Summary
Wir beschreiben ein Modell der heterotopischen Bauchherztransplantation bei Ratten, was Veränderungen der aktuellen Strategien impliziert, die zu einem vereinfachten chirurgischen Ansatz führen. Zusätzlich beschreiben wir ein neuartiges Abstoßungsmodell durch In-Ear-Injektion lebenswichtiger Herzmuskelzellen, das weitere transplantierte immunologische Analysen bei Ratten ermöglicht.
Abstract
Die heterotopische Herztransplantation bei Ratten ist seit mehr als 50 Jahren ein häufig verwendetes Modell für verschiedene immunologische Studien. Seit der ersten Beschreibung im Jahr 1964 wurden mehrere Änderungen gemeldet. Nach 30 Jahren heterotopischer Herztransplantation bei Ratten haben wir einen vereinfachten chirurgischen Ansatz entwickelt, der ohne weitere chirurgische Ausbildung oder Hintergrund leicht gelehrt und durchgeführt werden kann.
Nach der Zerlegung der aufsteigenden Aorta und der Lungenarterie und Ligation der überlegenen und minderwertigen Kavaliers- und Lungenvenen wird das Spenderherz geerntet und anschließend mit eiskalter Kochlösung ergänzt mit Heparin durchtränkt. Nach dem Spannen und Einschneiden der Empfänger-Bauchgefäße werden die aufsteigende Aorta und die Lungenarterie des Spenders mit kontinuierlichlaufenden Nähten an die Bauchaorta bzw. die inferiorven cava des Empfängers angeglüst.
Je nach verschiedenen Spender-Empfänger-Kombinationen ermöglicht dieses Modell Analysen der akuten oder chronischen Abstoßung von Allografts. Die immunologische Bedeutung dieses Modells wird durch einen neuartigen Ansatz der In-Ear-Injektion lebenswichtiger Herzmuskelzellen und der anschließenden Analyse der Entwässerung von zervikalen Lymphgewebes noch verstärkt.
Introduction
Die heterotopische Herztransplantation ist ein häufig verwendetes experimentelles Modell für verschiedene Untersuchungen in Bezug auf Transplantationstoleranz, akute und chronische Allograft-Abstoßung, Ischämie-Reperfusionsverletzung, maschinelle Perfusion oder Herzumbau. Unter anderem kann die Transplantatfunktion nichtinvasiv durch Palpation überwacht werden und Transplantatversagen führt nicht zu einer vitalen Beeinträchtigung des Empfängers im Gegensatz zu anderen Organen, wie Nieren oder Lebern.
1964 beschrieben Abbott et al. zunächst die heterotopische Bauchherztransplantation bei Ratten1. Später, 1966, wurde die End-to-Side-Technik für Anastomosen von Tomita et al.2beschrieben. Die Grundlagen für das derzeit verwendete Modell wurden von Ono und Lindsey im Jahr 1969berichtet 3. In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere Modifikationen veröffentlicht, um verschiedene Arten von entladenen, teilweise geladenen oder geladenen linksventrikulären Herztransplantaten zu erstellen, einschließlich kombinierter heterotopischer Herz-Lungen-Transplantation4,5,6. Für immunologische Analysen wird am häufigsten eine nicht volumenbelastete Herztransplantattransplantation durchgeführt. In diesem Fall gelangt der Blutfluss retrograd in die aufsteigende Aorta des Spenders und anschließend in die Herzkranzgefäße. Die venöse Drainage erfolgt entlang der koronaren Sinus in den rechten Vorhof und Ventrikel (Abbildung 1A-B). Daher ist die linke Herzkammer vom Blutfluss ausgeschlossen, abgesehen von marginalen Blutmengen aus Thebesian Venen. Dies macht es auch zu einem nützlichen Modell für die Untersuchung der pathophysiologischen Mechanismen während der linksventrikulären Assist-Gerätetherapie7.
Heterotopische Herztransplantation wurde bei verschiedenen Arten durchgeführt, einschließlich Mäusen, Kaninchen, Schweinen und wurde sogar als uni- oder biventrikuläre Sanitoren beimMenschen8,9,10,11verwendet. Die Ratte stellt immer noch ein beliebtes Versuchstier für Transplantationsmodelle dar, zumal die Transplantat-Überlebenszeiten für verschiedene Rattenstammkombinationen in der Vergangenheit gut definiert waren und eine große Anzahl immunologischer Reagenzien zugänglich sind12,13. Im Gegensatz zu Mäusen sind Ratten größer, was eine Operation und den Zugang zu Lymphgewebe für immunologische Analysen praktikabler macht12. Darüber hinaus wird die Einführung kommerzieller Klontechnologien bei Ratten in den letzten Jahren höchstwahrscheinlich zu einem wiederkehrenden Interesse an experimentellen Rattenmodellen führen14.
Im Allgemeinen können heterotopische Herztransplantate entweder durch Hals- oder Bauchanastomose an den Empfängergefäßen befestigt werden. Einige Studien deuten jedoch darauf hin, dass eine femorale Anastomose eine verbesserte Überwachung durch einen besseren Zugang für manuelle Palpation oder transfemorale Echokardiographie ermöglicht und somit eine genauere Erkennung von Transplantatversagen15,16ermöglicht.
