Summary
Vi beskriver en model af heterotopisk abdominal hjertetransplantation hos rotter, hvilket indebærer ændringer af de nuværende strategier, hvilket fører til en forenklet kirurgisk tilgang. Derudover beskriver vi en ny afvisningsmodel ved in-ear injektion af vitale hjertemuskelceller, hvilket giver mulighed for yderligere transplantation immunologiske analyser hos rotter.
Abstract
Heterotopisk hjertetransplantation hos rotter har været en almindeligt anvendt model for forskellige immunologiske undersøgelser i mere end 50 år. Der er rapporteret om adskillige ændringer siden den første beskrivelse i 1964. Efter 30 års heterotopisk hjertetransplantation hos rotter har vi udviklet en forenklet kirurgisk tilgang, som let kan undervises og udføres uden yderligere kirurgisk træning eller baggrund.
Efter dissektion af den opstigende aorta og lungearterie og ligation af overlegne og ringere kaval og lunger, donorhjerte er høstet og efterfølgende perfunderet med iskold saltvand opløsning suppleret med heparin. Efter fastspænding og incising modtageren abdominal fartøjer, donor stigende aorta og lungepulsåren er anastomosed til modtageren abdominal aorta og ringere vena cava, henholdsvis ved hjælp af kontinuerlige suturer.
Afhængigt af forskellige kombinationer af donormodtagere giver denne model mulighed for analyser af enten akut eller kronisk afvisning af allografts. Den immunologiske betydning af denne model forstærkes yderligere af en ny tilgang til in-ear injektion af vitale hjertemuskelceller og efterfølgende analyse af dræning af cervikaltlymfevæv.
Introduction
Heterotopisk hjertetransplantation er en hyppigt anvendt eksperimentel model for forskellige undersøgelser vedrørende transplantationstolerance, akut og kronisk allograftafvisning, iskæmi-reperfusionsskade, maskinperfusion eller hjerteombygning. Blandt andre fordele, kan graft funktion overvåges noninvasively ved palpation og graft fiasko ikke fører til en vital svækkelse af modtageren i modsætning til andre organer, såsom nyrer eller lever.
I 1964 beskrev Abbott et al. oprindeligt heterotopisk abdominal hjertetransplantation hos rotter1. Senere, i 1966, blev end-to-side teknik til anastomoses beskrevet af Tomita et al.2. Grundlaget for den aktuelt anvendte model blev rapporteret af Ono og Lindsey i 19693. I løbet af de sidste årtier er der blevet offentliggjort adskillige ændringer for at skabe forskellige typer af lossede, delvist lastede eller belastede venstre ventrikulære hjertetransplantation, herunder kombineret heterotopisk hjerte-lungetransplantation4,5,6. Til immunologiske analyser udføres en ikke-volumenbelastet hjertetransplantation hyppigst. I dette tilfælde, blodgennemstrømningen tilbageskridt ind i donor stigende aorta og efterfølgende kranspulsårerne. Den venøse dræning sker langs koronar sinus ind i højre atrium og hjertekammer (Figur 1A-B). Derfor er venstre hjertekammer udelukket fra blodgennemstrømningen, bortset fra marginale mængder blod fra Thebesian vener. Dette gør det også til en nyttig model til at studere de patofysiologiske mekanismer under venstre ventrikel hjælpeenhed terapi7.
Heterotopisk hjertetransplantation er blevet udført i forskellige arter, herunder mus, kaniner, svin og har endda været anvendt som en uni- eller kventrikulær hjælpeanordning hos mennesker8,,9,,10,11. Rotten repræsenterer stadig et populært forsøgsdyr til transplantationsmodeller, især da graftoverlevelsestiderne for forskellige kombinationer af rottestamme er blevet veldefineret tidligere, og et stort antal immunologiske reagenser er tilgængelige12,13. I modsætning til mus, rotter er større gør kirurgi og adgang til lymfevæv til immunologiske analyser mere realistisk12. Desuden vil indførelsen af kommercielle kloningsteknologier hos rotter i de senere år sandsynligvis føre til en tilbagevendende interesse for forsøgsrotter14.
Generelt kan heterotopiske hjertetransplantater knyttes til modtagerfartøjerne enten ved at udføre livmoderhalskræft eller abdominal anastomose. Men nogle få undersøgelser tyder på, at en femoral anastomose letter forbedret overvågning på grund af bedre adgang til manuel palpering eller transfemoral ekkokardiografi og dermed giver mulighed for en mere præcis påvisning af graft fiasko15,16.
Det har vist sig, at der ikke er nogen forskel med hensyn til driftstid, komplikationshastighed, resultat og graft overlevelsestid mellem begge anastomose teknikker17. Det er klart, at tilgængeligheden af et tilstrækkeligt antal drænende lymfeknuder skal nævnes som en fordel for cervikal anastomose; der er dog behov for længere uddannelsesperioder. I modsætning hertil er abdominal anastomose mindre kompliceret og lige så værdifuld for immunologiske undersøgelser, især når det kombineres med resultater fra en ny metode til in-ear injektion af allogene hjertemuskelceller og efterfølgende cervikal lymfadenektomi. En kombination af begge modeller giver et bredt spektrum af postinterventionelle immunologiske analyser.
