصال بين الخلية بين الخلايا المناعية والبيئة الدقيقة للخلايا من خلال إطلاق الحويصلات خارج الخلية (EVs).

ويجري دراسة المركبات الكهربائية أكثر وأكثر في تنظيم وظائف المناعة في الظروف الصحية وكذلك المرضية12,13. يمكن أن تؤخذ في الاعتبار اثنين من السكان، الاكسوسومات وmicrovesicles. أنها تقدم مختلف biogenesis وحجم النطاقات. الاكسوزوات هي الحويصلات من ~ 30-150 نانومتر القطر ويتم إنشاؤها من النظام endosomal ويفرز ها خلال الانصهار من الهيئات متعددة المركبات (MVBs) مع غشاء البلازما. يبلغ قطر الميكروفيكسيخ حوالي 100-1000 نانومتر ويتم إنشاؤها من قبل الخارج الناشئة من غشاء بلازما الخلية14. لأن التمييز الخارجية مقابل الميكروفيكجل لا يزال من الصعب تحقيقه وفقا للحجم والأنماط الجزيئية، فإننا سوف تستخدم فقط مصطلح المركبات الكهربائية في هذا التقرير. يمثل الاتصال المرتبط بـ EV في الجهاز الوطني للأمراض الآلية الموروثة منذ أن أظهرت الدراسات مشاركتها في الأنواع اللافقارية بما في ذلك الديدان الخيطية أو الحشرات أو الأنليد15،16. وعلاوة على ذلك، فإن النتائج التي تبين أن المركبات الكهربائية يمكن التواصل مع الخلايا من أنواع مختلفة تثبت هذه الآلية لتكون نظام قفل المفتاح، على أساس أولا على التعرف على الجزيء السطحي بين الحويصلات والخلايا المتلقية ومن ثم السماح للاستفادة من الوسطاء16،17. في الواقع ، تحتوي المركبات الكهربائية على العديد من الجزيئات مثل البروتينات (على سبيل المثال ، الإنزيمات ، نقل الإشارة ، عامل التكوين الحيوي) ، الدهون (على سبيل المثال ، السيراميد ، الكوليسترول) أو الأحماض النووية (على سبيل المثال ، الحمض النووي ، مرنا أو ميرنا) التي تعمل كجهات تنظيمية مباشرة أو غير مباشرة لأنشطة الخلية المتلقية14. هذا هو السبب في إجراء دراسات منهجية أيضا على الخلايا المناعية لعزل المركبات الكهربائية وتوصيف تماما توقيعاتالبروتين18,19.

أظهرت الدراسات الأولى الإفراج عن الاكسوزوات من الميكروجليا الفئران المستزرعة الأولية كآلية لا يمكن اختزالها بعد تفعيل Wnt3a- أو السيروتونين المعتمدة20,21. وظيفيا في CNS, microglia المستمدة من المركبات الكهربائية تنظيم الإفراج عن الحويصلات متشابك من قبل المحطات presynaptic في الخلايا العصبية التي تسهم في السيطرة على الخلايا العصبية excitability22,23. يمكن أن تنشر المركبات الكهربائية المشتقة من Microglia أيضًا استجابة التهابية بوساطة السيتوكينات في مناطق الدماغ الكبيرة24،25. الأهم من ذلك، قد ligands متنوعة لعائلة مستقبلات مثل حصيلة تنشيط إنتاجات محددة من السيارات الكهربائية في microglia26. على سبيل المثال، في الدراسات المختبرية تظهر أن LPS تنشيط microglia BV2 خطوط الخلية تنتج محتويات EV التفاضلية بما في ذلك السيتوكينات الموالية للالتهابات27. ولذلك، فإن التنوع الوظيفي للمجموعات الفرعية للخلايا المناعية في الجهاز العصبي المركزي، والميكروغليا وأجهزة إدارة المباني المتسللة، يمكن تقييمه من خلال مجموعاتهم EV الخاصة بما في ذلك تأثير EV على الخلايا المتلقية وتحديد محتويات EV.

لقد وصفنا سابقا طرق لتقييم الخصائص الوظيفية لـ microglia - و BMDM المشتقة من المركبات الكهربائية بعد عزلتها16،19. في هذا التقرير، نقترح إجراء تقييم مستقل لتأثير المركبات الكهربائية المشتقة من الميكروغليا على نمو النيورايت، وتأثير المركبات الكهربائية المشتقة من الضامة على التحكم في مجاميع خلايا الورم الدبقي. تقترح هذه الدراسة أيضًا تحليلًا واسعًا للبروتوميميك لكسور EV من أجل التحقق من صحة إجراء عزل EV بالإضافة إلى تحديد توقيعات البروتين النشط بيولوجيًا. يمكن أن تساعد الآثار المفيدة وفك الرموز الجزيئية لمحتويات EV في التلاعب المحتمل واستخدامها كعوامل علاجية في اضطرابات الدماغ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الثقافة الأولية من Microglia / الضامة

  1. الثقافة الأولية للميكروجليا
    1. الاستزراع التجاري للفئران الميكروجليا الأولية (2 × 106 خلايا) (انظر جدول المواد)في متوسط النسر المعدل في دولبيككو (DMEM) المكمل بمصل خال من الاكسوسوم بنسبة 10٪، و 100 U/mL من البنسلين، و 100 ميكروغرام/مل العقدية، و9.0 جرام/لتر عند 37 درجة مئوية و5% CO2.
    2. جمع المتوسطة مشروطة بعد ثقافة 48 ح والمضي قدما في عزلة المركبات الكهربائية.
  2. الثقافة الأساسية للالضامة
    1. الاستزراع التجاري للفئران الضامة الأولية (1 × 106 خلايا) في الوسط الذي توفره الشركة المصنعة (انظر جدول المواد)عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2، مع مصل خال من الاكسوسوم.
    2. جمع المتوسطة مشروطة بعد ثقافة 24 ساعة والمضي قدما إلى عزل المركبات الكهربائية.

2- عزل المركبات الكهربائية

  1. ما قبل العزل ة للمركبات الكهربائية من المتوسط المكيف
    1. نقل وسيط الثقافة المكيفة من الثقافات microglia أو الضامة (الخطوات 1.1.2 أو 1.2.2) إلى أنبوب مخروطي.
    2. الطرد المركزي في 1200 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) لبيليه الخلايا.
    3. نقل supernatant إلى أنبوب مخروطي جديد. الطرد المركزي في 1200 × غرام لمدة 20 دقيقة في RT للقضاء على الأجسام المبرمجة.
    4. نقل supernatant إلى أنبوب البولي 10.4 مل ونقل الأنبوب إلى 70.1 تي الدوار. Ultraالطرد المركزي في 100،000 × ز لمدة 90 دقيقة في 4 درجة مئوية لبيليه المركبات الكهربائية.
    5. تخلص من supernatant وإعادة تعليق بيليه التي تحتوي على المركبات الكهربائية في 200 ميكرولتر من 0.20 ميكرومتر تصفية الفوسفات المالحة المخزنة (PBS).
  2. عزل المركبات الكهربائية
    1. إعداد العمود اللوني للحجم المحلي (SEC)
      1. إفراغ عمود كروماتوغرافي زجاجي (الطول: 26 سم؛ قطره: 0.6 سم) (انظر جدول المواد)،اغسله وتعقيمه.
      2. ضع فلتر 60 ميكرومتر في أسفل العمود.
      3. قم بتكديس العمود بمصفوفة قاعدة الترشيح لهلام agarose المترابطة لإنشاء مرحلة ثابتة قطرها 0.6 سم وارتفاع 20 سم.
      4. شطف المرحلة مع 50 مل من 0.20 ميكرون تصفية PBS. تخزين في 4 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق إذا لزم الأمر.
    2. ضع بيليه EV المُعيد تعليقه فوق المرحلة الثابتة لعمود SEC.
    3. جمع 20 كسور متتابعة من 250 ميكرولتر مع الاستمرار في إضافة 0.20 ميكرومتر تصفية PBS على الجزء العلوي من المرحلة الثابتة لمنع تجفيف العمود. تخزين الكسور في -20 درجة مئوية إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: يمكن إجراء تخزين أطول من أسبوع واحد عند -80 درجة مئوية للحفاظ على سلامة EV للتحليل الجزيئي.
  3. مصفوفة بمساعدة الليزر التأيوّت التأيّم (MALDI) تحليل الطيف الكتلي للكسور SEC
    1. انتقل إلى العزلEV كما هو موضح في القسم 2.2.
    2. إعادة تعليق بيليه EV مع 200 ميكرولتر من محلول مزيج معايرة الببتيد (انظر جدول المواد).
    3. انتقل إلى جمع EV كما هو موضح في الأقسام 2.2.1 إلى 2.2.3.
    4. تجفيف تماما كسر مع مكثف فراغ.
    5. إعادة تشكيل الكسور مع 10 ميكرولتر من 0.1٪ حمض تريفلورواسيك (TFA).
    6. اخلط 1 ميكرولتر من الكسر المعاد تشكيله مع 1 ميكرولتر من مصفوفة حمض α-cyano-4-hydroxycinnamic (HCCA) على لوحة هدف فولاذمصقول MALDI.
    7. تحليل جميع الكسور مع مطياف كتلة MALDI.
    8. تحليل الطيف المتولد مع برامج مخصصة (انظر جدول المواد).