Es hat sich gezeigt, dass es keinen Unterschied in Bezug auf Die Operationszeit, Komplikationsrate, Ergebnis und Transplantat-Überlebenszeit zwischen beiden Anastomose-Techniken17gibt. Natürlich muss die Verfügbarkeit einer ausreichenden Anzahl von entwässernden Lymphknoten als Vorteil der zervikalen Anastomose erwähnt werden; allerdings sind längere Ausbildungszeiten erforderlich. Im Gegensatz dazu ist die Bauchanastomose weniger kompliziert und ebenso wertvoll für immunologische Untersuchungen, insbesondere in Kombination mit Ergebnissen einer neuartigen Methode der In-Ear-Injektion allogener Herzmuskelzellen und der anschließenden zervikalen Lymphadenektomie. Eine Kombination beider Modelle bietet ein breites Spektrum postinterventionaler immunologischer Analysen.
Das folgende Protokoll bezieht sich auf die Bedienung bei Paaren von Chirurgen, um die Ischämiezeit zu reduzieren. Alle Experimente können jedoch von einer einzigen Person durchgeführt werden. Die Einrichtung von Instrumenten und Materialien für die Herzexplantation und Implantation ist in Abbildung 2A-Bdargestellt.
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Protocol
Alle Tiererfahrungen wurden nach den Richtlinien des lokalen Ethik-Tierprüfungsausschusses der Landesbehörden für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit Niedersachsen (LAVES, Oldenburg, Deutschland) mit den Zulassungsausweisen 12/0768 und 17/2472 durchgeführt.
1. Herzexplantation und Perfusion
HINWEIS: Als Transplantatspender wurden weibliche oder männliche Ratten im Alter von 7-22 Wochen verwendet.
- Anästhetisieren Sie die Spenderratte durch Isofluran-Inhalation (Induktion bei 5% und Wartung bei 3% bei einemO2-Fluss von 1 L/min). Injizieren Sie 5 mg Carprofen subkutan pro kg Körpergewicht für perioperative Analgesie und überprüfen Sie das Fehlen des Zehenpinch-Entzugsreflexes.
- Tragen Sie Augenschmiermittel auf und entfernen Sie das Bauch- und Brustfell mit einem mechanischen Knipser.
- Legen Sie den Spender in eine Supine-Position, fixieren Sie die Gliedmaßen an der Basis des Operationstisches mit elastischen Bändern und sterilisieren Sie die Haut mit 70% Ethanol oder einer anderen ausreichenden Alternative.
- Incise die Haut in Längsrichtung und nach Anwendung von Lokalanästhetikum (z.B. Lidocain 0,2%) eine mediane Laparotomie mit einer Schere durchführen.
- Retraktoren einsetzen, den Darm links vom Spender mobilisieren und die minderwertige Vena cava mit sterilisierten Wattestäbchen aussetzen.
- Zur Antikoagulation 500 I.U. von Heparin in 1 ml eiskalter isotonischer Salinlösung intravenös injizieren, indem die unterlegene Vena cava durchbrochen wird. Stoppen Sie die Blutung an der Punktionsstelle durch leichte Kompression mit einem Wattestäbchen nach Demrückzug der Nadel (Abbildung 3A).
- Schneiden Sie das Zwerchfell und führen Sie seitliche Thorakotomie auf beiden Seiten des Spenders.
- Pin die mobilisierte ventrale Wand des Thorax auf den Operationstisch.
- Entfernen Sie das Perikard und den Vagalnerv durch stumpfe Vorbereitung mit zwei Mikronadelhaltern.
- Führen Sie die Transsektion von Bauchgefäßen durch, um den Spender zu exsanguinate nieren und das Herz zu entladen.
- Setzen Sie den stumpfen Ast einer sondenspitzen Schere in die Transveren perikardialen Sinus ein und trennen Sie die aufsteigende Aorta und die Lungenarterie so distal wie möglich unter leichter kaudaler Zugkraft des Herzens mit einer benetzten Kompresse (Abbildung 3B).
- Legen Sie eine einzelne 5-0 Ligatur um die überlegene und untere Vena cava und die Lungenvenen und straffen Sie sie so dorsal wie möglich (Abbildung 3C).
- Trennen Sie das Gewebe dorsal an die Ligatur und extrahieren Sie das Herz (Abbildung 3D).
- Durchdiesättdas exkolonnierte Herz mit einer 18 G Kanüle aus einem intravenösen Katheter durch die aufsteigende Aorta und die Lungenarterie mit 30 ml eiskalter Isoton-Salinelösung, ergänzt durch 1000 I.U. Heparin, und das Herz in ein 15 ml-Rohr legen, das mit Einer Salinelösung gefüllt ist, auf Eis(Abbildung 3E-F).
2. Herzimplantation
HINWEIS: Als Empfänger wurden 10-14 Wochen alte weibliche oder männliche Ratten verwendet. Spender und Empfänger waren ungefähr gewichtet.
- Durchführen der Anästhesie der Empfängerratte auch mit Isofluran-Inhalation (Induktion bei 5% und Wartung bei 1,5-2% bei einemO2-Fluss von 1 L/min). Injizieren Sie 5 mg Carprofen subkutan pro kg Körpergewicht für perioperative Analgesie und überprüfen Sie das Fehlen des Zehenpinch-Entzugsreflexes.
