Misurazioni delle risposte allo stress fisiologico in C. Elegans
Summary
Qui, caratterizziamo le risposte di stress proteotossico cellulare nel nematode C. elegans misurando l’attivazione di reporter trascrizionali fluorescenti e analizzando la sensibilità allo stress fisiologico.
Abstract
Gli organismi sono spesso esposti ad ambienti fluttuanti e cambiamenti nell’omeostasi intracellulare, che possono avere effetti negativi sul loro proteoma e sulla fisiologia. Così, gli organismi hanno evoluto risposte mirate e specifiche allo stress dedicate a riparare i danni e mantenere l’omeostasi. Questi meccanismi includono la risposta proteica dispiegata del reticolo endolamico (UPRER),la risposta proteica dispiegata dei mitocondri (UPRMT), la risposta allo shock termico (HSR) e la risposta allo stress ossidativo (OxSR). I protocolli qui presentati descrivono i metodi per rilevare e caratterizzare l’attivazione di questi percorsi e le loro conseguenze fisiologiche nel nematode, C. elegans. In primo luogo, l’uso di reporter trascrizionali fluorescenti specifici del percorso è descritto per la caratterizzazione cellulare rapida, lo screening farmacologico o lo screening genetico su larga scala (ad esempio, RNAi o librerie mutanti). Inoltre, vengono descritti saggi fisiologici complementari e robusti, che possono essere utilizzati per valutare direttamente la sensibilità degli animali a fattori di stress specifici, servendo come convalida funzionale dei reporter trascrizionali. Insieme, questi metodi consentono una rapida caratterizzazione degli effetti cellulari e fisiologici delle perturbazioni proteotossiche interne ed esterne.
Introduction
La capacità di un organismo di rispondere ai cambiamenti nell’ambiente intra ed extracellulare è cruciale per la sua sopravvivenza e adattamento. Questo si ottiene a livello cellulare attraverso numerose vie protettive che garantiscono l’integrità della cellula. Mentre numerosi componenti cellulari sono soggetti a danni associati allo stress, uno dei principali coinvolgimenti delle risposte allo stress cellulare è quello di riparare e proteggere l’omeostasi del proteoma cellulare. Tuttavia, la compartimentazione delle proteine in strutture speciali, chiamate organelli, rappresenta una sfida per la cellula, in quanto non può basarsi su una forma centralizzata di controllo della qualità delle proteine per garantire che tutte le proteine all’interno della cellula siano correttamente piegate e funzionali. Pertanto, per affrontare le perturbazioni alle loro proteine, gli organelli hanno sviluppato meccanismi di controllo della qualità dedicati, che possono percepire le proteine piegate male e attivare una risposta allo stress nel tentativo di alleviare lo stress all’interno di quel compartimento. Ad esempio, il citosol si basa sulla risposta all’urto termico (HSR), mentre il reticolo endoplasmico (ER) e i mitocondri si basano sulle loro risposte proteiche spiegate specifiche per il compartimento (UPR). L’OxSR serve ad alleviare gli effetti tossici delle specie reattive dell’ossigeno (ROS). Ogni risposta allo stress viene attivata in presenza di sfide cellulari e insulti ambientali e induce una risposta trascrizionale su misura. I segni distintivi di queste risposte includono molecole sintetizzanti che ripiegano le proteine piegate male (come gli chaperoni) mirate all’organida corretta, o in alternativa, rimuovono le proteine danneggiate dalla degradazione delle proteine. La mancata attivazione di queste risposte allo stress comporta l’accumulo di proteine danneggiate, la disfunzione cellulare propagata al fallimento sistemico dei tessuti e infine la morte dell’organismo. La funzione e la regolazione delle diverse risposte allo stress sono esaminate altrove1.