Følgende protokol henviser til at operere i par kirurger for at reducere iskæmi tid. Alle eksperimenter kan dog udføres af en enkelt person. Opsætningen af instrumenter og materialer til hjerteeksplantage og implantation vises i figur 2A-B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle erfaringer med dyr er blevet udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra det lokale etiske dyreundersøgelsesråd under de regionale myndigheder for forbrugerbeskyttelse og fødevaresikkerhed i Niedersachsen (LAVES, Oldenburg, Tyskland) med godkendelses-id'erne 12/0768 og 17/2472.
1. Hjerte explantation og perfusion
BEMÆRK: Som graftdonorer blev der anvendt hun- eller hanrotter i en alder af 7-22 uger.
- Bedøve donorrotten ved indånding af isofluran (induktion ved 5% og vedligeholdelse ved 3% med en O2-strøm på 1 L/min). Injicer 5 mg Carprofen subkutant pr kg kropsvægt for perioperativ analgesi og kontrollere for fraværet af tå knivspids tilbagetrækning refleks.
- Påfør øjensmøremiddel og fjern abdominal og thorax pels ved hjælp af en mekanisk klipper.
- Anbring donoren i en supinposition, fastgør lemmerne i bunden af operationsbordet med elastikker og steriliserhuden med 70% ethanol eller et andet tilstrækkeligt alternativ.
- Incise huden i længderetning en retning og efter anvendelse af lokalbedøvelse (f.eks lidocain 0,2%) udføre en median laparotomi ved hjælp af en saks.
- Indsæt retraktorer, mobilisere tarmen til venstre for donor, og udsætte ringere vena cava med steriliseret vatpinde.
- For antikoagulation, injicere 500 I.U. af heparin opløst i 1 ml iskold isotonisk saltvandsopløsning intravenøst ved at punktere ringere vena cava. Stop blødningen på punkteringsstedet ved let kompression med en vatpind efter tilbagetrækning af nålen (Figur 3A).
- Incise mellemgulvet og udføre lateral thoracotomy til begge sider af donoren.
- Fastgør den mobiliserede ventrale væg af brystkassen på operationsbordet.
- Fjern perikardiet og vagusnerven ved stump forberedelse ved hjælp af to mikronåleholdere.
- Udfør transektion af abdominalfartøjer for at exsanguinate donorog losse hjertet.
- Sæt den stumpe gren af en sonde spids saks ind i transvers perikardiesinus og adskille stigende aorta og lungepulsåren så distale som muligt under lys caudal trækkraft i hjertet med en beladet komprimere (Figur 3B).
- Placer en enkelt 5-0 ligatur omkring den overlegne og ringere vena cava og lungevenerne og stram den så dorsale som muligt (Figur 3C).
- Afskære vævsdorallen til ligaturen og uddrag hjertet (Figur 3D).
- Perfuse det eksplantede hjerte med en 18 G kanyle fra et intravenøst kateter gennem den opstigende aorta og lungepulsåren med 30 ml iskold, isotone saltvandsopløsning suppleret med 1000 I.U. heparin og placer hjertet i et 15 ml rør fyldt med saltvandsopløsning på is (Figur 3E-F).
2. Hjerteimplantation
BEMÆRK: Som modtagere blev der anvendt 10-14 uger gamle hun- eller hanrotter. Donorer og modtagere blev cirka vægt matchet.
- Udfør anæstesi af recipientrotten ved også at anvende isofluranindånding (induktion ved 5% og vedligeholdelse ved 1,5-2% med en O2-strøm på 1 L/min). Injicer 5 mg Carprofen subkutant pr kg kropsvægt for perioperativ analgesi og kontrollere for fraværet af tå knivspids tilbagetrækning refleks.
- Påfør øjensmøremiddel, fjern abdominal pels, fastsætte lemmerne og sterilisere huden analogt til donor forberedelse. For optimal postoperativt resultat, udføre operationen på en varmemåtte for at forhindre intraoperativ hypotermi.
- Efter langsgående indsnit i huden, anvende en lokalbedøvelse, såsom lidocain (0,2%), på abdominal fascia. Åbn bughulen ved median laparotomi og indsæt retractors.
- Mobilisere tarmen til øverste venstre side af modtageren og placere den i en varm, bevåd komprimere.
- Efter mobilisering af duodenum og proksimale jejunum, henholdsvis ved hjælp af kirurgiskmikroskop (eller forstørrelsesglas briller) med en 5-7x forstørrelse, udsætte abdominal aorta og ringere vena cava ved stump forberedelse med vatpinde. Må ikke adskilles fra mavebeholderne.
- Løft bugbeholderne ved hjælp af to mikronåleholdere uden at beskadige lændevenerne, og placer kølevæskekarklemmen (figur 4A).
- Punkter mavefartøjerne med en 30-45° buet 27 G kanyle (figur 4B).
- Forstørre punkteringsstedet ved hjælp af Potts-saks for at skabe et indsnit i længderetningen, der svarer til størrelsen af donorbeholdernes lumen (figur 4C-D), og perfuse modtagerbeholderne med saltvandsopløsning for at fjerne blodpropper og forhindre postoperatetrombose.
- Anbring transplantatet i situs, og fikser donoren opstiger aorta til modtagerens abdominale aorta med to enkle afbrudte sting (8-0 monofilamenter ikke-resorberbar sutur) i kranie- og halehjørnet af det langsgående snit (figur 4E).
