Hier karakteriseren we cellulaire proteotoxische stressreacties in de nematode C. elegans door het meten van de activering van fluorescerende transcriptieverslaggevers en assaying gevoeligheid voor fysiologische stress.
Organismen worden vaak blootgesteld aan fluctuerende omgevingen en veranderingen in intracellulaire homeostase, die schadelijke effecten kunnen hebben op hun proteome en fysiologie. Zo hebben organismen ontwikkeld gerichte en specifieke stress reacties gewijd aan schade te herstellen en te handhaven homeostase. Deze mechanismen omvatten de ontvouwde eiwitrespons van het endoplasmatische reticulum (UPRER),de ontvouwde eiwitrespons van de mitochondriën (UPRMT),de hitteschokrespons (HSR) en de oxidatieve stressrespons (OxSR). De hier gepresenteerde protocollen beschrijven methoden om de activering van deze trajecten en hun fysiologische gevolgen in de nematode, C. elegans, te detecteren en te karakteriseren. Ten eerste wordt het gebruik van trajectspecifieke fluorescerende transcriptieverslaggevers beschreven voor snelle cellulaire karakterisering, medicijnscreening of grootschalige genetische screening (bijvoorbeeld RNAi of gemuteerde bibliotheken). Daarnaast worden complementaire, robuuste fysiologische testen beschreven, die kunnen worden gebruikt om de gevoeligheid van dieren voor specifieke stressoren direct te beoordelen, wat dient als functionele validatie van de transcriptieverslaggevers. Samen maken deze methoden een snelle karakterisering van de cellulaire en fysiologische effecten van interne en externe proteotoxische verstoringen mogelijk.
Het vermogen van een organisme om te reageren op veranderingen in de intra- en buitencellulaire omgeving is cruciaal voor zijn overleving en aanpassing. Dit wordt bereikt op cellulair niveau door middel van tal van beschermende trajecten die de integriteit van de cel te waarborgen. Terwijl tal van cellulaire componenten zijn onderworpen aan stress-geassocieerde schade, een belangrijke betrokkenheid van cellulaire stress reacties is het herstellen en beschermen van de homeostase van de cellulaire proteome. Echter, de compartimentering van eiwitten in speciale structuren, genaamd organellen, vormt een uitdaging voor de cel, omdat het niet kan vertrouwen op een gecentraliseerde vorm van eiwit kwaliteitscontrole om ervoor te zorgen dat alle eiwitten in de cel goed worden gevouwen en functioneel. Daarom, om te gaan met verstoringen van hun eiwitten, organellen hebben ontwikkeld speciale kwaliteitscontrole mechanismen, die kunnen voelen verkeerd gevouwen eiwitten en activeren van een stress reactie in een poging om de stress te verlichten in dat compartiment. De cytosol is bijvoorbeeld afhankelijk van de hitteschokrespons (HSR), terwijl het endoplasmatische reticulum (ER) en mitochondriën afhankelijk zijn van hun compartimentspecifieke ontvouwde eiwitrespons (UPR). De OxSR dient om de toxische effecten van reactieve zuurstofsoorten (ROS) te verlichten. Elke stressreactie wordt geactiveerd in aanwezigheid van cellulaire uitdagingen en milieubeledigingen en induceert een op maat gemaakte transcriptiereactie. De kenmerken van deze reacties omvatten het synthetiseren van moleculen die verkeerd gevouwen eiwitten (zoals chaperonen) opnieuw vouwen die gericht zijn op de juiste organelle, of als alternatief beschadigde eiwitten verwijderen door eiwitafbraak. Het niet activeren van deze stressreacties resulteert in accumulatie van beschadigde eiwitten, cellulaire disfunctie die wordt gepropageerd tot systemisch falen van weefsels en uiteindelijk de dood van het organisme. De functie en regulering van de verschillende stressreacties worden elders herzien1.