3- توصيف المركبات الكهربائية

  1. تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)
    ملاحظة:     يتم إجراء تحليل NTA باستخدام أداة تحليل تتبع الجسيمات النانوية (انظر جدول المواد)ومضخة حقنة آلية.
    1. جعل تخفيف (نطاق 1:50 إلى 1:500) من كل كسر SEC من الخطوة 2.2.3 مع 0.20 ميكرون تصفية PBS.
    2. دوامة الحل للقضاء على المجاميع EV.
    3. وضع الحل المخفف في حقنة 1 مل ووضعه في مضخة حقنة الآلي.
    4. ضبط إعداد الكاميرا إلى مستوى كسب الشاشة (3) ومستوى الكاميرا (13).
    5. انقر على تشغيل وإطلاق السيناريو التالي.
      1. تحميل العينة في غرفة التحليل (معدل التسريب: 1000 ل15 سنة).
      2. تقليل واستقرار تدفق السرعة لتسجيل الفيديو (معدل التسريب: 25 لـ 15 s). التقاط ثلاثة أشرطة فيديو متتالية 60 s من تدفق الجسيمات.
      3. ضبط مستوى الكاميرا (13) وعتبة الكشف (3) قبل تحليل مقاطع الفيديو. انقر على الإعدادات| موافق لبدء التحليل وانقر على تصدير عندما يتم التحليل.
    6. بين كل تحليل كسر، يغسل مع 1 مل من 0.20 ميكرون تصفية PBS.
  2. تحليل المجهر الإلكتروني (EM)
    1. عزل المركبات الكهربائية كما هو موضح في القسم 2.
      ملاحظة: الشروط العقيمة غير مطلوبة.
    2. كرر القسم 3.1 لتحديد المركبات الكهربائية.
      ملاحظة: سيتم استخدام الكسور الإيجابية فقط لتحليل EM.
    3. استخدم فلتر 50 kDa centrifugal (انظر جدول المواد)لتركيز كسور SEC المحتوية على EV.
    4. إعادة تعليق المركبات الكهربائية المركزة في 30 ميكرولتر من 2٪ من بارافورمالديهايد (PFA).
    5. قم بتحميل 10 ميكرولتر من العينة على شبكة نحاسية مغلفة بالكربون.
    6. احتضان لمدة 20 دقيقة في بيئة مبللة.
    7. كرر الخطوات 3.2.5 و 3.2.6 لامتصاص جيد للعينة على الشبكة.
    8. نقل الشبكة إلى انخفاض 1٪ غلوتارالدهيد في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقيقة في RT.
    9. غسل العينة بالماء الترافيس عدة مرات.
    10. تباين العينة لمدة 10 دقيقة على الجليد مع خليط من خلات uranyl 4٪ و 2٪ ميثيل سيلولوز (1:9، v/v). إزالة فائض من الخليط باستخدام ورقة تصفية.
    11. تجفيف العينة ومراقبتها تحت المجهر الإلكتروني ناقل الحركة في 200 كيلو فولت (انظر جدول المواد).
  3. تحليل لطخة الغربية
    1. استخراج البروتين
      1. كرر الخطوات 3.2.1 إلى 3.2.3 لعزل المركبات الكهربائية وتركيزها.
      2. مزيج 50 ميكرولتر من العازلة RIPA (150 mm كلوريد الصوديوم [NaCl], 50 mM تريس, 5 mM الإيثيلين غليكول-بيس (2-أمينوثليتر)-N, N, N′, N′-حمض tetraacetic [EGTA], 2 mM حمض Ethylenediamine-tetraacetic [EDTA], 100 mM فلوريد الصوديوم [NaF], 10 mm الصوديوم بيروفوسفات, 1% Nonidet P-40, 1 mM Phenylmethanesulfonyl فلوريد [PMSF], 1x مثبط البروتياز) مع عينة EV (25 ميكرولتر الناتجة عن تركيز EV على مرشح) لمدة 5 دقائق على الجليد
      3. Sonicate لمدة 5 ق (السعة: 500 W؛ التردد: 20 كيلو هرتز)، 3 مرات على الجليد.
      4. إزالة حطام المركبات عن طريق الطرد المركزي في 20،000 × ز لمدة 10 دقيقة، في 4 درجات مئوية.
      5. جمع supernatant وقياس تركيز البروتين مع برادفورد طريقة قياس البروتين.
    2. الصوديوم dodecyl كبريتات البولياكريلاميد هلام electrophoresis (SDS-PAGE) والنشاف الغربي
      1. خلط مستخلصات البروتين (30 ميكروغرام) مع 5c Laemmli عينة عازلة (v / v).
      2. تحميل مزيج البروتين على هلام البولياكريلاميد 12٪.
      3. قم بترحيل البروتينات في الجل مع حاجز TGS (25 mM Tris pH 8.5 و 192 mM Glycine و 0.1٪ SDS) ، بسعر 70 V لمدة 15 دقيقة و 120 V لمدة 45 دقيقة.
      4. نقل البروتينات على غشاء النيتروسيللوز مع نظام شبه جاف في 230 V لمدة 30 دقيقة.
      5. تشبع الغشاء لمدة 1 ساعة في RT مع حظر المخزن المؤقت (0.05٪ Tween 20 ث / في، 5٪ مسحوق الحليب ث / في في 0.1 M PBS، درجة الحموضة 7.4).
      6. احتضان الغشاء بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع الماوس أحادي النسيلة المضادة للحرارة صدمة البروتين 90 (HSP90) الأجسام المضادة المخففة في سد العازلة (1:100).
      7. غسل الغشاء ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني-Tween (PBS، 0.05٪ Tween 20 ث / v) لمدة 15 دقيقة.
      8. احتضان الغشاء لمدة 1 ساعة في RT مع الفجل الماعز peroxidase-الاقتران المضادة للفأرة الأجسام المضادة للفأرة الأجسام المضادة الثانوية IgG المخفف في منع العازلة (1:10,000).
        ملاحظة: يتم إجراء عنصر تحكم سلبي باستخدام الأجسام المضادة الثانوية وحدها.
      9. كرر خطوة الغسيل (الخطوة 3.3.2.7).
      10. الكشف عن الغشاء مع تعزيز chemiluminescence (ECL) مجموعة الركيزة النشاف الغربية (انظر جدول المواد).
  4. تحليل البروتينات
    1. استخراج البروتين والهضم في هلام
      1. كرر الخطوات 3.2.1 إلى 3.2.3 لعزل المركبات الكهربائية وتركيزها. كرر الخطوة 3.3.1 لاستخراج البروتين EV.
      2. إجراء هجرة البروتين في هلام التراص من هلام البولياكريلاميد 12٪.
      3. إصلاح البروتينات في هلام مع الأزرق coomassie لمدة 20 دقيقة في RT.
      4. استئصال كل قطعة هلام ملونة وقطع عليه إلى قطع صغيرة من 1 ملم3.
      5. غسل قطع هلام على التوالي مع 300 ميكرولتر من كل الحلول: المياه فائقة النقاء لمدة 15 دقيقة، 100٪ أسيتونتريل (ACN) لمدة 15 دقيقة، 100 mm بيكربونات الأمونيوم (NH4HCO3)لمدة 15 دقيقة، ACN:100 mM NH4HCO3 (1:1، v/v) لمدة 15 دقيقة، و 100٪ ACN لمدة 5 دقيقة مع التحريك المستمر.
      6. الجافة تماما هلام القطع مع فراغ المكثف.
      7. إجراء تخفيض البروتين مع 100 ميكرولتر من 100 mM NH4HCO3 تحتوي على 10 mm dithiothreitol لمدة 1 ساعة في 56 درجة مئوية.
      8. إجراء الألكيلية البروتين ية مع 100 ميكرولتر من 100 mM NH4HCO3 تحتوي على 50 mm iodoacetamide لمدة 45 دقيقة في الظلام في RT.
      9. غسل قطع هلام على التوالي مع 300 ميكرولتر من كل حل: 100 mM من NH4HCO3 لمدة 15 دقيقة، ACN:20 mM NH4HCO3 (1:1، v/v) لمدة 15 دقيقة، و 100٪ ACN لمدة 5 دقيقة مع التحريك المستمر.
      10. تجفيف تماما قطع هلام مع مكثف فراغ.
      11. إجراء هضم البروتين مع 50 ميكرولتر من التربسين (12.5 ميكروغرام / مل) في 20 mM NH4HCO3 بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
      12. استخراج البروتينات المهضومة من هلام مع 50 ميكرولتر من 100٪ ACN لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية ثم 15 دقيقة في RT مع التحريك المستمر.
      13. كرر إجراءات الاستخراج التالية مرتين: 50 ميكرولتر من 5٪ TFA في 20 mNH4HCO3 حل لمدة 20 دقيقة مع التحريك المستمر.
      14. أضف 100 ميكرولتر من ACN 100% لمدة 10 دقيقة مع التحريك المستمر.
      15. البروتينات الجافة المهضومة مع مكثف فراغ وإعادة تعليق في 20 ميكرولتر من 0.1٪ TFA.
      16. Desalt العينة باستخدام تلميح ماصة 10 ميكرولتر مع C18 وسائط المرحلة العكسية لإزالة الملح وتركيز الببتيدات (انظر جدول المواد)والببتيدات الملتلة مع حمض الفورميك ACN:0.1٪ (FA) (80:20، v/v).
      17. تجفيف العينة تماما مع مكثف فراغ وإعادة تعليق في 20 ميكرولتر من ACN:0.1٪ FA (2:98، v/v) لكروماوغرافيا الطيفية الكتلة جنبا إلى جنب السائل (LC-MS/MS).
    2. تحليل LC-MS/MS
      1. تحميل الببتيد المهضوم في أداة LC-MS/MS وإجراء تحليل العينة والبيانات وفقا للمعلمات الموضحة بالتفصيل في مكان آخر42.
    3. تحليل البيانات الخام
      1. معالجة بيانات قياس الطيف الكتلي لتحديد البروتينات ومقارنة البروتينات المحددة لكل عينة مع حزمة برامج proteomics الكمية باستخدام المعلمات القياسية.
      2. التصدير ، وذلك باستخدام المعايير القياسية ، وقائمة من البروتينات الحصرية والممثلة تمثيلا زائدا من عينات إيجابية EV في برنامج التنبؤ شبكات البروتين والعمليات البيولوجية.
      3. قارن قائمة البروتينات المحددة في الكسور مع أعلى 100 علامات EV من قاعدة بيانات الوصول المفتوح Exocarta (انظر جدول المواد).