- Anastomose den stigende aorta af donor en abdominal aorta af modtageren ved en løbende 8-0 monofilamentersutur i to trin: For det første placeres transplantatet til højre for modtagerbeholderne, og første halvdel af anastomose(figur 4E). Derefter anbringes transplantatet til venstre for modtagerbeholderne, og anden halvdel af anastomose(figur 4F).
- Fikser donorens lungearterie til den ringere vena cava svarende til aortalt anastomose (8-0 monofilamenter ikke-resorberbar sutur). Sutur den første halvdel af venøs anastomose fra intraluminale side af fartøjet (Figur 4G-H).
- Skyl anastomoses med saltvand direkte før stramning af knuderne for at forhindre perifer emboli.
- Placer en hæmostatisk gaze omkring både anastomoses og forsigtigt frigive Cooley vaskulære klemme, således at reperfusion af transplantatet kan begynde. Håndter blødning langs anastomoses ved lys kompression med steriliserede vatpinde.
BEMÆRK: Transplantatet skal begynde at slå efter ca. 60 s. - Erstat tarmen i en meander som mode. Sørg for, at der ikke er malrotationer af mesenterienradix for at forhindre intestinal nekrose eller mekanisk obstruktion.
- Luk mavemusklerne/fascia og huden separat ved hjælp af kontinuerlige 3-0 polyfilamenter, der kører suturer.
3. Postoperativ pleje
- For postoperativ analgesi skal modtagerne have en yderligere subkutan injektion på 5 mg Carprofen pr. kg kropsvægt på den første postoperative dag (POD). Derudover tilsættes 1 g Metamizol til 500 ml drikkevand indtil den tredje POD.
- Start overvågning af hjertetransplantationfunktion ved daglig abdominal palpering på den tredje POD.
BEMÆRK: I tilfælde af graftsvigt før den tredje POD bør et kirurgisk snarere end et immunologisk svigt overvejes. Dette afhænger dog naturligvis af den valgte stammekombination og den respektive immunologiske model (f.eks. hyperakut afstødning efter forudgående immunisering). - Efter graft afvisning, ekstrakt væv som dræning retroperitoneal lymfeknuder kranie af anastomoses, milten, blodet, thymus og transplantat til yderligere immunologiske analyser via flow cytometri eller immunhistokemi.
4. Enzymatisk fordøjelse af hjertet og subkutan injektion af hjerteceller i øret
- Udfør hjerteexplantation og perfusion analogt med heterotopisk hjertetransplantation (se trin 1).
- Hjertet makuleres i 3 mm x 3 mm blokke med en steril skalpel eller steril saks, og inkuber det i 30 min ved 37 °C i dyrkningsmedium indeholdende 0,5 mg/ml kollagen.
BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge dyrkningsmedium indeholdende penicillin, streptomycin og glutamin uden føtal kalvserum (FCS), især da FCS hæmmer kollagense fordøjelsen. - Tilsæt det fordøjede væv til en storporet sigte, mens du fjerner kulturmediet og hakker grundigt for at få en suspension af vitale hjertemuskelceller, for det meste døde enkelte hjerteceller og resterende blodlegemer. Cellesuspensionen vaskes to gange med steril isotonisk saltvandsopløsning.
BEMÆRK: Centrifugeringsindstillinger: 10 min, 200 x g, 20 °C - Suspensionen filtreres ved hjælp af en 40 μm cellesi, og de vitale cellesammenkædninger opsamles ved at skylle cellesien med 5-10 ml isotonisk saltvandsopløsning.
- Efter centrifugering suspenderes hjertemuskelcellerne i saltvandsopløsningen opløst ved en koncentration på 5x105 celler/ml, og celleopløsningen trækkes op i en 1 ml sprøjte.
- Udfør anæstesi svarende til den protokol, der er beskrevet for recipientnarkose (se trin 2) til heterotopisk hjertetransplantation.
- Placer modtageren i en sideværts position, og fastgør øret med en finger med dobbeltklæbende tape (Figur 5A).
- Der indsprøjtes 20 μL af hjertemuskelcelleopløsningen (indeholdende 1 x 104 celler) via en 27 G kanyle s.c. tæt på de visuelle kapillærbeholdere i modtagerens øre (figur 5B).
- Efter en defineret observationsperiode (afhængigt af den valgte stammekombination og afstødningsstyrke) udtrækkes de drænende cervikale lymfeknuder, og der udføres yderligere analyser såsom flowcytometri eller co-kulturer (figur 5C).