Molte intuizioni riguardanti la regolazione e l’attività delle risposte allo stress cellulare sono state attribuite al nematode, Caenorhabditis elegans, un organismo modello multicellulare nella ricerca genetica. I nematodi non solo consentono di studiare l’attivazione delle risposte allo stress a livello cellulare, ma anche a livello di organismo; nematodi sono stati utilizzati per studiare gli effetti delle perturbazioni genetiche o l’esposizione a farmaci e inquinanti sulla loro crescita e sopravvivenza. Il loro tempo di generazione rapido, l’isogenesi, la trasparenza, la trattatività genetica e la facilità d’uso durante la sperimentazione li rendono ideali per tali studi. Inoltre, la risposta fisiologica relativamente veloce allo stress (tra ore e pochi giorni) e la conservazione evolutiva dei percorsi cellulari rendono i nematodi uno strumento prominente nello studio della resistenza allo stress.
Ci sono due ceppi di E. coli comunemente usati utilizzati come fonte di cibo per far crescere C. elegans: OP50 standard, un ceppo B in cui la maggior parte della sperimentazione è stata storicamente eseguita2 e HT115, un ceppo K-12 che viene utilizzato per quasi tutti gli esperimenti RNAi3,4. È importante notare che ci sono differenze significative tra le diete batteriche OP50 e HT115. La crescita su queste diverse fonti batteriche ha dimostrato di causare grandi differenze nel profilo metabolico, numero di copia del DNA mitocondriale, e diversi fenotipi principali, tra cui la durata della vita5. Alcune di queste differenze sono attribuite alla carenza di vitamina B12 associata alla crescita sui batteri OP50, che può provocare difetti nell’omeostasi mitocondriale e una maggiore sensibilità agli agenti patogeni e agli stress. Tutti questi fenotipi hanno dimostrato di essere alleviato dalla crescita sui batteri HT115, che hanno livelli più elevati di vitamina B126. Pertanto, si raccomanda di eseguire tutti gli esperimenti sulle risposte allo stress fisiologico sui batteri HT115, indipendentemente dalla necessità di condizioni di RNAi. Tuttavia, a causa della facilità di mantenimento degli animali su OP50, tutta la crescita standard (cioè la manutenzione e l’amplificazione degli animali) può essere eseguita su OP50, poiché differenze significative nei paradigmi sperimentali qui descritti non sono state rilevate nei worm mantenuti su OP50, purché siano stati spostati nell’HT115 dopo la sincronizzazione (cioè, dal post-bleaching del portello con o senza l’arresto L1) fino alla sperimentazione dell’arresto L1.
Qui, viene descritta la caratterizzazione dell’attività delle risposte allo stress cellulare utilizzando due metodi funzionali. Va notato che i protocolli presentati si concentrano principalmente sulle risposte allo stress cellulare e sul loro impatto sull’omeostasi delle proteine. In primo luogo, vengono utilizzati i reporter trascrizionali fluorescenti, che sono regolati da promotori genici endogeni che sono specificamente attivati in risposta a diversi stress cellulari. Questi reporter trascrizionali fluorescenti si basano sull’induzione trascrizionale di geni specifici che fanno nativamente parte della risposta allo stress. Ad esempio, l’HSP-4, una proteina da shock termico ortologo al accompagnatore umano HSPA5/BiP, viene attivata su stress ER e localizza al ER per alleviare lo stress. In condizioni di stress DA E. (ad esempio, l’esposizione alla tunicacina), una proteina fluorescente verde (GFP), posta sotto la regolazione del promotore hsp-4, è sintetizzata in alti livelli come può essere valutato mediante microscopia fluorescente o misurata quantitativamente utilizzando citometria di flusso di grandi particelle di nematodi7. Allo stesso modo, il promotore di un chaperone mitocondriale, hsp-6 (ortologo del mammifero HSPA9), viene utilizzato per monitorare l’attivazione dell’UPRMT8e il promotore del chaperone citosolico hsp-16.2 (ortologo al gene alfa cristallino umano) viene utilizzato per valutare l’attività dell’HSR9. Questi giornalisti permettono una rapida caratterizzazione dei percorsi attivati in risposta a varie perturbazioni.