4. الكهربائية الفنية آثار القول

  1. Neurite outgrowth القول على خط الخلية PC-12
    1. ثقافة PC12 خط الخلية في كامل DMEM المتوسطة (2 mM L-الجلوتامين, 10% مصل حصان الجنين (FHS), 5% مصل البقر الجنين (FBS), 100 UI/mL البنسلين, 100 ميكروغرام/مل العقديات).
      ملاحظة: السيرا هي exosome الحرة في الإجراء كله.
    2. إضافة كوب غطاء (جميع الآبار) إلى لوحة 24 بئر؛ معطف لوحة مع بولي د-ليسين (0.1 ملغ / مل) والبذور 260،000 الخلايا / جيدا.
    3. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
    4. بعد 24 ساعة من الحضانة، قم بتغيير متوسط التمايز المتوسط إلى DMEM (DMEM مع 2 mM L-الجلوتامين، 0.1٪ FHS، 100 UI/mL البنسلين، 100 ميكروغرام/مل العقدية) مع 1 × 106 ميكروجليا EVs (من الخطوة 1.1.2).
      ملاحظة: يتم تنفيذ حالة التحكم بدون أجهزة السيارات الكهربائية الدقيقة في وسط التمايز.
    5. في اليوم 4 بعد البذر، تحميل جميع الآبار مع 100 ميكرولتر من المتوسط DMEM كاملة.
    6. في اليوم 7 بعد البذر، إصلاح الخلايا مع 4٪ PFA لمدة 20 دقيقة في RT وشطف ثلاث مرات (10 دقيقة لكل منهما) مع برنامج تلفزيوني.
    7. وصمال الخلايا بالرودامين المترافق ة بالبالويدين لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية وشطف 3 مرات (10 دقيقة لكل منهما) مع برنامج تلفزيوني.
    8. وصمال الخلايا مع هويشت المخفف 33342 (1:10,000) لمدة 30 دقيقة في RT وشطف 3 مرات (10 دقيقة لكل منهما) مع برنامج تلفزيوني.
    9. قم بتركيب زجاج الغطاء على شريحة مع متوسط تصاعد الفلورسنت (انظر جدول المواد).
    10. تحليل الشريحة مع المجهر confocal، واتخاذ 5 صور عشوائية من كل شريحة.
    11. قياس نمو النيوتنيباستخدام برنامج قياس كمي آلي (إجمالي طول النيوريت) كما هو موضح بالتفصيل في مكان آخر43.
  2. نيوريت خارج النمو على الخلايا العصبية الأولية الفئران
    1. معطف شريحة زجاجية 8 بئر مع بولي د-ليسين (0.1 ملغ/مل) واللامينين (20 ميكروغرام/مل).
    2. الخلايا العصبية الأولية التجارية الثقافة الفئران في الثقافة المناسبة المتوسطة (انظر جدول المواد)عن طريق الطلاء 50،000 الخلايا لكل بئر واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 ل 48 ساعة.
      ملاحظة: السيرا خالية من الاكسوسوم في الإجراء بأكمله.
    3. إضافة 1 × 106 microglia EVs إلى الخلايا العصبية ثقافة المتوسطة واحتضان في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 لمدة 48 ساعة أكثر.
      ملاحظة: يتم تنفيذ حالة التحكم دون microglia EVs في وسط ثقافة الخلايا العصبية.
    4. اتبع الخطوات 4.1.6 إلى 4.1.9 لإصلاح ووصمة عار الخلايا.
    5. اتبع الخطوات 4.1.10 و 4.1.11 لتحليل الشريحة.
  3. غزو خلية غليوما
    1. إعادة تعليق خلايا الدبقي للفئران C6 في متوسط DMEM الكامل (DMEM مع FBS 10٪، 2 mM L-الجلوتامين، 1x المضادات الحيوية) تحتوي على الكولاجين 5٪ بتركيز نهائي من 8000 خلية في 20 ميكرولتر.
      ملاحظة: السيرا خالية من الاكسوسوم في الإجراء بأكمله.
    2. ضع 5 مل من PBS في الجزء السفلي من طبق زراعة الأنسجة 60 مم. عكس قطرات الغطاء والإيداع من 20 ميكرولتر (8000 خلية) من تعليق الخلية على الجزء السفلي من الغطاء.
    3. عكس الغطاء على غرفة أسفل PBS مليئة واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 72 ساعة حتى يتم تشكيل spheroids الخلية.
    4. أضف 1 × 108 وحدات EVs الضامة (من الخطوة 1.2.2) إلى خليط الكولاجين 2.2 ملغم/مل (2 مل من محلول الكولاجين البقري من النوع الأول [3 ملغ/مل] مع 250 ميكرولتر من الحد الأدنى المتوسط الأساسي 10x (MEM) و500 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 0.1 M.
      ملاحظة: يتم تنفيذ حالة التحكم بدون أجهزة EVs الضامة في خليط الكولاجين.
    5. توزيع خليط الكولاجين الذي يحتوي على EVs في لوحة 24 بئر لتضمين spheroids الخلية.
    6. زرع الخلايا التي شكلت حديثا spheroids في وسط كل بئر.
    7. احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لترسيخ هلام.
    8. بعد ذلك ، تراكب 400 ميكرولتر من متوسط DMEM الكامل على مصفوفة الكولاجين في كل بئر.
    9. احتضان النظام الكامل لما مجموعه 6 أيام في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
      ملاحظة: يتم رصد غزو الخلية للخروج من spheroid عن طريق التصوير الرقمي باستخدام المجهر الخفيف المقلوب باستخدام هدف 4x/0.10 N.A.
    10. الحصول على صور كل بئر كل يوم.
    11. معالجة الصور وكمية غزو مناطق الخلايا spheroid باستخدام البرنامج كما وصفت سابقا في التفاصيل42.
      ملاحظة: تم تطبيع مناطق الغزو والسفيرويد لكل يوم للغزو ومناطق السفيرويد التي تم قياسها في اليوم 0.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أحد التحديات الرئيسية لعزو الآثار البيولوجية إلى الحويصلات خارج الخلية (EVs) هو القدرة على عزل المركبات الكهربائية من وسط الثقافة بأكملها. في هذا التقرير، نقدم طريقة باستخدام ultracentrifugation (UC) والكروماتوغرافيا حجم الاستبعاد (SEC) التي يقترن التحليل على نطاق واسع من توقيعات البروتين للتحقق من علامات EV وتحديد المركبات النشطة بيولوجيا. تم عزل المركبات الكهربائية المشتقة من الضامة أو الميكروجليا عن الوسط المكيف بعد ثقافة 24 ساعة أو 48 ساعة على التوالي(الشكل 1).