BEMÆRK: Desuden kan histologisk analyse af pinna udføres for at bestemme celle infiltration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidligere er forskellige immunologiske spørgsmål blevet behandlet på grundlag af modellen, som blev valideret i arbejdsgruppen af mere end 500 transplantationer med en overlevelsesrate på mere end 95%13,18,19,20,21,22,23,24. De samlede driftstider (herunder podektagening og implantation) oversteg normalt ikke 60 minutter, mens kombinerede kolde og varme iskæmitider var omkring 30 minutter. De anvendte stammekombinationer var hovedsageligt baseret på Lewis (Lew) baggrund. Syngenic transplantationer overlevede op til 100 dage uden tegn på graft fiasko, men betydelig vægt og størrelse reduktion på graft explantation. Senest udførte vi heterotopisk hjertetransplantation i to forskellige kombinationer af donormodtagere, der simulerede en hurtig og langvarig afvisningsmodel: Lew.1a → Lew wt, der førte til hurtig afstødning (gennemsnitlig overlevelsestid på 7,4 dage) og Lew.1u-7B→ Lew.1a, hvilket førte til en mere langvarig afstødning (gennemsnitlig overlevelsestid på 42,5 dage) (Figur 6). Makroskopisk, de afviste grafts viste en trombose ledsaget af en livid misfarvning og hævelse, mens ikke-afviste grafts viser særskilt atrofi, sandsynligvis som følge af en losset venstre ventrikel. Desuden udarbejdede vi kryovatdele af transplanterede hjerter for at opdage celleinfiltration ved hjælp af en alkalisk fosfatase-antialkaline phosphatase (APAAP) farvningsmetode. Enkeltbilleder med en 50x forstørrelse blev flettet til et sammensat billede, hvilket giver et overblik over hele transplantatet og fordelingen af infiltrerende celler. Histologisk analyse viste en øget infiltration af (f.eks. CD4+, TCR+eller NKR-P1A/B+) immunceller i allogene transplantater, mens syngenic grafts stort set var fri for celleinfiltration (figur 7A-C).
Cervikal lymfadenektomi og re-stimulationsanalyser af drænende lymfeknudeceller efter øreinjektion af hjertemuskelceller i ovennævnte stammekombinationer afslørede tydelige stammespecifikke immunreaktioner mod allogent hjertevæv og tillod yderligere immunologiske analyser, såsom cytokinprofilering (Figur 8A-C).
Figur 1: Skematisk præsentation af ende-til-side anastomoses og den deraf følgende blodgennemstrømning gennem hjertet. Efter anastomosing donoren stigende aorta end-to-side til modtageren abdominal aorta og analogt lungepulsåren til modtageren ringere vena cava (A), blodgennemstrømningen ind i kranspulsårerne via stigende aorta. Den venøse dræning sker via sinus koronar ind i højre atrium og hjertekammer og gennem lungepulsåren i modtageren ringere vena cava (B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Nødvendige kirurgiske instrumenter og materialer. (A) Explantation: 1: elastik bånd, 2: retractors, 3: 5-0 ligatur, 4: sonde pegede saks, 5-6: mikro nåleholdere, 7: saks, 8: kirurgiskpincet, 9: mikro pincet, 10: øjensmøremiddel, 11: komprimerer, 12: vatpinde, 13: perfusion base, 14: saltvandsopløsning på is. BB) Implantation: 1: elastikbånd, 2: retraktorer, 5-6: mikro nåleholdere, 7: saks, 8: pincet, 9: mikro pincet, 10: øjensmøremiddel, 11: komprimerer, 12: vatpinde, 15: mikrosaks, 16: mikropincet, 17: Potts saks, 18: nåleholder, 19: buet kanyle, 20: Cooley vaskulær klemme, 21: 8-0 monofilamenter, 22: hæmostatisk gaze, 23: 3-0 polyfilamentsuturer, 24: Petriskål, 25: Carprofen (5 mg/ml), 26: lokalbedøvelse (lidocain 0,2%), 27: saltvandsopløsning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Hjerteeksplantage. Efter heparinisering (A), thoracotomy udføres og stigende aorta og lungepulsåren er afskåret så distale som muligt (B). Med en enkelt ligatur lunge og begge kaval vener er okkluderet (C) og hjertet er fjernet fra brysthulen (D). (E) viser hjertet før og (F) efter perfusion med 30 ml saltvandsopløsning indeholdende heparin. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Hjerteimplantation. Efter udstilling af abdominale fartøjer og placering af en Cooley vaskulær klemme (A) fartøjerne kanomyleret (B) og en langsgående snit udføres ved hjælp af Potts saks (C-D). Donoren ascending aorta er fikseret med en knude hver på kranie-og halehjørne af indsnit af modtageren abdominal aorta (E) og anastomose udføres ved kontinuerligt kører suturer (E-F). Bemærk, at transplantatet er placeret på højre side af fartøjerne i første halvdel af anastomose (E) og på venstre side af fartøjerne i anden halvdel af anastomose (F) og den efterfølgende venøse anastomose. Den første halvdel af venøs anastomose udføres af en intraluminal sutur (G). Efter endt anden halvdel af venøs anastomose, graften er klar til reperfusion (H). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: In-ear injektion af allogene hjertemuskelceller. Efter fastsættelse modtagerens øre på en finger ved hjælp af dobbeltsidet tape (A) allogene vitale hjertemusklen celler injiceres subkutant tæt på visuelle kapillær fartøjer (B). Efter en observationsperiode udvindes dræning af cervikale lymfeknuder (*) (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Hjerteoverlevelse i forskellige sangnic og allogene donor-modtager kombinationer. Kaplan-Meier-analyse viser overlevelsen af syngenic (n=10 hurtig afvisningsmodel; n=5 langvarig afstødningsmodel) og allogene transplantater (n=11 hurtig afvisningsmodel; n=14 langvarig afvisningsmodel). I den forlængede afstødningsmodel nåede seks ud af 14 modtagere slutningen af observationsperioden (60 dage) uden graftsvigt, hvilket førte til en langvarig graftoverlevelse i denne gruppe. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Histologisk analyse af syngenic og allogene hjertetransplantationer. (A-B) viser infiltration af CD4+ celler ved hjælp af APAAP farvning metode i en syngenic graft (A) og en allogen graft ved afstødning (B). (C) præsenterer stigningen i celleinfiltration i allogene transplantater sammenlignet med syngenic grafts (der tjener som referencegruppe) for forskellige immuncelleundergrupper. Den klassificering, der blev anvendt til kvantificering af celleinfiltration, blev ændret fra Hirschburger et al.25: 0 = infiltration, der kan sammenlignes med syngenic grafts; 0,5 = let stigning i farvede celler i isolerede vævssektioner; 1 = stigning af entalfarvede celler over hele vævssektionen; 1.5 = forøgelse af farvede celleklynger, der er jævnt fordelt over hele vævssektionen 2 = stærk; 2,5 = meget stærk; 3 = stærkeste stigning af farvede celleklynger i hele vævssektionen. De histologiske dele af transplantaterne blev analyseret ved hjælp af en 50x forstørrelse. Der blev medtaget fem transplantater pr. gruppe (henholdsvis syngenic og allogene) i analysen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Analyse af drænende lymfeknudeceller efter øreinjektion af allogene hjertemuskelceller. Specifik restimulering (med 2 x 105 miltitter af den respektive donorstamme) på 2 x 105 lymfocytter høstet fra enten drænende cervikale eller mesenteriske lymfeknuder (LN) af hurtig afvisning af Lew wt og forlænge afviste Lew.1a-modtagere viste signifikant reduceret spredning af drænende lymfeknudeceller hos Lew.1a-modtagere (A), mens spredningskapacitet generelt stadig kunne observeres efter uspecifik stimulation med CD3/CD28 antistof (B). Overraskende, cytokin profilering afslørede en stigning i inflammatoriske cytokiner i lymfeknuder af langvarige afviste modtagere (C). Resultaterne præsenteres som gennemsnitlig ± SEM på mindst 4 dyr pr. gruppe. Betydning er angivet med * for p-værdier ≤ 0,05 og **** for p-værdier ≤ 0,0001. (Dette tal er blevet ændret fra Beetz et al.24). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den tidligere beskrevne metode til heterotopisk hjertetransplantation hos rotter er hovedsagelig baseret på beskrivelsen af Ono og Lindsey i 19693. Siden da er der indført flere ændringer i forskellige arter, hvilket fører til en bred vifte af denne model. Ved at kombinere flere af disse ændringer og indføre vores egne erfaringer som følge af over 30 års udførelse af heterotopiske hjertetransplantationer i laboratoriet, skabte vi en mulig kirurgisk tilgang, som ikke kræver lange træningsperioder eller kirurgisk baggrund. I det følgende vil vi diskutere generelle begrænsninger af denne model og understrege kritiske trin i protokollen. Desuden vil vi understrege fordelene ved at kombinere heterotopisk hjertetransplantation med en ny metode til in-ear injektion af hjertemuskelceller.
Anæstesi og generelle komplikationer
Selv om det er blevet rapporteret, at isofluran anæstesi er bedre end injektion anæstesi om tidlig overlevelse efter heterotopisk hjertetransplantation, intraoperativ respirationsdepression stadig udgør en af de mest almindelige komplikationer og kræver derfor en omhyggelig narkose forvaltning26. I stedet for henholdsvis seriel podning og implantation anbefaler vi, at der påbegyndes forberedelsen af recipienten og mavebeholderne umiddelbart efter donordyrets thoracotomi, især fordi driftstider på mindre end en time er forbundet med et bedre resultat med hensyn til graft og recipientoverlevelse26,27. Udover allerede nævnt komplikationer såsom hypotermi på grund af lange driftstider og manglende varmemåtter, og intestinal nekrose eller obstruktion ved ufysiologisk placering af tarmen, en parese af hindre lemmer repræsenterer en yderligere komplikation, som kan forebygges ved atraumatisk vaskulær fastspænding og grundig skylning af anastomoses for at undgå perifer emboli28,29.
Ligatur af lunge- og kavalvener og blødningskomplikationer
For at reducere varm iskæmi tid, bruger vi en enkelt ligatur for både kaval og alle fire lunger. Som en mulig komplikation som følge af en for proksimalt/ventral placering af ligaturen skal afbrydelsen af venøs tilbageløb ved okklusion af sinuskoronaskytten nævnes. I tilfælde af kraftig blødning efter fjernelse af Cooley klemmen og synlig slag af transplantatet, ligatur skal kontrolleres for utilstrækkelighed straks. Vi observerede denne type komplikation, især hvis dissektion af lungevenerne blev udført for tæt på ligatur, mens du fjerner transplantatet fra brysthulen. Ellers, svær blødning er hovedsageligt forårsaget af utilstrækkelighed af vaskulære anastomoses. Derudover, en koronararterie løber langs stigende aorta, som ofte afskåret under explantation er beskrevet for at forårsage dødelig blødning ved reperfusion27.