Spesso, i giornalisti qui presentati sono immagini con microscopia, che fornisce un output qualitativo dell’attivazione delle risposte allo stress. Tuttavia, mentre le tecniche di imaging forniscono sia informazioni sull’intensità che sulla posizione dei tessuti dei reporter sopra descritti, la sua quantificazione non è sempre accurata o robusta. Sebbene sia possibile quantificare l’attivazione fluorescente utilizzando strumenti di analisi dell’imaging, questi metodi hanno una produttività relativamente bassa e le dimensioni del campione sono ridotte, a causa del numero relativamente basso di animali immaginati. La facilità e la capacità di ottenere grandi quantità di animali rendono rapidamente C. elegans un sistema modello ideale per testare l’attivazione dei reporter di stress fluorescente attraverso l’uso di un grande citometro a flusso di particelle. Un citometro a flusso di grandi particelle è in grado di registrare, analizzare e ordinare in base alle dimensioni e alla fluorescenza di molti animali vivi. Utilizzando questo metodo, è possibile ottenere l’intensità fluorescente, le dimensioni, e anche le informazioni spaziali (2D) per migliaia di vermi. Il sistema è controllato utilizzando FlowPilot, che consente l’acquisizione e l’analisi in tempo reale dei dati misurati. Qui, i metodi per l’imaging microscopico e l’analisi quantitativa utilizzando un citometro di flusso di particelle di grandi dimensioni sono offerti come metodi per misurare l’attivazione delle risposte allo stress.
Oltre all’analisi dei reporter, la sensibilità o la resistenza degli animali allo stress possono essere misurate utilizzando analisi dello stress fisiologico. Ciò si ottiene esponendo gli animali ad ambienti stressanti che attivano percorsi specifici di stress cellulare. Qui, vengono forniti diversi metodi per misurare la sensibilità di animali interi a specifici tipi di fattori di stress.
La sollecitazione ER viene applicata a C. elegans utilizzando l’agente chimico, la tunicamycina, che blocca la glicosilazione legata a N, causando l’accumulo di proteine piegate in modo misto nel ER10. In C. elegans, la crescita dopo l’esposizione alla tunicacina provoca grandi perturbazioni nella funzione ER, e una durata significativamente ridotta11. Misurando la sopravvivenza degli animali su placche contenenti tunicacina, è possibile quantificare la sensibilità allo stress ER degli animali. Ad esempio, gli animali con induzione ectopica di UPRER e quindi una maggiore resistenza allo stress da misfolding delle proteine nel ER hanno una maggiore sopravvivenza in base all’esposizione alla tunicamicina rispetto agli animali di tipo selvatico12.
Lo stress ossidativo e mitocondriale viene applicato a C. elegans esponendo gli animali all’agente chimico, il paraquat. Paraquat è un erbicida comunemente usato, che provoca la formazione di superossido specificamente nei mitocondri13. A causa della localizzazione specifica delle specie reattive dell’ossigeno derivate dai mitocondri (ROS), i saggi paraquati sono spesso usati come un saggio di stress “mitocondriale”. Tuttavia, il superossido viene rapidamente convertito in perossido di idrogeno dalle dismutasi mitocondriali del superossido (SOD)14. Il perossido di idrogeno può successivamente diffondersi dai mitocondri e causare stress ossidativo in altri compartimenti della cellula. Pertanto, descriviamo i saggi di sopravvivenza dei paraquati come misurala della sensibilità allo stress mitocondriale e ossidativo (altri test di stress ossidativo possono essere trovati15).
I saggi di termotolleranza vengono eseguiti in C. elegans mettendo gli animali a temperature elevate. Le temperature ambientali per i nematodi sono di 15-20 gradi centigradi e lo stress termico è indotto a temperature superiori a2:C16,17. I saggi di termotolleranza sono generalmente eseguiti a temperature che vanno da 30-37 gradi centigradi, poiché gli animali presentano gravi difetti cellulari a questa temperatura, e i test di sopravvivenza vengono completati entro 24 ore16,18. In questo caso, sono previsti due metodi alternativi per l’esecuzione di saggi di termotolleranza: crescita a 34 gradi centigradi e crescita a 37 gradi centigradi. Insieme, i protocolli qui presentati possono essere utilizzati per eseguire schermi su larga scala quando combinati con il gene knock-down standard utilizzando l’interferenza dell’RNA o le librerie di farmaci chimici.