Figure 1
الشكل 1: جمع الحويصلات خارج الخلية (EV) واستراتيجيات العزل. تم فصل الأجسام المبرمجة وحطام الخلية عن المتوسطة المكيفة بالميكروغليا أو الضامة بواسطة خطوات الطرد المركزي المتعاقبة. من supernatant ، تم عزل المركبات الكهربائية بواسطة ultracentrifugation (UC). تم تحميل بيليه UC التي تحتوي على المركبات الكهربائية على العمود وفصلها عن طريق الكروماتوغرافيا الإقصاء الحجم (SEC) في 20 كسور مختلفة توصف. كما هو مكشوف في الخطوات الأخرى (المجهر الإلكتروني، وتحليل تتبع الجسيمات النانوية وتحليل البروتيني)، تم تجميع كسور SEC وتنظيمها في 1F-EV-، 2F-EV+ و 3F-EV-. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اتبعت الطريقة خطوات الطرد المركزي المتعاقبة: الأولى لإزالة الخلايا والثانية لإزالة الحطام الخلوي والأجسام المبرمجة. ثم، تم نقل supernatant إلى أنبوب جديد لأداء ultracentrifugation في 100،000 × ز لمدة 90 دقيقة. تم جمع الحويصلات جنبا إلى جنب مع مجاميع البروتين في بيليه جامعة كاليفورنيا النهائي. تم استخدام عمود SEC لفصل المركبات وفقًا لحجمها وإزالة المجاميع(الشكل 1). من أجل تأكيد عزلة المركبات الكهربائية ، يتبع كل جزء من SEC تحليل تتبع الجسيمات النانوية(الشكل 2A).

Figure 2
الشكل 2: تحليل كسور لجنة الأوراق المالية والبورصة. (أ)تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) من كسور SEC. يتم تقديم العدد الإجمالي للجسيمات في كل جزء SEC مع الرسوم البيانية الشريطية. تُظهر الرسوم البيانية الشريطية البرتقالية كسور EV+ الثلاثة المتتالية (F5-F7). (B, C) تظهر التقاطات الشاشة لغرفة NTA اختلافات كبيرة في تدفق الجسيمات بين كسور SEC. (D)تحليل قياس الطيف الكتلي التكميلي MALDI. من بيليه جامعة كاليفورنيا آخر يحتوي على المركبات الكهربائية، تمت إضافة مجموعة الببتيد التحكم القياسية قبل فصل SEC من أجل التحقق من صحة أداء استراتيجية SEC. تم تحليل كل كسر SEC مع التأين ليزر بمساعدة مصفوفة - وقت الرحلة (MALDI-TOF) لتحديد الكسور الإيجابية القياسية. في الأطياف التسعة الأولى (الكسور من 1 إلى 9)، لم تلاحظ أي إشارة. كان الكشف عن هذه المعايير الحرة ممكنًا في الكسور التالية (الكسور من 10 إلى 20) مما يؤكد قدرة إجراء SEC على فصل المركبات الكهربائية (F5-F7) عن المكونات القابلة للذوبان (F10-F20). (E)تحليل لطخة الغربية من كسور SEC كتحليل أولي علامة EV. تم تجميع كسور EV+ (F5-F7) كعينة واحدة (2F-VE+) في حين تم تجميع الكسور EV (F1-F4 و F8-F20 على التوالي) في عينتين آخرين تسمى 1F-EV- و 3F-EV-. وأظهرت النتائج وجود بروتين الحرارة صدمة 90 (HSP90) (علامة إيجابية EV) إشارة في 2F-EV+, وأيضا في خلية تحليل كتحكم إيجابي, مقارنة مع الكسور الأخرى (1F-EV-و 3F-EV-). (F, G) تحليل المجهر الإلكتروني للعينة الإيجابية EV (2F-EV+). وكشفت الملاحظة تحت التكبيرتين المتتاليتين عن وجود مركبات EVs في نطاق حجم يُحول 100 نانومتر (أسهم بيضاء) وحوالي 400 نانومتر (رأس السهم). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

كان عدد الجسيمات أعلى بكثير في الكسور 5 و6 و7 مما كان عليه في السابق (F1-F4) والتالية (F8-F20). كان من الممكن رؤية تدفق الجسيمات في هذه الكسور حتى لو لوحظ تجسيم قليلة في الكسور التالية(الشكل 2B, C). هذا الفصل لا يمنع احتمال أن كسور أخرى من F5-F7 قد تحتوي على كمية صغيرة من الحويصلات، أو حتى أن الكسور الغنية EV F5 إلى F7 قد تحتوي على ملوثات جزيئية. لضمان خلو الكسور F5-F7 على الأقل من جزيئات التلويث المشتركة، كان من الضروري اتباع اللاوتيون الزمني للمركبات المختلفة في إجراء SEC. للقيام بذلك، تمت إضافة معايير التحكم في الببتيد إلى بيليه UC مماثل كما كان مستخدمًا سابقًا. تم فصل هذا الإعداد مرة أخرى باستخدام إجراء SEC. ثم، مصفوفة بمساعدة التأين بالليزر التمايّل بالليزر - تم إجراء تحليل الطيف الكتلي لوقت الرحلة (MALDI) من أجل تحديد كسور SEC التي تم فيها الترويج للمعايير(الشكل 2D). بسبب نطاق الكتلة ، تم اتباع المنتجات المؤينة فقط من معايير الببتيد في هذا التحليل. وأظهرت النتائج أن هذه المنتجات يمكن اكتشافها في الكسور من 10 إلى 20، مما يدل على أن أي بروتين قابل للذوبان لا يمكن وصفه بنفس الكسور مثل المركبات الكهربائية (F5-F7). وأكدت هذه النتائج اهتمام هذا النهج بفصل المركبات الكهربائية عن المكونات غير EV. حتى على افتراض أن كسور F8-F20 يمكن أن تحتوي على جزء متبقي من المركبات الكهربائية، قررنا في التجارب التالية الجمع بين الكسور الإيجابية EV (F5-F7) في عينة واحدة تسمى 2F-EV+. كما قمنا بدمج كسور SEC الأخرى في عينتين تسمى 1F-EV- (F1-F4) و 3F-EV-(F8-F20). لقد قمنا بتجميع ثلاث عينات لعدة أسباب. أولاً، عدد كسور SEC سيزيد من وقت التحليلات الجزيئية ولكن أيضا وظيفية في الدراسات المختبرية. تعرض كسور SEC الإيجابية EV بشكل منفصل أرقام جسيمات أقل وتضر أيضًا بالكشف عن المركبات الجزيئية. وبنفس الطريقة، اعتُبر أكثر حكمة تجميع الكسور F8-F20 لتركيز الحويصلات المتبقية، إذا لزم الأمر، والتحقق من وجودها من خلال تحليل أولي لللطخة الغربية ضد HSP90، وهو علامة EV. ومن المثير للاهتمام، تم الكشف عن إشارة إيجابية لHSP90 في كسر 2F-EV+، أيضا في الخلية كما سيطرة إيجابية، ولكن ليس في 1F-EV-و 3F-EV-عينات(الشكل 2E والرقم التكميلي S1 كتحكم). يؤكد هذا التحليل اهتمام 2F-EV+ فقط والإدارة الصحيحة لكسور SEC السابقة. لتأكيد عزل EV ، تجربة إضافية باستخدام المجهر الإلكتروني تحليل فقط عينة 2F -EV + وسمحت بمراقبة المركبات الكهربائية مع مورفولوجيا نموذجية وعدم تجانس الحجم بين 100 و 400 نانومتر(الشكل 2F ، G).