Iskæmi tid og perfusion
Uanset transplantationsmodellen er det altid nødvendigt at reducere iskæmitiden, især da hjertet betragtes som et sårbart organ med hensyn til iskæmiskader. Ved at udføre kirurgi med to kirurger, vi er i stand til at opnå et minimum varm og kold iskæmisk tid og derfor give afkald på brugen af kardioplegikiske løsninger for at reducere iskæmi-reperfusion skader30. Generelt, perfusion af transplantatet spiller en central rolle og er afgørende for at afkøle transplantatet og fjerne blodlegemer, hvilket kan resultere i trombose eller emboli. Mens lave perfusionstryk fører til utilstrækkelig perfusion og dermed til ufuldstændig fjernelse af blodceller, kan et højt perfusionstryk forårsage endotelskader31,32. Vi anbefaler perfusion af pulmonale arterie samt stigende aorta indtil kranspulsårerne er synligt skyllet klar.
Indsnit i modtagerfartøjer
Et kritisk skridt i protokollen er indsnit i modtagerfartøjerne uden at forårsage skade på fartøjernes bageste væg: Schmid et al. beskrev fordelen ved aortomy eller venotomi, der udfører et lille tværgående snit efterfulgt af udvidelse i længderetningen i kraniel og caudalretning, hvilket yderligere fører til en nedsat stenoserate af aortomose33. I vores model er modtagerfartøjerne punkteret ved hjælp af en lille kanyle. Bagefter er punkteringsstedet udvidet ved at bruge Potts saks til at skabe et langsgående snit. For at opnå en bedre gennemførlighed anbefaler vi, at spidsen af kanylen bøjes til en vinkel på 30-45°, hvilket fører til en nedsat risiko for at beskadige karrenes bageste væg. Vi observerede ikke klinisk relevante vaskulære stenoses hos nogen af vores modtagere. Shan et al.34har beskrevet lignende fordele ved at åbne modtagerfartøjer ved at punktere den abdominale aorta og den ringere vena cava med en kanyle.
Mastering modellen af heterotopisk hjertetransplantation
I løbet af det sidste årti er modellen blevet udført af forskere i afdelingen med ringe eller ingen kirurgisk baggrund. Som nævnt ovenfor opererer vi i par kirurger, mens den mere erfarne forsker er ansvarlig for at sikre succes transplantationen og på samme måde gradvist at forbedre den uerfarne forskers færdigheder. Efter en kort træningsperiode med ca. ti graftexplantations og implantationer hos døde dyr er den uerfarne forsker ansvarlig for at udføre hjerteeksplantagen og bistå graftimplantationen hos ca. ti levende dyr. Efterfølgende udfører den uerfarne forsker aktivt den vaskulære anastomoses, således at den tidligere uerfarne forsker efter ca. ti yderligere transplantationer normalt er i stand til at udføre alle kritiske trin i modellen.
Anvendelse af denne uddannelse koncept, tidligere publikationer fra vores afdeling ved hjælp af heterotopiske hjertetransplantation hos rotter viste ingen forskelle med hensyn til sygelighed, dødelighed eller graft funktion på trods af flere forskellige hold af kirurger13,18,19,20,21,22,23,24.,
Bemærk, at udføre den vaskulære anastomoses repræsenterer det mest kritiske skridt i denne protokol og solid organtransplantation modeller i almindelighed. Vi anbefaler derfor længere træningsperioder med døde dyr, indtil anastomoses udføres præcist og hurtigt, især hvis en erfaren forsker ikke er tilgængelig for vejledning hos levende dyr.
Generelle fordele og ulemper ved modellen
Mens spontan toleranceinduktion ofte beskrives som et fænomen i levertransplantation og også observeres ved nyretransplantation, betragtes hjertet som et ret immungent organ og muliggør dermed pålidelig afstødning i transplantationsmodellerne35,36. I modsætning til disse resultater, kunne vi også mærke langsigtet overlevelse og fravær af afvisning efter heterotopisk hjertetransplantation i visse donor-modtager kombinationer trods fuldstændig større histokompatibilitet kompleks forskel.
En ofte nævnt kritik af heterotopisk hjertetransplantation er subjektiviteten af graft overvågning ved manuel palpering. Modellen er derfor blevet udvidet til at omfatte femorale anastomoseteknikker for at lette adgangen til palpering og indføre yderligere overvågningsteknikker såsom transfemoral ekkokardiografi15,16. På den anden side viste Mottram et al. at overvågningen af transplantatet via palpering korrelerer godt med elektrokardiografiske målinger37. Således, manuel palpering i heterotopiske hjertetransplantationer synes tilstrækkelig til overvågning graft funktion i en akut afvisning model.
Som følge af heterotopisk placering og venstre ventrikulær losning fungerer hjertet ikke under anatomiske eller fysiologiske forhold, forudsat at dette ikke påvirker immunologiske analyser. I modsætning til denne antagelse, det havde vist sig, at hjerte remodeling som følge af venstre ventrikulære losning under venstre ventrikulære hjælpeenhed terapi fører til en nedsat cytokin frigivelse38,39. På den anden side beskrev Tang-Quan et al. den aflastede indstilling som en mere hensigtsmæssig metode til immunologisk analyse, da der blev observeret langvarig iskæmisk skade af transplantatet som følge af perfusion med delvist deoxygeneret blod i den venstre ventrikulære lastede model40.