- Tragen Sie Augenschmiermittel auf, entfernen Sie das Bauchfell, fixieren Sie die Gliedmaßen und sterilisieren Sie die Haut analog zum Spenderpräparat. Für ein optimales postoperatives Ergebnis führen Sie die Operation auf einer Heizmatte durch, um intraoperative Hypothermie zu verhindern.
- Nach dem Längsschnitt der Haut, wenden Sie ein lokales Anästhetikum, wie Lidocain (0,2%), auf die Bauchfaszie. Öffnen Sie die Bauchhöhle durch mediane Laparotomie und setzen Sie Retraktoren ein.
- Mobilisieren Sie den Darm auf der oberen linken Seite des Empfängers und legen Sie ihn in eine warme, nasse Kompresse.
- Nach der Mobilisierung des Zwölffingerdarms bzw. des proximalen Jejunums mit dem chirurgischen Mikroskop (oder Vergrößerungsbrille) mit einer 5-7-fachen Vergrößerung setzen Sie die Bauchaorta und die minderwertige Vena cava durch stumpfe Vorbereitung mit Wattestäbchen aus. Trennen Sie die Bauchgefäße nicht.
- Elevate die Bauchgefäße mit zwei Mikronadelhaltern, ohne die Lendenvenen zu verletzen und die Cooley Gefäßklemme zu positionieren (Abbildung 4A).
- Punktieren Sie die Bauchgefäße mit einer 30-45° gewölbten 27 G Kanüle (Abbildung 4B).
- Vergrößern Die Punktionsstelle mit der Potts-Schere, um einen Längsschnitt zu erzeugen, der der Größe des Lumens der Spendergefäße entspricht (Abbildung 4C-D) und die Empfängergefäße mit einer Salinelösung durchdringen, um Gerinnsel zu entfernen und postoperative Thrombose zu verhindern.
- Legen Sie das Transplantat in den Situs und fixieren Sie die Spender-Aufsteigende Aorta durch zwei einfache unterbrochene Stiche (8-0) an die Empfänger-Bauch-Aorta. Monofilament nicht resorbierbare Naht) an der Schädel- und Kaudalecke des Längsschnitts (Abbildung 4E).
- Anastomose die aufsteigende Aorta des Spenders mit der Bauchaorta des Empfängers durch eine laufende 8-0 Monofilament-Nähte in zwei Schritten: Legen Sie zuerst das Transplantat rechts von den Empfängergefäßen und führen Sie die erste Hälfte der Anastomose (Abbildung 4E). Anschließend das Transplantat links von den Empfängergefäßen platzieren und die zweite Hälfte der Anastomose durchführen (Abbildung 4F).
- Fixieren Sie die Spender-Lungenarterie analog zur aortenförmigen Anastomose (8-0 Monofilament nicht resorbierbare Naht). Die erste Hälfte der venösen Anastomose von der intraluminalen Seite des Gefäßes entlüfern(Abbildung 4G-H).
- Spülen Sie die Anastomosen mit Saline direkt vor dem Anziehen der Knoten, um periphere Embolie zu verhindern.
- Legen Sie eine hämostatische Gaze um beide Anastomosen und lösen Sie vorsichtig die Cooley Gefäßklemme, damit die Reperfusion des Transplantats beginnen kann. Behandeln Sie Blutungen entlang der Anastomosen durch leichte Kompression mit sterilisierten Wattestäbchen.
HINWEIS: Das Transplantat sollte nach etwa 60 s zu schlagen beginnen. - Ersetzen Sie den Darm in einer Mäander wie Mode. Stellen Sie sicher, dass es keine Malrotationen des mesenterischen Radix gibt, um Darmnekrose oder mechanische Obstruktion zu verhindern.
- Schließen Sie die Bauchmuskeln/Faszien und die Haut separat mit kontinuierlichen 3-0 Polyfilament-Laufnähten.
3. Postoperative Pflege
- Für postoperative Analgesie, geben Sie den Empfängern eine zusätzliche subkutane Injektion von 5 mg Carprofen pro kg Körpergewicht am ersten postoperativen Tag (POD). Zusätzlich 1 g Metamizol bis zum dritten POD zu 500 ml Trinkwasser hinzufügen.
- Beginnen Sie mit der Überwachung der Herztransplantatfunktion durch tägliche Abdominalpalpation auf dem dritten POD.
HINWEIS: Im Falle eines Transplantatversagens vor dem dritten POD sollte ein chirurgisches und kein immunologisches Versagen in Betracht gezogen werden. Dies hängt jedoch natürlich von der gewählten Stammkombination und dem jeweiligen immunologischen Modell ab (z.B. hyperakute Abstoßung nach vorheriger Immunisierung). - Nach der Transplantatabstoßung extrahieren Gewebe wie die abfließenden retroperitonealen Lymphknoten kranial der Anastomosen, der Milz, des Blutes, des Thymus und des Transplantats für weitere immunologische Analysen mittels Durchflusszytometrie oder Immunhistochemie.
4. Enzymatische Verdauung des Herzens und subkutane Injektion von Herzzellen im Ohr
- Durchführung von Herzexplantation enund Perfusion analog zur heterotopischen Herztransplantation (siehe Schritt 1).
- Das Herz in 3 mm x 3 mm Blöcken mit einem sterilen Skalpell oder einer sterilen Schere zerkleinern und 30 min bei 37 °C in Kulturmedium mit 0,5 mg/ml Kollagenase bebrüten.
HINWEIS: Es ist wichtig, Kulturmedium zu verwenden, das Penicillin, Streptomycin und Glutamin ohne fetales Kalbsserum (FCS) enthält, zumal FCS die Kollagennaseverdauung hemmt. - Fügen Sie das verdaute Gewebe zu einem großporigen Sieb hinzu, während Sie das Kulturmedium entfernen und gründlich Hackfleisch machen, um eine Suspension lebenswichtiger Herzmuskelzellen, meist toter Einzelherzzellen und verbleibender Blutzellen, zu erhalten. Waschen Sie die Zellsuspension zweimal mit steriler isotonischer Salinelösung.
HINWEIS: Zentrifugationseinstellungen: 10 min, 200 x g, 20 °C - Filtern Sie die Suspension mit einem 40-m-Zellsieb und sammeln Sie die lebenswichtigen Zellcongeries, indem Sie das Zellsieb mit 5-10 ml isotonischen Salinelösung spülen.
- Nach der Zentrifugation die Herzmuskelzellen in einer in einer Konzentration von 5x105 Zellen/ml gelösten Herzmuskellösung wieder aufsetzen und die Zelllösung in eine 1 ml Spritze ziehen.
- Führen Sie eine Anästhesie analog zum für die Empfängernarkose beschriebenen Protokoll (siehe Schritt 2) für die heterotopische Herztransplantation durch.
- Stellen Sie den Empfänger in eine seitliche Position und fixieren Sie das Ohr mit einem Finger mit doppelseitigem Klebeband (Abbildung 5A).
- Injizieren Sie 20 l der Herzmuskelzelllösung (mit 1 x 104 Zellen) über eine 27 G Kanüle s.c. in der Nähe der visuellen Kapillargefäße in das Ohr des Empfängers(Abbildung 5B).
- Nach einer definierten Beobachtungsperiode (abhängig von der gewählten Dehnungskombination und der Stärke der Abstoßung) die entwässernden zervikalen Lymphknoten extrahieren und weitere Analysen wie Durchflusszytometrie oder Kokulturen durchführen (Abbildung 5C).
HINWEIS: Darüber hinaus kann eine histologische Analyse der Pinna durchgeführt werden, um die Zellinfiltration zu bestimmen.
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Representative Results
In der Vergangenheit wurden verschiedene immunologische Fragen auf der Grundlage des Modells behandelt, das in der Arbeitsgruppe von mehr als 500 Transplantationen mit einer Überlebensrate von mehr als 95%13,,18,19,20,21,22,23,24validiert wurde. Die Gesamtbetriebszeiten (einschließlich Transplantatexplantation und Implantation) überstiegen in der Regel 60 Minuten nicht, während die kombinierten kalten und warmen Ischämiezeiten etwa 30 Minuten betrugen. Die angewendeten Dehnungskombinationen basierten hauptsächlich auf Lewis (Lew)-Hintergrund. Syngene Transplantationen überlebten bis zu 100 Tage ohne Anzeichen von Transplantatversagen, aber signifikante Gewichts- und Größenreduktion bei der Transplantattransplantation. Zuletzt führten wir eine heterotopische Herztransplantation in zwei verschiedenen Spender-Empfänger-Kombinationen durch, die ein schnelles und ein verlängertes Abstoßungsmodell simulierten: Lew.1a - Lew wt, was zu einer schnellen Abstoßung (mittlere Überlebenszeit von 7,4 Tagen) und Lew.1u-7B-Lew.1a führte zu einer längeren Abstoßung (mittlere Überlebenszeit von 42,5 Tagen)(Abbildung 6). Makroskopisch zeigten die abgelehnten Transplantate eine Thrombose, begleitet von einer livid verfärbung und Schwellung, während nicht abgelehnte Transplantate eine ausgeprägte Atrophie aufweisen, höchstwahrscheinlich als Folge einer unbelasteten linken Herzkammer. Darüber hinaus haben wir Kryostatabschnitte von transplantierten Herzen erstellt, um die Zellinfiltration mit einer alkalischen Phosphatase-Antialkali-Phosphatase-Färbemethode (APAAP) zu erkennen. Einzelbilder mit einer 50-fachen Vergrößerung wurden zu einem zusammengesetzten Bild zusammengeführt, was einen Überblick über das gesamte Transplantat und die Verteilung der infiltrierenden Zellen gibt. Histologische Analysen zeigten eine erhöhte Infiltration von (z.B. CD4+, TCR+, oder NKR-P1A/B+) Immunzellen in den allogenen Transplantaten, während syngene Transplantate weitgehend frei von Zellinfiltration waren (Abbildung 7A-C).
Zervikale Lymphadenektomie und Restimulationstests von entwässernden Lymphknotenzellen nach der Ohrinjektion von Herzmuskelzellen in den oben genannten Stammkombinationen ergaben deutliche dehnungsspezifische Immunreaktionen auf allogenes Herzgewebe und ermöglichten weitere immunologische Analysen, wie Z.B. Zytokinprofilierung(Abbildung 8A-C).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der end-to-side Anastomosen und des daraus resultierenden Blutflusses durch das Herz. Nach anastomosing der Spender aufsteigende Aorta von Ende zu Seite auf den Empfänger Abdominal Aorta und analog die Lungenarterie zum Empfänger minderwertigvena cava (A), Blutfluss tritt die Herzkranzgefäße über die aufsteigende Aorta. Die venöse Drainage erfolgt über den Sinus coronarius in das rechte Vor- und Endraum und durch die Lungenarterie in die Empfänger-Unterkiefer vena cava (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Erforderliche chirurgische Instrumente und Materialien. (A) Explantation: 1: elastisches Gliedmaßenband, 2: Retraktoren, 3: 5-0 Ligatur, 4: Sondenspitze Schere, 5-6: Mikronadelhalter, 7: Schere, 8: chirurgische Zangen, 9: Mikrozange, 10: Augenschmierstoff, 11: Kompressen, 12: Wattestäbchen, 13: Perfusionsbasis, 14: Salinelösung auf Eis. (B) Implantation: 1: elastisches Gliedmaßenband, 2: Retraktoren, 5-6: Mikronadelhalter, 7: Schere, 8: Zangen, 9: Mikrozangen, 10: Augenschmierstoff, 11: Kompressen, 12: Wattestäbchen, 15: Mikroschere, 16: Mikrozange, 17: Pottschere, 18: Nadelhalter, 19: gewölbte Kanüle, 20: Kühle Klemme, 21: 8-0 Monofilament-Nähte, 22: hämostatische Gaze, 23: 3-0 Polyfilament-Nähte, 24: Petrischale, 25: Carprofen (5 mg/ml), 26: Lokalanästhetikum (Lidocain 0,2%), 27: Salinelösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Herzexplantation. Nach der Heparinisierung (A) wird thorakotomie durchgeführt und aufsteigende Aorta und Lungenarterie werden so distal wie möglich abgetrennt (B). Mit einer einzigen Ligatur Pulmonale und beide Kavallevenen sind verschlossen (C) und das Herz wird aus der Brusthöhle entfernt (D). (E) zeigt das Herz vor und (F) nach Perfusion mit 30 ml Salinelösung, die Heparin enthält. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Herzimplantation. Nach der Exposition der Bauchgefäße und der Platzierung einer Cooley Gefäßklemme (A) werden die Gefäße kanüliert (B) und ein Längsschnitt wird mit Derinsschere (C-D) durchgeführt. Der spenderaufsteigende Aorta wird mit je einem Knoten an der Schädel- und Kaudalecke des Einschnitts der Empfängerabdominalaorta (E) fixiert und anastomosis wird durch kontinuierlich laufende Nähte (E-F) durchgeführt. Beachten Sie, dass das Transplantat auf der rechten Seite der Gefäße für die erste Hälfte der Anastomose (E) und auf der linken Seite der Gefäße für die zweite Hälfte der Anastomose (F) und die anschließende venöse Anastomose platziert wird. Die erste Hälfte der venösen Anastomose wird durch eine intraluminale Naht durchgeführt (G). Nach Abschluss der zweiten Hälfte der venösen Anastomose ist das Transplantat zur Reperfusion bereit (H). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: In-Ear-Injektion allogener Herzmuskelzellen. Nach der Fixierung des Ohres des Empfängers am Finger mit doppelseitigem Klebeband (A) werden allogene vitale Herzmuskelzellen subkutan nahe an visuelle Kapillargefäße injiziert (B). Nach einer Beobachtungsphase werden die entwässernden zervikalen Lymphknoten (*) extrahiert (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Überleben des Herzens in verschiedenen syngenen und allogenen Spender-Empfänger-Kombinationen. Die Kaplan-Meier-Analyse zeigt das Überleben von syngenem (n=10 schnelles Abstoßungsmodell; n=5 verlängertes Abstoßungsmodell) und allogenen Transplantaten (n=11 schnelles Abstoßungsmodell; n=14 verlängertes Abstoßungsmodell). Im längeren Ablehnungsmodell erreichten sechs von 14 Empfängern das Ende des Beobachtungszeitraums (60 Tage) ohne Transplantatversagen, was zu einem längeren Transplantatüberleben in dieser Gruppe führte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Histologische Analyse syngenischer und allogener Herztransplantate. (A-B) zeigen die Infiltration von CD4+ Zellen mit dem APAAP-Färbeverfahren in einem syngenen Transplantat (A) und einem allogenen Transplantat bei Abstoßung (B). (C) stellt die Zunahme der Zellinfiltration in allogenen Transplantaten im Vergleich zu syngenen Transplantaten (als Referenzgruppe) für verschiedene Immunzellteilgruppen dar. Die Klassifizierung zur Quantifizierung der Zellinfiltration wurde von Hirschburger et al.25: 0 = Infiltration vergleichbar mit syngenen Transplantaten modifiziert; 0,5 = leichter Anstieg der gefärbten Zellen in isolierten Gewebeabschnitten; 1 = Zunahme der einzelnen gebeizten Zellen über den gesamten Gewebeabschnitt; 1.5 = Zunahme der gefärbten Zellcluster gleichmäßig über den gesamten Gewebeabschnitt verteilt; 2 = stark; 2.5 = sehr stark; 3 = stärkste Zunahme von gefärbten Zellclustern im gesamten Gewebeabschnitt. Die histologischen Abschnitte der Transplantate wurden mit einer 50-fachen Vergrößerung analysiert. Fünf Transplantate pro Gruppe (syngenisch bzw. allogen) wurden in die Analyse einbezogen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Analyse der Entwässerung von Lymphknotenzellen nach In-Ear-Injektion allogener Herzmuskelzellen. Spezifische Restimulation (mit 2 x 105 Geschwüren des jeweiligen Spenderstamms) von 2 x 105 Lymphozyten, die entweder aus entwässernden zervikalen oder mesenterischen Lymphknoten (LN) von schnell ablehnenden Lew-Wt- und Die längeren abweisenden Lew.1a-Empfänger zeigten eine signifikant reduzierte Proliferation von entwässernden Lymphknotenzellen bei Lew.1a-Empfängern (A), während die proliferative Kapazität im Allgemeinen nach unspezifischer Stimulation mit CD3/CD28-Antikörpern (B) noch beobachtbar war. Überraschenderweise zeigte die Zytokinprofilierung eine Zunahme entzündlicher Zytokine in den Lymphknoten länger erweisender Empfänger (C). Die Ergebnisse werden als mittelwert -SEM von mindestens 4 Tieren pro Gruppe dargestellt. Die Signifikanz wird mit * für die p-Werte 0,05 und **** für p-Werte 0,0001 angegeben. (Diese Zahl wurde von Beetz et al.24geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die zuvor beschriebene Methode der heterotopischen Herztransplantation bei Ratten basiert hauptsächlich auf der Beschreibung von Ono und Lindsey im Jahr 19693. Seitdem wurden mehrere Modifikationen in verschiedenen Arten eingeführt, was zu einer großen Vielfalt dieses Modells führt. Durch die Kombination mehrerer dieser Modifikationen und die Einführung unserer eigenen Erfahrung, die sich aus über 30 Jahren heterotopischer Herztransplantationen im Labor ergibt, haben wir einen praktikablen chirurgischen Ansatz entwickelt, der keine langen Trainingszeiten oder chirurgischen Hintergrund erfordert. Im Folgenden werden wir die allgemeinen Einschränkungen dieses Modells besprechen und kritische Schritte des Protokolls unterstreichen. Darüber hinaus werden wir die Vorteile der Kombination von heterotopischer Herztransplantation mit einer neuartigen Methode der In-Ear-Injektion von Herzmuskelzellen hervorheben.
Anästhesie und allgemeine Komplikationen
Obwohl berichtet wurde, dass isoflurane Anästhesie der Injektionsanästhesie in Bezug auf das frühe Überleben nach heterotopischer Herztransplantation überlegen ist, stellt die intraoperative Atemdepression immer noch eine der häufigsten Komplikationen dar und erfordert daher ein sorgfältiges Narkosemanagement26. Anstelle der seriellen Transplantatexplantation bzw. Implantation empfehlen wir, die Vorbereitung des Empfängers und der Bauchgefäße unmittelbar nach der Thorakotomie des Spendertiers zu beginnen, insbesondere weil Operationszeiten von weniger als einer Stunde mit einem besseren Ergebnis in Bezug auf Transplantat und Empfängerüberleben verbunden sind26,27. Neben bereits erwähnten Komplikationen wie Unterkühlung durch lange Betriebszeiten und fehlende Heizmatten sowie Darmnekrose oder Obstruktion durch unphysiologische Platzierung des Darms stellt eine Parese von Hindernisgliedern eine weitere Komplikation dar, die durch atraumatisches Gefäßspannen und gründliche Spülung der Anastomosen verhindert werden kann, um periphere Embolie zu vermeiden28,29.
Ligatur von Lungen- und Kavaliersadern und Blutungskomplikationen
Um die warme Ischämiezeit zu reduzieren, verwenden wir eine einzige Ligatur für Kavallerie und alle vier Lungenvenen. Als mögliche Komplikation, die sich aus einer zu proximalen/ventralen Platzierung der Ligatur ergibt, ist die Störung des venösen Rückflusses durch Okklusion des Sinus coronarius zu erwähnen. Bei starken Blutungen nach Entfernung der Cooley-Klemme und sichtbarem Schlagen des Transplantats muss die Ligatur sofort auf Insuffizienz überprüft werden. Wir beobachteten diese Art der Komplikation vor allem, wenn die Zerlegung der Lungenvenen zu nah an der Ligatur durchgeführt wurde, während das Transplantat aus der Brusthöhle entfernt wurde. Ansonsten werden schwere Blutungen hauptsächlich durch Insuffizienz der Gefäßanastomosen verursacht. Zusätzlich wird eine koronare Arterie, die entlang der aufsteigenden Aorta verläuft, die oft während der Explantation abgetrennt wird, beschrieben, um tödliche Blutungen bei der Reperfusion zu verursachen27.