وكانت خطوة رئيسية أخرى في التحقق من صحة التحليل البروتيني(الشكل 3). قمنا بتطوير تحليل الطيف الكتلي الشامل بأكمله بأهداف متعددة: (1) تأكيد عزلة المركبات الكهربائية مع الكشف عن عدد كبير من علامات EV في 2F-EV+، (ii) تحديد البروتينات الملوثة في العينات السلبية EV (1F-EV- و 3F-EV-) و (III) تميز محتويات البروتين من المركبات الكهربائية التي تدعم أنشطتها البيولوجية.

Figure 3
الشكل 3: التحليل البروتيني للعينات الإيجابية والسالبة للفيروس. (A)بعد ثلاثة عزلات EV مستقلة من الاستعدادات الخلية microglia مماثلة، تم تحميل عينات 1F-EV-، 2F-EV+ و 3F-EV- لكبريتات الصوديوم dodecyl polyacrylamide هلام electrophoresis (SDS-PAGE) وهاجر حتى هلام التراص لتركيز البروتينات من أجل تحقيق الهضم في هلام. ثم تم تحليل الببتيدات الناتجة عن طريق قياس الطيف الكتلي الترافد اللوني السائل (LC-MS/MS) لتحديد البروتينات المقابلة. (ب)مقارنة البروتينات المحددة بين العينات 1F-EV- و 2F-EV+ تظهر البروتينات الشائعة في كلا الكسور (19) والبروتينات المكتشفة حصريًا في كسر 2F-EV+ (522). تُظهر خريطة الحرارة التمثيل النسبي حيث كانت جميع البروتينات الشائعة بين 1F-EV- و2F-EV+ triplicates ممثلة تمثيلاً زائداً (أحمر) في عينات 2F-EV+ . (C)مقارنة بين البروتينات المحددة بين الكسور 2F-EV+ و 3F-EV- تظهر البروتينات الشائعة بين ثلاثية الثلاثيات (113) والبروتينات الممثلة حصريًا (428 في 2F-EV+ و 11 في 3F-EV-). تُظهر خريطة الحرارة التمثيل النسبي في مجموعتين. واحد (المجموعة A) يعرض 5 بروتينات ممثلة تمثيلا زائدا في 3F-EV-عينة والثاني (المجموعة B) يقدم 108 البروتينات الممثلة تمثيلا زائدا في 2F-EV+. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

من الوسائط المكيفة بالخلايا، أدى إجراء UC وSEC إلى ثلاث عينات 1F-EV-، 2F-EV+ و 3F-EV-. تم استخراج البروتينات المقابلة وتركيزها من قبل الصوديوم dodecyl كبريتات البولياكريلاميد هلام electrophoresis (SDS-PAGE). بعد هجرة قصيرة في هلام التراص ، تم جمع العينات من قبل ختان الفرقة ، ونقلها في أنابيب متميزة لتكون في هلام هضمها. تم فصل المنتجات عن طريق عكس على الانترنت الكروماتوغرافيا المرحلة المعكوسة مقرونة مباشرة إلى مطياف كتلة للتحليل(الشكل 3A).

تم الحصول على النتائج التالية ، كمثال على الإجراء بأكمله ، من متوسط مكيف ة الميكروغليا بعد ثقافة 48 ح. تم تقديم البيانات الأولية إلى قاعدة بيانات بروتين الفئران. تمت مقارنة البروتينات التي تم تحديدها بين العينات 1F-EV- و 2F-EV+(الشكل 3B)وبين العينات 2F-EV+ و 3F-EV-(الشكل3C). في المقارنة الأولى، أظهر الرسم البياني فين 19 بروتينًا شائعًا في كلا الكسور و522 بروتينًا تم اكتشافها حصريًا في كسر 2F-EV+ . سمح التحليل باستخدام برنامج بروتيومياتكمي لتحديد التمثيل النسبي للبروتينات الشائعة. وأظهرت النتائج خريطة حرارة حيث جميع البروتينات الشائعة بين 1F-EV- و 2F-EV + ثلاثية كانت ممثلة تمثيلا زائدا (أحمر) في عينات 2F-EV+ . في المقارنة الثانية بين الكسور 2F-EV+ و 3F-EV-، تم تحديد 113 بروتينشائع بين ثلاثية الأحيان. وعلاوة على ذلك، تم الكشف عن 428 بروتينا حصرا في 2F-EV + و 11 البروتينات وجدت حصرا في 3F-EV-. بعد التحليل الكمي، سلط تمثيل خريطة الحرارة للبروتينات الشائعة البالغ عددها 113 مجموعة حيث قدمت المجموعة A خمسة بروتينات ممثلة تمثيلاً زائداً في عينة 3F-EV، وقدمت المجموعة B 108 بروتينات ممثلة تمثيلاً زائداً في 2F-EV+.

تم تقديم البروتينات 428 ممثلة حصرا والبروتينات 108 ممثلة تمثيلا زائدا في 2F-EV + إلى قاعدة بيانات الوصول المفتوح Exocarta من أجل الكشف عن الجزيئات المرتبطة EV. سلط تحليل أعلى 100 علامة EV في إكسوكارتا الضوء على وجود 86 بروتينات مرتبطة بـ EV في 2F-EV +(الشكل 4A).

Figure 4
الشكل 4: تحليل البروتينات من عينة 2F-EV+ . (أ)تم تقديم مجموعة من 536 بروتين (428 بروتينات حصرية و 108 بروتينات ممثلة تمثيلاً زائداً) إلى قاعدة بيانات إكسوكارتا من أجل الكشف عن الجزيئات المرتبطة بEV. رموز جزيء من البروتينات 86 EV المرتبطة بها اكتشفت في أعلى 100 علامات EV من قاعدة بيانات Exocarta. (ب)أظهر التنبؤ بتفاعلات البروتين وارتباطها بعمليات بيولوجية مختارة مسارات مناعية وعصبية في عينة 2F-EV+ . يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ومن المثير للاهتمام أن تحليل البروتينات الشائعة الخمسة في المجموعة A والبروتينات الـ 11 الممثلة حصريًا في 3F-EV - لم ترتبط بأي علامة EV (البيانات غير معروضة). وأخيراً، أظهر التنبؤ بتفاعلات البروتين وارتباطها بعمليات بيولوجية مختارة وجود الوسطاء المناعيين في 2F-EV+(21%) تشارك في بعض الأحيان في السيطرة على الاستجابة الالتهابية (4.1٪ ) (الشكل4B). وترتبط محتويات EV في 2F-EV + أيضا مع تطوير الخلايا العصبية (16.8٪)، تمايز الخلايا العصبية (5٪) والسيطرة على الموت العصبي (3.8٪ ) وهو وفقا للاقول اتّهابالي النيوريت.

وهكذا ، فإن الاستراتيجية التي اخترناها تجعل من الممكن الوصول إلى جميع البيانات ويسمح بالتنبؤ بالوظائف بوساطة EV قبل المقالات البيولوجية التي قمنا بها بعد ذلك(الشكل 5).