Selv om abdominal placering af grafts tilbyder kirurgiske fordele med hensyn til praktiske, er det vanskeligt at høste et tilstrækkeligt antal dræning retroperitoneal lymfeknuder ved graft afvisning forringe yderligere analyser. Af denne grund introducerede vi en ny metode til in-ear injektion af allogene hjertemuskelceller. Dette begreb, der stammer fra parasitologisk forskning, er ikke blevet anvendt til immunologiske analyser ved transplantation, selv om det er muligt41,42. Fordelen ved denne model er muligheden for at identificere og høste et betydeligt antal drænende lymfeknuder, hvilket giver mulighed for at udføre komplekse immunologiske analyser. Bemærk, at begge modeller kan kombineres i én modtager, der giver yderligere indsigt i mekanismerne for afvisning og tolerance i celle- og organtransplantation hos rotter.
Vores modeller for rottehjerte- og hjertemuskelcelletransplantation repræsenterer en praktisk gennemførlig og velstuderet tilgang og kan udføres uden yderligere kirurgisk træning eller baggrund. Stillet over for det faktum, at nye kloning teknologier til rotter er blevet indført og udviklet for nylig, disse modeller giver enorme muligheder for transplantation immunologiske forskere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Britta Trautewig, Corinna Löbbert og Ingrid Meder for deres engagement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia device (including isoflurane vaporizer) | Summit Anesthesia Solutions | No Catalog Number available | |
| Cannula (27 G) | BD Microlance | 302200 | |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl 50 mg/mL | |
| Cellstar Tubes (15 mL) | GreinerBioOne | 188271 | |
| Cell strainer (40 µm) | BD Falcon | 2271680 | |
| Collagenase Type CLSII | Biochrome | C2-22 | |
| Compresses 5x5 cm | Fuhrmann | 31501 | |
| Compresses 7.5x7.5 cm | Fuhrmann | 31505 | |
| Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf | 1032128 | |
| Dexpathenol (5 %) | Bayer | "Bepanthen" | |
| DPBS BioWhittaker | Lonza | 17-512F | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD557R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD313R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD35 | |
| Heating mat | Gaymar Industries | "T/Pump" | |
| Hemostatic gauze | Ethicon | Tabotamp | |
| Heparin-Natrium 25 000 I.E. | Ratiopharm | No Catalog Number available | |
| Isofluran CP | CP-Pharma | No Catalog Number available | |
| Large-pored sieve (stainless steel) | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| Lidocaine | Astra Zeneca | 2 % Xylocain | |
| Metamizol-Natrium | Ratiopharma | Novaminsulfon 500 mg/mL | |
| Micro forceps | B. Braun | Aesculap BD3361 | |
| Micro needle holder | Codman, Johnson & Johnson Medical | Codmann 80-2003 | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap BD336R | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap FD241R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FD101R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FM471R | |
| Needle holder | B. Braun | Aesculap BM221R | |
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine (100x) | PAA | P11-010 | |
| Peripheral venous catheter (18 G) | B. Braun | 4268334B | |
| Peripheral venous catheter (22 G) | B. Braun | 4268091B | |
| Probe pointed scissors | B. Braun | Aesculap BC030R | |
| Retractors | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| RPMI culture medium | Lonza | BE12-702F | |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Baxter | No Catalog Number available | |
| Scissors | B. Braun | Aesculap BC414 | |
| Surgical microscope | Carl-Zeiss | OPMI-MDM | |
| Sutures (anastomoses) | Catgut | Mariderm 8-0 monofil | |
| Sutures (ligature) | Resorba | Silk 5-0 polyfil | |
| Sutures (skin, fascia) | Ethicon | Mersilene 3-0 | |
| Syringe (1 mL) | B. Braun | 9166017V | |
| Syringe (10 mL) | B. Braun | 4606108V | |
| Syringe (20 mL) | B. Braun | 4606205V | |
| Vascular clamp | B. Braun | Aesculap FB708R |
References
- Abbott, C. P., et al. A Technique for Heart Transplantation In the Rat. Archives of Surgery. 89 (4), 645-652 (1964).
- Tomita, F.
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
- Wen, P., et al. A simple technique for a new working heterotopic heart transplantation model in rats. Transplantation Proceedings. 45 (6), 2522-2526 (2013).
- Benke, K., et al. Heterotopic abdominal rat heart transplantation as a model to investigate volume dependency of myocardial remodeling. Transplantation. 101 (3), 498-505 (2017).
- Kearns, M. J., et al. Rat Heterotopic Abdominal Heart/Single-lung Transplantation in a Volume-loaded Configuration. Journal of Visualized Experiments. (99), 52418 (2015).
- Ibrahim, M., et al. Heterotopic abdominal heart transplantation in rats for functional studies of ventricular unloading. The Journal of Surgical Research. 179 (1), e31-e39 (2013).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Lu, W., et al. A new simplified volume-loaded heterotopic rabbit heart transplant model with improved techniques and a standard operating procedure. Journal of Thoracic Disease. 7 (4), 653-661 (2015).
- Kitahara, H., et al. Heterotopic transplantation of a decellularized and recellularized whole porcine heart. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 22 (5), 571-579 (2016).
- Kadner, A., et al. Heterotopic heart transplantation: experimental development and clinical experience. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 17 (4), 474-481 (2000).