Il protocollo può essere suddiviso in 4 procedure generali: crescita di C. elegans e preparazione per l’imaging (sezioni 1 e 2), imaging di reporter trascrizionali utilizzando microscopia fluorescente (sezioni 3-5), misurazioni quantitative dei reporter che utilizzano un citometro di flusso di grandi particelle (sezione 6) e analisi fisiologiche per misurare la sensibilità allo stress in C. elegans (sezione 7).
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, vengono descritti metodi per interrogare le risposte allo stress cellulare in C. elegans,utilizzando reporter trascrizionali fluorescenti e analisi di sopravvivenza allo stress fisiologico. Tutti i giornalisti utilizzano l’espressione GFP guidata sotto il promotore di un obiettivo trascrizionale a valle dei fattori di trascrizione coinvolti nel montaggio delle risposte allo stress cellulare. L’uso di hsp-4p::GFP modulato da UPRERmediato da XBP-1s , hsp-6p::GFP controllato da ATF…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R.BZ. è supportato dalla borsa di studio A lungo termine EMBO e dalla Larry L. Hillblom Foundation. R.H.S è supportato dalla sovvenzione 5F32AG032023-02 attraverso il National Institute of Aging (NIA) e la Glenn Foundation for Medical Research Postdoctoral Fellowship. A.F. è sostenuta dalla sovvenzione F32AG051355 attraverso la NIA. H.K.G. è supportato dalla sovvenzione DGE1752814 attraverso il National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program. M.G.M. è supportato da 1F31AG060660-01 attraverso NIA. A.D. è supportato dalla Thomas and Stacey Siebel Foundation, dall’Howard Hughes Medical Institute e dal 4R01AG042679-04 e da 5R01AG055891-02 della NIA e da 5R01ES021667-09 del NIEHS. Ringraziamo Larry Joe, Melissa Sanchez, Naame Kelet e Anel Esquivel per un’assistenza tecnica significativa. Ringraziamo il laboratorio Morimoto e il CGC (finanziato dal NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) per le varietà.
Materials
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | for mitochondrial stress |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118072 | for NGM plates |
| BD Difco granulated agar | VWR | 90000-782 | for NGM plates |
| Calcium chloride dihydrate | VWR | 97061-904 | for NGM plates |
| Carbenicillin | BioPioneer | C0051-25 | for RNAi |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | for NGM plates |
| COPAS Biosorter | Union Biometrica | 350-5000-000 | equipped with a 488 nm light source. |
| COPAS Cleaning Solution | Union Biometrica | 300-5072-000 | to use with COPAS |
| COPAS Sheath Solution | Union Biometrica | 300-5070-100 | to use with COPAS |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | solvent for drugs |
| IPTG dioxane free | Denville Scientific | CI8280-4 | for RNAi |
| LB Broth Miller | Fisher Scientific | BP1426500 | for LB |
| M205FA stereoscope | Leica | 10450040 | equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software |
| Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | EM-MX0070-3 | for NGM plates, M9 |
| Paraquat | Sigma-Aldrich | 36541 | for oxidative/mitochondrial stress |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | for bleach soluton |
| Potassium phosphate dibasic | VWR | EM-PX1570-2 | for NGM plates |
| Potassium phosphate monobasic | VWR | EM-PX1565-5 | for M9 |
| Revolve | ECHO | 75990-514 | equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 71289-50G | for imaging |
| Sodium Chloride | EMD Millipore | SX0420-5 | for NGM plates, M9 |
| Sodium phosphate dibasic | VWR | 71003-472 | for M9 |
| Tert-butyl hydroperoxide | Sigma-Aldrich | 458139 | for oxidative stress |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660-5G | for RNAi |
| Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-50MG | for ER stress |
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