Figure 5
الشكل 5: المقالات اللاإفريقية المعتمدة على EV. تم تقييم آثار المركبات الكهربائية المشتقة من الميكروغليا على نمو النيوريت (الإطار العلوي) وتم تقييم آثار المركبات الكهربائية المشتقة من الضامة على غزو خلايا الورم الدبقي (الإطار السفلي). (أ، ب) تم قياس طول النيوريت على خلايا PC-12 (تم تعديل اللوحة A من رافو روميرو وآخرين16 بإذن) أو الخلايا العصبية الأولية للفئران (B). وأظهرت النتائج زيادة كبيرة في النمو تحت المركبات الكهربائية (+ المركبات الكهربائية) مقارنة بالتحكم (Ctrl). شريط مقياس = 20 ميكرومتر.(C, D)دورة زمنية من C6 غزو جليوم الجليوويد في الكولاجين في وجود EVs المستمدة من الضامة الأولية الجرذان (C6 + EVs) أو السيارة (C6 التحكم). تم رصد غزو C6 spheroid 3D في الكولاجين وكمية تصل إلى 6 أيام. يتم عرض القياس الكمي لغزو الخلايا السرطانية في 1 أو 2 أو 3 أو 6 أيام (C) كما لوحظ في الصور التمثيلية (D). شريط المقياس = 500 ميكرومتر. بالنسبة لمقالات النمو النوية، تم حساب الأهمية من خلال اختبار t-Testللطالب غير المقترن (* p < 0.05 و** p < 0.01 و*** p < 0.001). وبالنسبة للفحص للغزو، تم حساب الأهمية من قبل ANOVA أحادية الاتجاه تليها اختبار توكي للوظيفة المخصصة. تشير أشرطة الخطأ إلى خطأ قياسي نسبي لثلاث تجارب مستقلة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وبهذه الطريقة، تمت دراسة الوظائف العصبية للمركبات الكهربائية المشتقة من الميكروجليا على خط الخلايا PC-12 والخلايا العصبية الأولية للفئران. وأظهرت النتائج تأثير إيجابي على نمو النيورايت(الشكل 5A, B). زاد وجود المركبات الكهربائية على التوالي حوالي 6 و 1.5 أضعاف شبكة neurite في الطول و / أو في العدد في PC-12 والخلايا العصبية الأولية مقارنة بحالة التحكم. وفي سياق آخر، درسنا أيضا آثار المركبات الكهربائية المشتقة من الضامة على غزو ورم الدماغ(الشكل 5C, D). تم تقييمه باستخدام السفير الورم ثلاثي الأبعاد المضمنة في مصفوفة الكولاجين. تم استزراع السفيرويدات المتولدة مع خلايا الدبقي للفئران C6 لمدة 6 أيام في مصفوفة الكولاجين التي تحتوي على (أو لا تحتوي على) EVs المنقى من وسيط ثقافة الضامة الفئران. توفر مصفوفة الكولاجين بنية يمكن أن تغزو فيها الخلايا السرطانية وتنتشر خارج السفيرويد. وأعاقت المركبات الكهربائية المشتقة من الضامة نمو وغزو السفيرالة الدبقية. بعد ثقافة 6 أيام ، لوحظ انخفاض بنسبة 50٪ من الغزو في السفيات المعالجة بـ EV مقارنة بعنصر التحكم. وأظهرت هذه النتيجة أن الضامة يمكن أن تنتج المركبات الكهربائية مع العوامل المضادة للورم و / أو المضادة للالغازية التي تؤثر على نمو الورم الدبقي.

Supplementary Figure S1
الرقم التكميلي S1: صور من الغشاء المستخدمة في تجربة النشاف الغربي. (أ)الصورة الأصلية لللطخة الغربية من الشكل 2E (ضد علامة HSP90 EV). (ب)Ponceau تلطيخ صورة من نفس الغشاء تظهر التحميل الصحيح من مستخلصات البروتين من 1F-EV-، 2F-EV+ و 3F-EV-عينات. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الجهاز العصبي المركزي (CNS) هو نسيج معقد ينظم فيه الاتصال من خلية إلى خلية وظائف الخلايا العصبية العادية اللازمة لـ التوازن30. تتم الآن دراسة المركبات الكهربائية على نطاق واسع ووصفها بأنها شحنات جزيئية مهمة للاتصال من الخلية إلى الخلية31. أنها توفر على وجه التحديد مزيج من الوسطاء إلى الخلايا المتلقية مما يؤثر على وظائفها في ظروف صحية ومرضية32. تشير الدراسات الحديثة إلى أن المركبات الكهربائية تلعب دورا حاسما في الجهاز العصبي المركزي24,33,34 وخاصة تلك من خلايا الدماغالمناعية 35,36. التوازن بين الاستجابات المناعية المؤيدة والمضادة للالتهابات أمر بالغ الأهمية ويسمح بالحفاظ على سلامة الدماغ أثناء التطور المتشابك وأنشطة الخلايا العصبية طوال الحياة. تمت مناقشة حالتين متميزتين من الاستجابات المناعية في هذه الدراسة: العلاقة (1) بين الميكروغليا والخلايا العصبية و (2) بين البلفة المتسللة وخلايا الورم الدبقي. أولاً ، microglia هي الضامة المقيمة في أنسجة الدماغ حيث تلعب دوراً المناعي الرئيسي في إدارة التغيرات البيئية الدقيقة من أجل ضمان أنشطة الخلايا العصبية. ولكن يمكن دعم الآليات المفرطة المؤيدة للالتهابات عن طريق الإفراط في تنشيط microglia وتؤدي إلى اضطرابات عصبية37،38. في المقابل ، تتطلب الأورام الدبقية عالية الجودة ملفات تعريف مضادة للالتهابات وتشمل الضامة المرتبطة بالورم (TAMs) المجندة في موقع الورم. تمثل الضامة المشتقة من نخاع العظم (BMDMs) مجموعة كبيرة من هذه الـ TAMs في علاقة وثيقة مع خلايا الورم الدبقي. تحت تأثير الورم, BMDMs المعرض في الجسم الحي المضادللالتهابات والموالية للورم ملامح39. كيف يمكن لهذه BMDMs السيطرة في غزو الخلايا السرطانية في المختبر هو سؤال حاسم في هذا التقرير. هذا هو السبب ، تم استخدام المركبات الكهربائية المشتقة من الضامة وحدها في شهادة غزو الجليوم. معا في الثقافة المشتركة، والخلايا الدبقي قد أثرت على الضامة لإنتاج مجموعات EV أخرى مع ملامح المضادة للالتهابات. الاستخدام المباشر للمركبات المناعة يمكن أن يكون أفضل بكثير كعامل مضاد للورم. وبالتالي ، تحافظ الخلايا المناعية على الاتصال من خلية إلى خلية في بيئات دقيقة محددة حيث يتأثر التوازن الالتهابي بشدة بالإشارات الخارجية40،41. يمثل فهم الاستجابات المناعية بوساطة EV تحديًا كبيرًا للحد من مسببات العديد من الاضطرابات. تحديد محتويات EV النشطة بيولوجيا هو مفتاح واحد لفهم العمليات الالتهابية dysregulated واقتراح استراتيجيات علاجية جديدة42،43.

في هذه الدراسة نقدم منهجية تتكون من عملية التألياب الفائق التفاضلي كخطوة أولى للقضاء على حطام الخلية والأجسام المبرمجة والجزيئات القابلة للذوبان ، إلى جانب الكروماتوغرافيا الاستبعادية الحجم لعزل المركبات الكهربائية من المجاميع الجزيئية. عندما يتم تقييم مجموعات EV في المقايسات البيولوجية، فمن الأهمية بمكان التمييز بين محتويات EV من المواد الأخرى المعزولة المشتركة. هذا هو السبب في أننا تحسين العزلة من أجل فصل EV- من المركبات غير EV المرتبطة بها. من خلال إضافة البروتينات القياسية في عينات التحكم المقدمة إلى إجراء SEC ، تمكنا بعد ذلك من توطين كسورelution بواسطة MALDI-TOF. لأن المعايير هي جزيئات حرة، فإنها على الصعيد العالمي تشارك elute مع المجاميع الجزيئية المرتبطة بالعينة المتعلقة المواد غير EV. وهكذا، تم التحقق من كسور EV من عينات تجريبية في إجراء عزل موثوق بها. وبالإضافة إلى ذلك، وضعنا استراتيجية تحليل بروتوميميك مزدوجة. باستثناء استخدام الأجسام المضادة المضادة HSP90 بواسطة النشاف الغربي ككشف أولي لعلامة EV ، قررنا التحقق من صحة كسر EV الصحيح عن طريق الكشف غير المستهدف عن توقيعات البروتين المرتبطة EV. والواقع أن النهج الحالي لم يركز عمداً على الكشف عن علامات EV المتعددة المعروفة بسبب عدم كفاية خصوصية وحساسية بعض الأجسام المضادة. ولا يزال تقلب ووفرة بعض علامات EV على سطح الفئات الفرعية للفيروس مثيراللجدل في إجراءات العزل. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تمثل المنهجية القائمة على الأجسام المضادة حداً في عدد كبير من الكائنات الحية بسبب نقص الأجسام المضادة التجارية في حين أن دراسات EV هي الآن موضوع ساخن في علم الأحياء. سمح هذا التحليل غير المستهدف بتحديد عدد أكبر من الجزيئات التي توصف بالفعل بعلامات EV (86 بروتينًا في أعلى 100 علامة EV من قاعدة بيانات Exocarta). وأخيراً، يمكن أن يكون هذا النهج مفيداً حقاً للتحقق من صحة عزل EV من الكائنات الحية الموصوفة بشكل سيئ شريطة أن البروتينات المكتشفة يمكن أن تقدم تجانسات كبيرة لعلامات EV المعروفة. كما وصف مؤخرا، تحليل البروتينعلى نطاق واسع يمكن أن يكون بديلا لاستخدام فقط عدد قليل من علامات التعسفي43. وهذا من شأنه أن يحسن التمييز بين كسور EV+ وتحديد محتوياتها النشطة قبل استخدامها في المقالات البيولوجية.