- Zinöcker, S., et al. Immune reconstitution and graft-versus-host reactions in rat models of allogeneic hematopoietic cell transplantation. Frontiers in Immunology. 3 (NOV), 1-12 (2012).
- Klempnauer, J., et al. Genetic control of rat heart allograft rejection: effect of different MHC and non-MHC incompatibilities. Immunogenetics. 30, 81-88 (1989).
- Huang, G., et al. Genetic manipulations in the rat: Progress and prospects. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (4), 391-399 (2011).
- Gordon, C. R., et al. Pulse doppler and M-mode to assess viability of cardiac allografts using heterotopic femoral heart transplantation in rats. Microsurgery. 27 (4), 240-244 (2007).
- Gordon, C. R., et al. A new modified technique for heterotopic femoral heart transplantation in rats. The Journal of Surgical Research. 139 (2), 157-163 (2007).
- Ma, Y., Wang, G. Comparison of 2 heterotopic heart transplant techniques in rats: cervical and abdominal heart. Experimental and Clinical Transplantation. 9 (2), 128-133 (2011).
- Bektas, H., et al. Differential effect of donor-specific blood transfusions after kidney, heart, pancreas, and skin transplantation in major histocompatibility complex-incompatible rats. Transfusion. 37 (2), 226-230 (1997).
- Saiho, K. O., et al. Long-term allograft acceptance induced by single dose anti-leukocyte common antigen (RT7) antibody in the rat. Transplantation. 71 (8), 1124-1131 (2001).
- Bektas, H., et al. Blood transfers infectious immunologic tolerance in MHC-incompatible heart transplantation in rats. Journal of Heart and Lung Transplantation. 24 (5), 614-617 (2005).
- Jäger, M. D., et al. Sirolimus promotes tolerance for donor and recipient antigens after MHC class II disparate bone marrow transplantation in rats. Experimental Hematology. 35 (1), 164-170 (2007).
- Timrott, K., et al. Application of allogeneic bone marrow cells in view of residual alloreactivity: Sirolimus but not cyclosporine evolves tolerogenic properties. PLoS ONE. 10 (4), 1-16 (2015).
- Hadamitzky, M., et al. Memory-updating abrogates extinction of learned immunosuppression. Brain, Behavior, and Immunity. 52, 40-48 (2016).
- Beetz, O., et al. Recipient natural killer cells alter the course of rejection of allogeneic heart grafts in rats. Plos One. 14 (8), e0220546 (2019).
- Hirschburger, M., et al. Nicotine Attenuates Macrophage Infiltration in Rat Lung Allografts. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 28 (5), 493-500 (2009).
- Ruzza, A., et al. Heterotopic heart transplantation in rats: improved anesthetic and surgical technique. Transplantation Proceedings. 42 (9), 3828-3832 (2010).
- Wang, D., et al. A simplified technique for heart transplantation in rats: abdominal vessel branch-sparing and modified venotomy. Microsurgery. 26 (6), 470-472 (2006).
- Wang, C., et al. A modified method for heterotopic mouse heart transplantion. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).
- Al-Amran, F. G., Shahkolahi, M. M. Total arterial anastomosis heterotopic heart transplantation model. Transplantation Proceedings. 45 (2), 625-629 (2013).
- Hoerstrup, S. P., et al. Modified technique for heterotopic rat heart transplantation under cardioplegic arrest. Journal of Investigative Surgery. 13 (2), 73-77 (2000).
- Fry, D. L. Acute vascular endothelial changes associated with increased blood velocity gradients. Circulation Research. 22 (2), 165-197 (1968).
- Ahmadi, A. R., et al. Orthotopic Rat Kidney Transplantation: A Novel and Simplified Surgical Approach. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
- Schmid, C., et al. Successful heterotopic heart transplantation in rat. Microsurgery. 15 (4), 279-281 (1994).
- Shan, J., et al. A modified technique for heterotopic heart transplantation in rats. Journal of Surgical Research. 164 (1), 155-161 (2010).
- Moris, D., et al.
- Bickerstaff, A. A., et al. Murine renal allografts: spontaneous acceptance is associated with regulated T cell-mediated immunity. Journal of Immunology. 167 (9), 4821-4827 (2001).
- Mottram, P. L., et al. Electrocardiographic monitoring of cardiac transplants in mice. Cardiovascular Research. 22 (5), 315-321 (1988).
- Torre-Amione, G., et al. Decreased expression of tumor necrosis factor-α in failing human myocardium after mechanical circulatory support: A potential mechanism for cardiac recovery. Circulation. 100 (11), 1189-1193 (1999).
- Goldstein, D. J., et al. Circulatory resuscitation with left ventricular assist device support reduces interleukins 6 and 8 levels. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (4), 971-974 (1997).
- Tang-Quan, K. R., et al. Non-volume-loaded heart provides a more relevant heterotopic transplantation model. Transplant Immunology. 23 (1-2), 65-70 (2010).
- Lakhal-Naouar, I., et al. Transcutaneous immunization using SLA or rLACK skews the immune response towards a Th1 profile but fails to protect BALB/c mice against a Leishmania major challenge. Vaccine. 37 (3), 516-523 (2019).
- Sousa-Batista, A. J., et al. Novel and safe single-dose treatment of cutaneous leishmaniasis with implantable amphotericin B-loaded microparticles. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. , (2019).