Ischämie Zeit und Perfusion
Unabhängig vom Transplantationsmodell ist es immer unerlässlich, die Ischämiezeit zu reduzieren, zumal das Herz in Bezug auf Ischämieschäden als verletzliches Organ betrachtet wird. Durch die Operation mit zwei Chirurgen sind wir in der Lage, eine minimale warme und kalte ischämische Zeit zu erreichen und daher auf den Einsatz von kardioplegischen Lösungen zu verzichten, um Ischämie-Reperfusionsschäden zu reduzieren30. Im Allgemeinen spielt die Perfusion des Transplantats eine Schlüsselrolle und ist wichtig, um das Transplantat zu kühlen und Blutzellen zu entfernen, was zu Thrombose oder Embolie führen könnte. Während niedrige Perfusionsdrücke zu einer unzureichenden Durchblutung und damit zu einer unvollständigen Entfernung der Blutzellen führen, können hohe Perfusionsdrücke endotheliale Schäden verursachen31,32. Wir empfehlen eine Durchblutung der Lungenarterie sowie der aufsteigenden Aorta, bis die Herzkranzgefäße sichtbar frei gespült werden.
Einschnitt von Empfängergefäßen
Ein kritischer Schritt im Protokoll ist der Einschnitt der Empfängergefäße, ohne die Gefäße hinteren Wänden zu beschädigen: Schmid et al. beschrieben den Nutzen der Aortotomie oder Venotomie, die einen kleinen Querschnitt durchführt, gefolgt von Längsvergrößerung in kranialer und kaudaler Richtung, was weiter zu einer verringerten Stenoserate der aortalen Anastomoseführt 33. In unserem Modell werden die Empfängergefäße mit einer kleinen Kanüle durchbohrt. Anschließend wird die Punktionsstelle mit einer Potts-Schere vergrößert, um einen Längsschnitt zu erzeugen. Für eine bessere Machbarkeit empfehlen wir, die Spitze der Kanüle auf einen Winkel von 30-45° zu biegen, was zu einem verringerten Risiko führt, die Hinterwand der Gefäße zu beschädigen. Wir haben bei keinem unserer Empfänger klinisch relevante Gefäßstenoseen beobachtet. Ähnliche Vorteile der Öffnung der Empfängergefäße durch Punktieren der Bauchaorta und der unteren Vena cava mit einer Kanüle wurden von Shan et al. 34 beschrieben.34.
Meisterung des Modells der heterotopischen Herztransplantation
In den letzten zehn Jahren wurde das Modell von Forschern in der Abteilung mit wenig oder gar keinem chirurgischen Hintergrund durchgeführt. Wie bereits erwähnt, arbeiten wir in Paaren von Chirurgen, während der erfahrenere Forscher dafür verantwortlich ist, den Erfolg der Transplantation zu garantieren und gleichzeitig die Fähigkeiten des unerfahrenen Forschers schrittweise zu verbessern. Nach einer kurzen Trainingszeit von etwa zehn Transplantat-Explantationen und Implantationen bei toten Tieren ist der unerfahrene Forscher für die Durchführung der Herzexplantation und die Unterstützung der Transplantatimplantation bei etwa zehn lebenden Tieren zuständig. Anschließend führt der unerfahrene Forscher aktiv die Vaskulärenanastomosen durch, so dass der ehemalige unerfahrene Forscher nach etwa zehn weiteren Transplantationen in der Regel in der Lage ist, alle kritischen Schritte des Modells durchzuführen.
Die Anwendung dieses Ausbildungskonzepts zeigten frühere Veröffentlichungen aus unserer Abteilung mit heterotopischer Herztransplantation bei Ratten trotz verschiedener Chirurgenteams13,,18,19,,20,21,22,23,24.
Bemerkenswert ist, dass die Durchführung der vaskulären Anastomosen den wichtigsten Schritt in diesem Protokoll und solide Organtransplantationsmodelle im Allgemeinen darstellt. Wir empfehlen daher längere Trainingszeiten mit toten Tieren, bis Anastomosen präzise und schnell durchgeführt werden, insbesondere wenn ein erfahrener Forscher nicht für die Führung bei lebenden Tieren zur Verfügung steht.
Allgemeine Vor- und Nachteile des Modells
Während die spontane Toleranzinduktion oft als Phänomen bei Lebertransplantationen beschrieben und auch bei Nierentransplantationen beobachtet wird, gilt das Herz als eher immunogenes Organ und ermöglicht somit eine zuverlässige Abstoßung in den Transplantationsmodellen35,36. Im Gegensatz zu diesen Erkenntnissen konnten wir auch ein langfristiges Überleben und das Fehlen einer Abstoßung nach heterotopischer Herztransplantation bei bestimmten Spender-Empfänger-Kombinationen feststellen, trotz vollständiger großer Komplexitätskomplexunterschiede.
Eine häufig erwähnte Kritik an der heterotopischen Herztransplantation ist die Subjektivität der Transplantatüberwachung durch manuelle Palpation. Daher wurde das Modell auf femorale Anastomosetechniken erweitert, um den Zugang zur Palpation zu erleichtern und weitere Überwachungstechniken wie die transfemorale Echokardiographie15,16einzuführen. Mottram et al. zeigten dagegen, dass die Überwachung des Transplantats mittels Palpation gut mit elektrokardiographischen Messungen korreliert37. So scheint die manuelle Palpation bei heterotopischen Herztransplantationen ausreichend für die Überwachung der Transplantatfunktion in einem akuten Abstoßungsmodell.
Als Folge der heterotopischen Platzierung und der linksventrikulären Entladung funktioniert das Herz unter anatomischen oder physiologischen Bedingungen nicht, vorausgesetzt, dass dies keine Auswirkungen auf immunologische Analysen hat. Entgegen dieser Annahme hatte sich gezeigt, dass eine Herzumgestaltung durch linksventrikuläre Entladung während der linksventrikulären Assist-Therapie zu einer verminderten Zytokinfreisetzung38,39führt. Tang-Quan et al. bezeichneten die unbelastete Einstellung dagegen als einen geeigneteren Ansatz für die immunologische Analyse, da eine langfristige ischämische Schädigung des Transplantats durch Perfusion mit teilweise desoxygeniertem Blut im linksventrikulär belasteten Modell beobachtet wurde40.
Obwohl die abdominale Platzierung der Transplantate chirurgische Vorteile in Bezug auf die Praktikabilität bietet, ist es schwierig, genügend entwässernde retroperitoneale Lymphknoten bei Transplantatabstoßung zu ernten, was weitere Analysen beeinträchtigt. Aus diesem Grund haben wir eine neuartige Methode der In-Ear-Injektion allogener Herzmuskelzellen eingeführt. Dieses Konzept, das aus der parasitologischen Forschung stammt, wurde trotz seiner Durchführbarkeit41,42für immunologische Analysen bei Transplantationen nicht angewendet. Der Vorteil dieses Modells ist die Möglichkeit, eine signifikante Anzahl von entwässernden Lymphknoten zu identifizieren und zu ernten, was die Möglichkeit bietet, komplexe immunologische Analysen durchzuführen. Bemerkenswert ist, dass beide Modelle in einem Empfänger kombiniert werden könnten, der weitere Einblicke in die Mechanismen der Abstoßung und Toleranz bei Zell- und Organtransplantationen bei Ratten bietet.
Unsere Modelle der Rattenherz- und Herzmuskelzelltransplantation stellen einen praktikablen und gut untersuchten Ansatz dar und können ohne weitere chirurgische Ausbildung oder Hintergrund durchgeführt werden. Angesichts der Tatsache, dass neue Klontechnologien für Ratten vor kurzem eingeführt und entwickelt wurden, bieten diese Modelle enorme Möglichkeiten für transplantationsimmunologische Forscher.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Britta Trautewig, Corinna Löbbert und Ingrid Meder für ihr Engagement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia device (including isoflurane vaporizer) | Summit Anesthesia Solutions | No Catalog Number available | |
| Cannula (27 G) | BD Microlance | 302200 | |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl 50 mg/mL | |
| Cellstar Tubes (15 mL) | GreinerBioOne | 188271 | |
| Cell strainer (40 µm) | BD Falcon | 2271680 | |
| Collagenase Type CLSII | Biochrome | C2-22 | |
| Compresses 5x5 cm | Fuhrmann | 31501 | |
| Compresses 7.5x7.5 cm | Fuhrmann | 31505 | |
| Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf | 1032128 | |
| Dexpathenol (5 %) | Bayer | "Bepanthen" | |
| DPBS BioWhittaker | Lonza | 17-512F | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD557R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD313R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD35 | |
| Heating mat | Gaymar Industries | "T/Pump" | |
| Hemostatic gauze | Ethicon | Tabotamp | |
| Heparin-Natrium 25 000 I.E. | Ratiopharm | No Catalog Number available | |
| Isofluran CP | CP-Pharma | No Catalog Number available | |
| Large-pored sieve (stainless steel) | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| Lidocaine | Astra Zeneca | 2 % Xylocain | |
| Metamizol-Natrium | Ratiopharma | Novaminsulfon 500 mg/mL | |
| Micro forceps | B. Braun | Aesculap BD3361 | |
| Micro needle holder | Codman, Johnson & Johnson Medical | Codmann 80-2003 | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap BD336R | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap FD241R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FD101R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FM471R | |
| Needle holder | B. Braun | Aesculap BM221R | |
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine (100x) | PAA | P11-010 | |
| Peripheral venous catheter (18 G) | B. Braun | 4268334B | |
| Peripheral venous catheter (22 G) | B. Braun | 4268091B | |
| Probe pointed scissors | B. Braun | Aesculap BC030R | |
| Retractors | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| RPMI culture medium | Lonza | BE12-702F | |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Baxter | No Catalog Number available | |
| Scissors | B. Braun | Aesculap BC414 | |
| Surgical microscope | Carl-Zeiss | OPMI-MDM | |
| Sutures (anastomoses) | Catgut | Mariderm 8-0 monofil | |
| Sutures (ligature) | Resorba | Silk 5-0 polyfil | |
| Sutures (skin, fascia) | Ethicon | Mersilene 3-0 | |
| Syringe (1 mL) | B. Braun | 9166017V | |
| Syringe (10 mL) | B. Braun | 4606108V | |
| Syringe (20 mL) | B. Braun | 4606205V | |
| Vascular clamp | B. Braun | Aesculap FB708R |
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