في الواقع ، من الضروري ربط توصيف محتويات EV بالآثار التي لوحظت في المقالات البيولوجية. والواقع أن الأثر البيولوجي للمركبات الكهربائية على الخلايا المتلقية يوحي بتورط وسطاء أو مؤثرات في المركبات. ومرة أخرى، يسمح التحليل غير المستهدف نفسه بتحديد الجزيئات النشطة بيولوجيا. التحسين الممكن في هذا التحليل يتعلق بأنواع الجزيئات التي من الممكن تحديدها. واستندت استراتيجيتنا على تحليل واسع النطاق من توقيعات البروتين وأدت إلى مسارات بيولوجية تنبؤية المرتبطة الاستجابة المناعية والبقاء على قيد الحياة الخلايا العصبية. من الضروري النظر في أسر الجزيئات الأخرى بما في ذلك الدهون وميرنا وميكرورنا على سبيل المثال. تربط دراساتنا الحالية هذه التحديدات الإضافية بتوقيعات البروتين من أجل الحصول على معرفة عالمية بهذا التواصل المعتمد على EV.

ومن المتوخى اتباع العديد من النهج العلاجية في السنوات المقبلة. وبالنظر إلى أن المركبات الكهربائية قادرة على عبور حاجز الدم في الدماغ بسهولة والوصول إلى الأنسجة المرضية ، يمكن استخدام هذه الشحنات الجزيئية بطرق مختلفة. على الرغم من أن هذه الدراسة لم تسلط الضوء على جزيئات سطح EV ، إلا أن تحديدها لا يزال ضروريًا من أجل فهم أفضل لعملية المعالجة نحو الخلايا والأنسجة المستهدفة. ويتيح التحليل البروتيني في منهجيتنا الوصول إلى هذه البيانات. خلاف ذلك ، في هذا التقرير ، قدمنا الإنتاج في المختبر من المركبات الكهربائية والكوكتيلات المفيدة. لم نكن تحسين أفضل الظروف لرئيس الوزراء أو تنشيط الخلايا المناعية مسبقا. هذه النقطة حاسمة لأن البيئة الدقيقة في الأنسجة لها تأثير مباشر على الخلايا المناعية وتساهم في نهاية المطاف في تشكيل التكوين الحيوي لمركباتها الكهربائية. في حالة الورم الأرومي الدبقي على سبيل المثال ، فقد وجد أن الخلايا السرطانية تنتج المركبات الكهربائية الخاصة بها ، مما يساهم في توجيه TAMs المجاورة نحو التشكيلات الجانبية المضادة للالتهابات وكبت المناعة المحلية44،45. هذا هو السبب في أن المركبات الكهربائية المشتقة من الضامة في بيئة الورم الدبقي تختلف عن تلك التي يتم إنتاجها في ثقافة ماكروج واحدة. وهكذا، استخدمنا مباشرة EVs المستمدة من الضامة، أنتجت بشكل منفصل من ثقافة ماكروج واحد، للسيطرة على غزو جليوم ة التجمد لأن الثقافة المشتركة الضامة-الدبقي لا سيطرة على نمو الورم. يمكن أن تمنع المزيد من الاستراتيجيات العلاجية هذا في كبت المناعة الفيفو باستخدام المركبات الكهربائية المؤيدة للالتهابات والمضادة للورم المنتجة في المختبر من الضامة المنشطة. ويمكن استخدام استراتيجية مماثلة في سياق الأمراض العصبية التنكسية من خلال استخدام المركبات الكهربائية المستمدة من microglia نبهت بشكل صحيح لإنتاج استجابة اعصاب المضادة للالتهابات لصالح البقاء على قيد الحياة العصبية. في الختام ، فإن دراسات الاتصال بوساطة EV بين الخلايا المناعية والبيئة الدقيقة في الجسم الحي هي المفتاح للسماح بفهم أفضل للمسببات الإمراض وتصميم طرق علاجية مبتكرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ودعمت الأعمال المقدمة كل من المجلس الوطني للتعليم، وشركة "إنسيرينمنت" و"دي لا ريتشرشي"، و"إنسيرم". ونحن ننوه بامتنان لمنشأة المدينة العلمية BICeL- الحرم الجامعي للوصول إلى الأدوات والنصائح التقنية. ونعترف بامتنان بجان - باسكال جيمينو، وسليمان أبووار، وإيزابيل فورنييه على المساعدة في قياس الطيف الجماهيري. ونحن ننوه بامتنان لتانينا عرب، وكريستيل فان كامب، وفرانسواز لو ماريك - كروك، وجاكوبو فيزيولي، وبيير إريك ساوتيير لمساهمتهم القوية في التطورات العلمية والتقنية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-rad 4561045EDU  
Acetonitrile Fisher Chemicals A955-1  
Amicon 50 kDa centrifugal filter Merck UFC505024  
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830  
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) Santa-cruz sc-13119  
B27 Plus supplement Gibco A3582801  
BenchMixer V2 Vortex Mixer Benchmark Scientific BV1003  
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) Bio-Rad 5000006  
C18 ZipTips Merck Millipore ZTC18S096  
C6 rat glioma cell ATCC ATCC CCL-107  
Canonical tubes Sarstedt 62.554.002  
Centrifuge Eppendorf 5804000010  
CO2 Incubator ThermoFisher    
Confocal microscope LSM880 Carl Zeiss LSM880  
Cover glass Marienfeld 111580  
Culture Dish (60 mm) Sarstedt 82.1473  
Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819  
DMEM Gibco 41966029  
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph ThermoFisher    
Electron microscope JEM-2100 JEOL    
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich 03777-10G  
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich ED-100G  
Exo-FBS Ozyme EXO-FBS-50A-1 Exosome depleted FBS
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)     http://www.exocarta.org/
Fetal Bovine Serum Gibco 16140071  
Fetal Horse Serum Biowest S0960-500  
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001  
Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe Fisherbrand 12893543  
FlexAnalysis Brucker    
Fluorescence mounting medium Agilent S3023  
Formic Acid Sigma-Aldrich 695076  
Formvar-carbon coated copper grids Agar scientific Ltd AGS162-3  
Glucose Sigma-Aldrich G8769  
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich 340855  
Hoechst 33342 Euromedex 17535-AAT  
Idoacetamide Sigma-Aldrich I1149  
InstantBlue Coomassie Protein Stain Expedeon ISB1L  
Invert light microscope CKX53 Olympus    
L-glutamine Gibco 25030-024  
LabTek II 8 wells  Nunc 154534  
Laemmli 2x Bio-Rad 1610737  
Laminin Corning 354232  
MaxQuant software (proteins identification software)     https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polish stell Brucker 8268711  
MEM 10x Gibco 21090-022  
Methylcellulose Sigma-Aldrich M6385-100G  
MiliQ water Merck Millipore    
Milk Regilait REGILAIT300  
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell Bio-Rad 1658000FC  
MonoP FPLC column GE Healthcare   no longer available
Nanosight NS300 Malvern Panalytical NS300  
NanoSight NTA software v3.2 Malvern Panalytical    
NanoSight syringe pump Malvern Panalytical    
Neurobasal Gibco 21103-049  
Nitrocellulose membrane GE Healthcare 10600007  
Nonidet P-40 Fluka 56741  
Nunc multidish 24 wells ThermoFisher 82.1473  
Paraformaldehyde Electro microscopy Science 15713  
PC-12 cell line ATCC ATCC CRL-1721  
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122  
Peptide calibration mix LaserBio Labs C101  
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-035-003  
Perseus software (Processing of identified proteins)     https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate Santa-cruz sc-362065  
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830  
Phosphate Buffer Saline Invitrogen 14190094 no calcium, no magnesium
pluriStrainer M/ 60 µm pluriSelect 43-50060  
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407  
Polycarbonate centrifuge tubes Beckman Coulter 355651  
Protease Inhibitor Sigma-Aldrich S8830-20TAB  
PureCol Cell Systems 5005  
Q-Exactive mass spectrometer ThermoFisher    
rapifleX mass spectrometer Brucker    
Rat cortical neurons Cell Applications R882N-20 Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains
Rat Macrophage & Microglia Culture Medium Cell Applications R620K-100 Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow
Rat primary macrophages Cell Applications R8818-10a  
Rat primary microglia Lonza RG535  
Sepharose CL-2B GE Healthcare 17014001  
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111  
Slide Dustsher 100204  
Sodium Chloride Scharlau SO0227  
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771  
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich S7920-100G  
Sodium hydroxide Scharlab SO0420005P  
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich S6422-100G  
SpeedVac Vacuum Concentrator ThermoFisher    
String software (functional protein association networks)     https://string-db.org/
SuperSignal West Dura extended Duration Substrate ThermoFisher 34075  
Syringe 1.0 mL Terumo 8SS01H1  
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell Bio-Rad 1703940  
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508  