Veel inzichten met betrekking tot de regulering en activiteit van cellulaire stress reacties zijn toegeschreven aan de nematode, Caenorhabditis elegans, een meercellig model organisme in genetisch onderzoek. Nematoden maken het niet alleen mogelijk om stressreacties op cellulair niveau te bestuderen, maar ook op het organismeniveau; nematoden zijn gebruikt om de effecten van genetische verstoringen of blootstelling aan drugs en verontreinigende stoffen op hun groei en overleving te bestuderen. Hun snelle generatie tijd, isogene, transparantie, genetische traktaat, en gebruiksgemak tijdens experimenten maken ze ideaal voor dergelijke studies. Bovendien maken de relatief snelle fysiologische reactie op stress (tussen uren en een paar dagen) en de evolutionaire conservering van cellulaire paden nematoden een prominent hulpmiddel bij het bestuderen van stressbestendigheid.
Er zijn twee veelgebruikte E. coli stammen gebruikt als een voedselbron om Te groeien C. elegans: standaard OP50, een B-stam waarin de meeste experimenten is historisch uitgevoerd2 en HT115, een K-12 stam die wordt gebruikt voor bijna alle RNAi experimenten3,4. Het is belangrijk op te merken dat er aanzienlijke verschillen zijn tussen OP50 en HT115 bacteriële diëten. Groei op deze verschillende bacteriële bronnen is aangetoond dat grote verschillen in metabolisch profiel veroorzaken, mitochondriale DNA-kopie nummer, en een aantal belangrijke fenotypes, waaronder levensduur5. Sommige van deze verschillen worden toegeschreven aan vitamine B12-tekort geassocieerd met groei op OP50-bacteriën, wat kan resulteren in defecten in mitochondriale homeostase en verhoogde gevoeligheid voor ziekteverwekkers en spanningen. Al deze fenotypes zijn aangetoond te worden verlicht door de groei op HT115 bacteriën, die hogere niveaus van vitamine B126hebben. Daarom wordt aanbevolen dat alle experimenten op fysiologische stressreacties worden uitgevoerd op HT115-bacteriën, ongeacht de noodzaak van RNAi-aandoeningen. Echter, vanwege het gemak van het onderhoud van dieren op OP50, alle standaard groei (dat wil zeggen, onderhoud en versterking van dieren) kan worden uitgevoerd op OP50, als significante verschillen in de experimentele paradigma’s hier beschreven werden niet gedetecteerd in wormen gehandhaafd op OP50, zolang ze werden verplaatst naar HT115 post synchronisatie (dat wil zeggen, van luik post-bleken met of zonder L1 arresteren) tot experimenten.
Hier wordt de karakterisering van de activiteit van cellulaire stressreacties met behulp van twee functionele methoden beschreven. Opgemerkt moet worden dat de gepresenteerde protocollen voornamelijk gericht zijn op cellulaire stressreacties en hun impact op eiwithomeostase. Ten eerste, fluorescerende transcriptie verslaggevers worden gebruikt, die worden gereguleerd door endogene genpromotoren die specifiek worden geactiveerd in reactie op verschillende cellulaire spanningen. Deze fluorescerende transcriptie verslaggevers zijn gebaseerd op de transcriptie-inductie van specifieke genen die inheems deel uitmaken van de stress respons. HSP-4, een hitteshockeiwit orthologous voor de menselijke chaperonne HSPA5/BiP, wordt bijvoorbeeld geactiveerd bij ER-stress en lokaliseert naar de ER om de stress te verlichten. In omstandigheden van ER-stress (bijvoorbeeld blootstelling aan tunicamycine), wordt een groen fluorescerend eiwit (GFP), geplaatst onder de verordening van de hsp-4 promotor, gesynthetiseerd in hoge niveaus zoals kan worden beoordeeld door fluorescerende microscopie of kwantitatief gemeten met behulp van grote deeltjesstroomcytometrie van nematoden7. Op dezelfde manier wordt de promotor van een mitochondriale chaperonne, hsp-6 (orthologous tot zoogdier HSPA9), gebruikt om de activering van de UPRMT8te controleren , en de promotor van de cytosolic chaperonne hsp-16.2 (orthologous voor de menselijke kristalline alfagenen) wordt gebruikt voor de beoordeling van de activiteit van de HSR9. Deze verslaggevers laten een snelle karakterisering van de trajecten geactiveerd in reactie op verschillende verstoringen.
Vaak worden de hier gepresenteerde verslaggevers afgebeeld met behulp van microscopie, die een kwalitatieve output van de activering van stressreacties biedt. Hoewel beeldvormingstechnieken zowel informatie geven over de intensiteit als de weefsellocatie van de hierboven beschreven verslaggevers, is de kwantificering niet altijd nauwkeurig of robuust. Hoewel het mogelijk is om fluorescerende activering te kwantificeren met behulp van imaging analyse tools, deze methoden zijn relatief lage doorvoer en steekproef grootte is klein, als gevolg van het relatief lage aantal dieren afgebeeld. Het gemak en de mogelijkheid om grote hoeveelheden dieren snel te verkrijgen maken C. elegans een ideaal model systeem om de activering van fluorescerende stress verslaggevers test door het gebruik van een grote deeltjesstroom cytometer. Een cytometer met grote deeltjesstroom is in staat om op te nemen, te analyseren en te sorteren op basis van grootte en fluorescentie van veel levende dieren. Met behulp van deze methode is het mogelijk om de fluorescerende intensiteit, grootte en ook ruimtelijke (2D) informatie te krijgen voor duizenden wormen. Het systeem wordt aangestuurd met Behulp van FlowPilot, die het mogelijk maakt voor real-time data-acquisitie en analyse van de gemeten parameters. Hier worden methoden voor zowel microscopische beeldvorming als kwantitatieve analyse met behulp van een cytometer met grote deeltjesstroom aangeboden als methoden om de activering van stressreacties te meten.
Naast reporter analyse, de gevoeligheid of weerstand van dieren tegen stress kan worden gemeten met behulp van fysiologische stress testen. Dit wordt bereikt door dieren bloot te stellen aan stressvolle omgevingen die specifieke cellulaire stresspaden activeren. Hier worden verschillende methoden verstrekt om de gevoeligheid van hele dieren voor specifieke soorten stressoren te meten.
ER-stress wordt toegepast op C. elegans met behulp van het chemische middel, tunicamycine, dat N-gekoppelde glycosylation blokkeert, waardoor ophoping van verkeerd gevouwen eiwitten in de ER10ontstaat. In C. elegansleidt de groei bij blootstelling aan tunicamycine tot grote verstoringen in de ER-functie en een aanzienlijk verminderde levensduur11. Door het meten van de overleving van dieren op tunicamycine-bevattende platen, er stress gevoeligheid van dieren kan worden gekwantificeerd. Bijvoorbeeld, dieren met buitenbaarmoederlijke UPRER-inductie en dus verhoogde weerstand tegen eiwit misfolding stress in de ER hebben een verhoogde overleving bij blootstelling aan tunicamycine in vergelijking met wilde dieren12.
Oxidatieve en mitochondriale stress wordt toegepast op C. elegans door dieren bloot te stellen aan het chemische middel, paraquat. Paraquat is een veel gebruikt herbicide, die superoxide vorming specifiek in de mitochondriën13veroorzaakt. Als gevolg van de specifieke lokalisatie van mitochondriën afgeleide reactieve zuurstofsoorten (ROS), paraquat tests worden vaak gebruikt als een “mitochondriale” stress test. Superoxide wordt echter snel omgezet in waterstofperoxide door mitochondriale superoxide dismutases (SOD’s)14. Waterstofperoxide kan vervolgens diffuus uit de mitochondriën en oxidatieve stress veroorzaken in andere compartimenten van de cel. Daarom beschrijven we paraquat overlevingstesten als het meten van de gevoeligheid voor zowel mitochondriale als oxidatieve stress (andere oxidatieve stresstesten zijn te vinden15).
Thermotolerantie testen worden uitgevoerd in C. elegans door het plaatsen van dieren in verhoogde temperaturen. De omgevingstemperaturen voor aaltjes zijn ~15-20 °C en thermische belasting wordt veroorzaakt bij temperaturen boven 25 °C16,17. Thermotolerantietesten worden over het algemeen uitgevoerd bij temperaturen variërend van 30-37 °C, omdat dieren grote cellulaire defecten vertonen bij deze temperatuur en overlevingstests binnen 24 uur16,18worden voltooid. Hier zijn twee alternatieve methoden voorzien voor het uitvoeren van thermotolerantietests: groei bij 34 °C en groei bij 37 °C. Samen kunnen de hier gepresenteerde protocollen worden gebruikt om grootschalige schermen uit te voeren in combinatie met standaard genknock-down met behulp van RNA-interferentie of chemische drugsbibliotheken.
Het protocol kan worden opgesplitst in 4 brede procedures- groei van C. elegans en voorbereiding op beeldvorming (secties 1 en 2), beeldvorming van transcriptieverslaggevers met behulp van fluorescerende microscopie (secties 3-5), kwantitatieve metingen van verslaggevers met behulp van een cytometer met grote deeltjesstroom (sectie 6) en fysiologische tests om stressgevoeligheid te meten in C. elegans (sectie 7).
Hier worden methoden beschreven om cellulaire stressreacties in C. eleganste ondervragen, met behulp van fluorescerende transcriptieverslaggevers en fysiologische stressoverlevingstesten. De verslaggevers maken allemaal gebruik van GFP expressie gedreven onder de promotor van een downstream transcriptie doel van de transcriptie factoren die betrokken zijn bij de montage cellulaire stress reacties. Het gebruik van hsp-4p::GFP gemoduleerd door XBP-1s-gemedieerde UPRER, hsp-6p::GFP geco…
The authors have nothing to disclose.
R.BZ. wordt ondersteund door de EMBO long term fellowship en The Larry L. Hillblom Foundation. R.H.S wordt ondersteund door subsidie 5F32AG03202023-02 via het National Institute of Aging (NIA) en de Glenn Foundation for Medical Research Postdoctoral Fellowship. A.F. wordt ondersteund door subsidie F32AG051355 via het NIA. H.K.G. wordt ondersteund door subsidie DGE1752814 via het National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program. M.G.M. wordt ondersteund door 1F31AG060660-01 tot en met NIA. A.D. wordt ondersteund door de Thomas and Stacey Siebel Foundation, het Howard Hughes Medical Institute en 4R01AG042679-04 en 5R01AG055891-02 van NIA en 5R01ES021667-09 van NIEHS. Wij danken Larry Joe, Melissa Sanchez, Naame Kelet en Anel Esquivel voor belangrijke technische bijstand. Wij danken het Morimoto lab en de CGC (gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) voor stammen.
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | for mitochondrial stress |
Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118072 | for NGM plates |
BD Difco granulated agar | VWR | 90000-782 | for NGM plates |
Calcium chloride dihydrate | VWR | 97061-904 | for NGM plates |
Carbenicillin | BioPioneer | C0051-25 | for RNAi |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | for NGM plates |
COPAS Biosorter | Union Biometrica | 350-5000-000 | equipped with a 488 nm light source. |
COPAS Cleaning Solution | Union Biometrica | 300-5072-000 | to use with COPAS |
COPAS Sheath Solution | Union Biometrica | 300-5070-100 | to use with COPAS |
DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | solvent for drugs |
IPTG dioxane free | Denville Scientific | CI8280-4 | for RNAi |
LB Broth Miller | Fisher Scientific | BP1426500 | for LB |
M205FA stereoscope | Leica | 10450040 | equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software |
Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | EM-MX0070-3 | for NGM plates, M9 |
Paraquat | Sigma-Aldrich | 36541 | for oxidative/mitochondrial stress |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | for bleach soluton |
Potassium phosphate dibasic | VWR | EM-PX1570-2 | for NGM plates |
Potassium phosphate monobasic | VWR | EM-PX1565-5 | for M9 |
Revolve | ECHO | 75990-514 | equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 71289-50G | for imaging |
Sodium Chloride | EMD Millipore | SX0420-5 | for NGM plates, M9 |
Sodium phosphate dibasic | VWR | 71003-472 | for M9 |
Tert-butyl hydroperoxide | Sigma-Aldrich | 458139 | for oxidative stress |
Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660-5G | for RNAi |
Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-50MG | for ER stress |