Tris Interchim UP031657  
Tris-Glycine Euromedex EU0550  
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287  
Ultracentrifuge Beckman Coulter A95765  
Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti Beckman Coulter 342184  
Uranyl acetate Agar Scientific Ltd AGR1260A  
Whatman filter paper Sigma-Aldrich WHA10347510  
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich C2020-25G  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
  3. Sankowski, R., Mader, S., Valdes-Ferrer, S. I. Systemic Inflammation and the Brain: Novel Roles of Genetic, Molecular, and Environmental Cues as Drivers of Neurodegeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  4. Chakrabarty, S., Kabekkodu, S. P., Singh, R. P., Thangaraj, K., Singh, K. K., Satyamoorthy, K. Microglia in health and disease. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 43 (3), 25-29 (2015).
  5. Sankowski, R., Mader, S., Valdés-Ferrer, S. I. Systemic inflammation and the brain: novel roles of genetic, molecular, and environmental cues as drivers of neurodegeneration. Frontiers in cellular neuroscience. 9, 28 (2015).
  6. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  7. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  8. Domingues, P., et al. Tumor infiltrating immune cells in gliomas and meningiomas. Brain, Behavior, and Immunity. 53, 1-15 (2016).
  9. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nature Neuroscience. 19 (1), 20-27 (2016).
  10. Thion, M. S., et al. Microbiome Influences Prenatal and Adult Microglia in a Sex-Specific Manner. Cell. 172 (3), 500-516 (2018).
  11. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  12. Rajendran, L., et al. Emerging Roles of Extracellular Vesicles in the Nervous System. The Journal of Neuroscience. 34 (46), 15482-15489 (2014).
  13. Gupta, A., Pulliam, L. Exosomes as mediators of neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 11 (1), 68 (2014).
  14. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  15. Budnik, V., Ruiz-cañada, C., Wendler, F. Extracellular vesicles round off communication in the nervous system. Nature Reviews Neurosciences. 17, 160-172 (2016).
  16. Raffo-Romero, A., et al. Medicinal Leech CNS as a Model for Exosome Studies in the Crosstalk between Microglia and Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4124 (2018).
  17. Zhou, Y., et al. Exosomes Transfer Among Different Species Cells and Mediating miRNAs Delivery. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (12), 4267-4274 (2017).
  18. Arab, T., et al. Proteomic characterisation of leech microglia extracellular vesicles (EVs): comparison between differential ultracentrifugation and OptiprepTM density gradient isolation. Journal of extracellular vesicles. 8 (1), 1603048 (2019).
  19. Murgoci, A. -N., et al. Brain-Cortex Microglia-Derived Exosomes: Nanoparticles for Glioma Therapy. ChemPhysChem. 19 (10), 1205-1214 (2018).
  20. Glebov, K., et al. Serotonin stimulates secretion of exosomes from microglia cells. Glia. 63 (4), 626-634 (2015).
  21. Hooper, C., et al. Wnt3a induces exosome secretion from primary cultured rat microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 144 (2012).
  22. Gabrielli, M., et al. Active endocannabinoids are secreted on extracellular membrane vesicles. EMBO reports. 16 (2), 213-220 (2015).
  23. Antonucci, F., et al. Microvesicles released from microglia stimulate synaptic activity via enhanced sphingolipid metabolism. The EMBO Journal. 31 (5), 1231-1240 (2012).
  24. Frühbeis, C., Fröhlich, D., Kuo, W. P., Krämer-Albers, E. -M. Extracellular vesicles as mediators of neuron-glia communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 182 (2013).
  25. Prada, I., et al. Glia-to-neuron transfer of miRNAs via extracellular vesicles: a new mechanism underlying inflammation-induced synaptic alterations. Acta neuropathologica. 135 (4), 529-550 (2018).
  26. Takenouchi, T., et al. Extracellular ATP induces unconventional release of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from microglial cells. Immunology Letters. 167 (2), 116-124 (2015).
  27. Yang, Y., Boza-Serrano, A., Dunning, C. J. R., Clausen, B. H., Lambertsen, K. L., Deierborg, T. Inflammation leads to distinct populations of extracellular vesicles from microglia. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 168 (2018).
  28. Duhamel, M., et al. Paclitaxel Treatment and Proprotein Convertase 1/3 (PC1/3) Knockdown in Macrophages is a Promising Antiglioma Strategy as Revealed by Proteomics and Cytotoxicity Studies. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (6), 1126-1143 (2018).
  29. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. Journal of Neuroscience Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  30. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
  31. Rashed, M. H., et al. Exosomes: From Garbage Bins to Promising Therapeutic Targets. Int. J. Mol. Sci. Int. J. Mol. Sci. 18 (18), (2017).
  32. Yuana, Y., Sturk, A., Nieuwland, R. Extracellular vesicles in physiological and pathological conditions. Blood Reviews. 27 (1), 31-39 (2013).
  33. Frohlich, D., et al. Multifaceted effects of oligodendroglial exosomes on neurons: impact on neuronal firing rate, signal transduction and gene regulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  34. Krämer-Albers, E. -M., et al. Oligodendrocytes secrete exosomes containing major myelin and stress-protective proteins: Trophic support for axons. Proteomics. Clinical applications. 1 (11), 1446-1461 (2007).
  35. Verderio, C., et al. Myeloid microvesicles are a marker and therapeutic target for neuroinflammation. Annals of Neurology. 72 (4), 610-624 (2012).
  36. Prada, I., Furlan, R., Matteoli, M., Verderio, C. Classical and Unconventional Pathways of Vesicular Release in Microglia. GLIA. 61, 1003-1017 (2013).
  37. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  38. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. , (2017).
  39. Kennedy, B. C., et al. Tumor-Associated Macrophages in Glioma: Friend or Foe. Journal of Oncology. 2013, 1-11 (2013).
  40. Potolicchio, I., Carven, G. J., Xu, X., Stipp, C., Riese, R. J., Stern, L. J., Santambroggio, L. Proteomic Analysis of Microglia-Derived Exosomes: Metabolic Role of the Aminopeptidase CD13 in Neuropeptide Catabolism1. The Journal of Immunology. 175, 2237-2243 (2005).
  41. Turola, E., Furlan, R., Bianco, F., Matteoli, M., Verderio, C. Microglial microvesicle secretion and intercellular signaling. Frontiers in Physiology. 3, (2012).
  42. Cocucci, E., Meldolesi, J. Ectosomes and exosomes : shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends in Cell Biology. 25 (6), 364-372 (2015).
  43. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  44. de Vrij, J., et al. Glioblastoma-derived extracellular vesicles modify the phenotype of monocytic cells. International Journal of Cancer. 137 (7), 1630-1642 (2015).
  45. van der Vos, K. E., et al. Directly visualized glioblastoma-derived extracellular vesicles transfer RNA to microglia/macrophages in the brain. Neuro-Oncology. 18 (1), 58-69 (2016).

Tags

علم الأعصاب، القضية 160، وظائف المناعة، microglia، الضامة، الخلايا العصبية، خلايا الورم الدبقي، الحويصلات خارج الخلية
توصيف الحويصلات خارج الخلية المشتقة من الخلايا المناعية ودراسة التأثير الوظيفي على بيئة الخلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lemaire, Q., Duhamel, M.,… More

Lemaire, Q., Duhamel, M., Raffo-Romero, A., Salzet, M., Lefebvre, C. Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment. J. Vis. Exp. (160), e60118, doi:10.3791/60118 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter