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Biology

Mesures des réponses physiologiques au stress à C. Elegans

Published: May 21, 2020
doi:
10.3791/61001
, , , , , , ,
1Department of Molecular and Cell Biology,University of California, Berkeley

Summary

Ici, nous caractérisons les réponses de stress protéotoxiciques cellulaires dans le nématode C. elegans en mesurant l’activation des reporters transcriptionnels fluorescents et en assayant la sensibilité au stress physiologique.

Abstract

Les organismes sont souvent exposés à des environnements fluctuants et à des changements dans l’homéostasie intracellulaire, ce qui peut avoir des effets néfastes sur leur protégé et leur physiologie. Ainsi, les organismes ont développé des réponses ciblées et spécifiques au stress dédiées à réparer les dommages et à maintenir l’homéostasie. Ces mécanismes comprennent la réponse protéique dépliée du réticulum endoplasmique (UPRER), la réponse protéique dépliée des mitochondries (UPRMT),la réponse de choc thermique (HSR), et la réponse oxydative de stress (OxSR). Les protocoles présentés ici décrivent des méthodes pour détecter et caractériser l’activation de ces voies et leurs conséquences physiologiques dans le nématode, C. elegans. Premièrement, l’utilisation de reporters transcriptionnels fluorescents spécifiques à la voie est décrite pour la caractérisation cellulaire rapide, le dépistage des médicaments ou le dépistage génétique à grande échelle (p. ex., RNAi ou bibliothèques mutantes). En outre, des tests physiologiques complémentaires et robustes sont décrits, qui peuvent être utilisés pour évaluer directement la sensibilité des animaux à des facteurs de stress spécifiques, servant de validation fonctionnelle des reporters transcriptionnels. Ensemble, ces méthodes permettent une caractérisation rapide des effets cellulaires et physiologiques des perturbations protéotoxiciques internes et externes.

Introduction

La capacité d’un organisme à réagir aux changements dans l’environnement intra- et extracellulaire est cruciale pour sa survie et son adaptation. Ceci est accompli au niveau cellulaire par de nombreuses voies protectrices qui assurent l’intégrité de la cellule. Tandis que de nombreux composants cellulaires sont sujets à des dommages liés au stress, une participation importante des réponses de stress cellulaire est de réparer et de protéger l’homéostasie du protéome cellulaire. Cependant, la compartimentation des protéines en structures spéciales, appelées organites, pose un défi pour la cellule, car elle ne peut pas compter sur une forme centralisée de contrôle de la qualité des protéines pour s’assurer que toutes les protéines de la cellule sont correctement pliées et fonctionnelles. Par conséquent, pour faire face aux perturbations de leurs protéines, les organites ont développé des mécanismes de contrôle de la qualité dédiés, qui peuvent détecter les protéines mal repliées et activer une réponse au stress dans une tentative d’alléger le stress dans ce compartiment. Par exemple, le cytosol repose sur la réponse au choc thermique (HSR), tandis que le réticulum endoplasmique (ER) et les mitochondries s’appuient sur leurs réponses protéiques dépliées spécifiques à leur compartiment (UPR). L’OxSR sert à atténuer les effets toxiques des espèces réactives d’oxygène (ROS). Chaque réponse au stress est déclenchée en présence de défis cellulaires et d’insultes environnementales et induit une réponse transcriptionnelle sur mesure. Les caractéristiques de ces réponses comprennent la synthèse des molécules qui replient les protéines mal repliées (comme les chaperons) ciblées sur l’organelle appropriée, ou alternativement, enlever les protéines endommagées par la dégradation des protéines. L’omission d’activer ces réponses de stress entraîne l’accumulation de protéines endommagées, le dysfonctionnement cellulaire propagé à l’échec systémique des tissus, et finalement la mort de l’organisme. La fonction et la régulation des différentes réponses au stress sont examinées ailleurs1.

De nombreuses idées concernant la régulation et l’activité des réponses au stress cellulaire ont été attribuées au nématode, Caenorhabditis elegans, un organisme modèle multicellulaire dans la recherche génétique. Les nématodes permettent non seulement d’étudier l’activation des réponses au stress au niveau cellulaire, mais aussi au niveau de l’organisme; nématodes ont été utilisés pour étudier les effets des perturbations génétiques ou de l’exposition à des médicaments et des polluants sur leur croissance et leur survie. Leur temps de génération rapide, l’isogeny, la transparence, la tractabilité génétique et la facilité d’utilisation pendant l’expérimentation les rendent idéaux pour de telles études. En outre, la réponse physiologique relativement rapide au stress (entre les heures et quelques jours) et la conservation évolutive des voies cellulaires font des nématodes un outil important dans l’étude de la résistance au stress.

Il existe deux souches E. coli couramment utilisées comme source de nourriture pour cultiver des C. elegans: op50 standard, une souche B dans laquelle la plupart des expérimentations ont été historiquement effectuées2 et HT115, une souche K-12 qui est utilisée pour presque toutes les expériences RNAi3,4. Il est important de noter qu’il existe des différences significatives entre les régimes bactériens OP50 et HT115. La croissance sur ces différentes sources bactériennes a été montrée pour causer des différences importantes dans le profil métabolique, le numéro de copie d’ADN mitochondrial, et plusieurs phénotypes principaux, y compris la durée de vie5. Certaines de ces différences sont attribuées à l’insuffisance de vitamine B12 associée à la croissance sur les bactéries OP50, qui peuvent entraîner des défauts dans l’homéostasie mitochondriale et une sensibilité accrue aux agents pathogènes et aux stress. Tous ces phénotypes ont été montrés pour être atténués par la croissance sur les bactéries HT115, qui ont des niveaux plus élevés de vitamine B126. Par conséquent, il est recommandé que toutes les expériences sur les réponses physiologiques au stress soient effectuées sur les bactéries HT115, indépendamment de la nécessité des conditions d’ARNi. Cependant, en raison de la facilité de maintenir les animaux sur OP50, toute la croissance standard (c.-à-d. l’entretien et l’amplification des animaux) peuvent être effectuées sur OP50, car des différences significatives dans les paradigmes expérimentaux décrits ici n’ont pas été détectées dans les vers maintenus sur OP50 tant qu’ils ont été déplacés à la synchronisation post HT115 (c.-à-d., de l’éclosion après le blanchiment ou sans arrestation L1) jusqu’à l’expérimentation.

Ici, la caractérisation de l’activité des réponses de stress cellulaire utilisant deux méthodes fonctionnelles est décrite. Il convient de noter que les protocoles présentés sont principalement axés sur les réponses au stress cellulaire et leur impact sur l’homéostasie des protéines. Tout d’abord, les journalistes transcriptionnels fluorescents sont utilisés, qui sont réglementés par les promoteurs de gènes endogènes qui sont spécifiquement activés en réponse à différents stress cellulaires. Ces reporters transcriptionnels fluorescents sont basés sur l’induction transcriptionnelle de gènes spécifiques qui font partie indigène de la réponse au stress. Par exemple, HSP-4, une protéine de choc thermique orthologue à la chaperon humaine HSPA5/BiP, est activée sur le stress aux ER et localise aux ER pour soulager le stress. Dans les conditions de stress aux urgences (p. ex., l’exposition à la tunicamycine), une protéine fluorescente verte (GFP), placée sous la réglementation du promoteur hsp-4, est synthétisée à des niveaux élevés, comme on peut l’évaluer par microscopie fluorescente ou mesurée quantitativement à l’aide de la cytométrie du débit à grande particule des nématodes7. De même, le promoteur d’un chaperon mitochondrial, hsp-6 (orthologue au mammifère HSPA9), est utilisé pour surveiller l’activation de l’UPRMT8, et le promoteur de la chaperon cytosolique hsp-16.2 (orthologue aux gènes alpha cristalline humaine) est utilisé pour évaluer l’activité de la HSR9. Ces reporters permettent une caractérisation rapide des voies activées en réponse à diverses perturbations.

Souvent, les journalistes présentés ici sont photographiés à l’aide de microscopie, ce qui fournit une sortie qualitative de l’activation des réponses au stress. Cependant, bien que les techniques d’imagerie fournissent à la fois des informations sur l’intensité et l’emplacement des tissus des journalistes décrits ci-dessus, sa quantification n’est pas toujours exacte ou robuste. Bien qu’il soit possible de quantifier l’activation fluorescente à l’aide d’outils d’analyse d’imagerie, ces méthodes sont relativement faibles et la taille de l’échantillon est faible, en raison du nombre relativement faible d’animaux photographiés. La facilité et la capacité d’obtenir de grandes quantités d’animaux font rapidement de C. elegans un système modèle idéal pour apaiser l’activation des journalistes de stress fluorescent grâce à l’utilisation d’un cytomètre de débit de particules importante. Un cytomètre à débit à grande particule est capable d’enregistrer, d’analyser et de trier en fonction de la taille et de la fluorescence de nombreux animaux vivants. En utilisant cette méthode, il est possible d’obtenir l’intensité fluorescente, la taille, et aussi l’information spatiale (2D) pour des milliers de vers. Le système est contrôlé à l’aide de FlowPilot, qui permet l’acquisition et l’analyse en temps réel des paramètres mesurés. Ici, des méthodes d’imagerie microscopique et d’analyse quantitative à l’aide d’un cytomètre à débit à grande particule sont proposées comme méthodes pour mesurer l’activation des réponses au stress.

Au-delà de l’analyse des journalistes, la sensibilité ou la résistance des animaux au stress peut être mesurée à l’aide d’essais de stress physiologique. Ceci est réalisé en exposant les animaux à des environnements stressants qui activent des voies de stress cellulaire spécifiques. Ici, plusieurs méthodes sont fournies pour mesurer la sensibilité des animaux entiers à des types spécifiques de facteurs de stress.

Le stress d’ER est appliqué à C. elegans en utilisant l’agent chimique, tunicamycine, qui bloque la glycosylation liée au N, causant l’accumulation de protéines mal repliées dansl’ER 10. Dans C. elegans, la croissance à l’exposition à la tunicamycine entraîne des perturbations majeures dans la fonction d’ER, et une durée de vie11 considérablementdiminuée. En mesurant la survie des animaux sur les plaques contenant de la tunicamycine, la sensibilité au stress des animaux aux ER peut être quantifiée. Par exemple, les animaux atteints d’induction ectopiqued’ER UPR et donc d’une résistance accrue au stress de mauvais recul des protéines aux repli sur les ER ont une survie accrue lors de l’exposition à la tunicamycine par rapport aux animaux de type sauvage12.

Le stress oxydatif et mitochondrial est appliqué à C. elegans en exposant les animaux à l’agent chimique, paraquat. Paraquat est un herbicide couramment utilisé, qui provoque la formation de superoxyde spécifiquement dans les mitochondries13. En raison de la localisation spécifique des espèces réactives d’oxygène (ROS) dérivées des mitochondries, les essais de parquat sont souvent utilisés comme un essai de stress « mitochondrial ». Cependant, le superoxyde est rapidement converti en peroxyde d’hydrogène par des dismutases mitochondriales de superoxyde (SOD)14. Le peroxyde d’hydrogène peut par la suite se diffuser hors des mitochondries et causer un stress oxydatif dans d’autres compartiments de la cellule. Par conséquent, nous décrivons les essais de survie parquat comme mesurant la sensibilité au stress mitochondrial et oxydatif (d’autres essais de stress oxydatif peuvent être trouvés15).

Les essais de thermotolerance sont effectués à C. elegans en plaçant les animaux à des températures élevées. Les températures ambiantes pour les nématodes sont de 15 à 20 oC et le stress thermique est induit à des températures supérieures à 25 oC16,17. Les essais de thermotolerance sont généralement effectués à des températures allant de 30-37 oC, car les animaux présentent des défauts cellulaires majeurs à cette température, et les essais de survie sont effectués dans les 24 heures16,18. Ici, deux autres méthodes sont fournies pour effectuer des essais de thermotolerance : la croissance à 34 oC et la croissance à 37 oC. Ensemble, les protocoles présentés ici peuvent être utilisés pour effectuer des écrans à grande échelle lorsqu’ils sont combinés avec le gène standard knock-down à l’aide d’interférences d’ARN ou de bibliothèques de médicaments chimiques.

Le protocole peut être divisé en 4 procédures générales – la croissance de C. elegans et la préparation pour l’imagerie (sections 1 et 2), l’imagerie des journalistes transcriptionnels à l’aide de microscopie fluorescente (sections 3-5), des mesures quantitatives des journalistes à l’aide d’un cytomètre à flux à grande particule (section 6), et des essais physiologiques pour mesurer la sensibilité au stress dans C. elegans (section 7).

Protocol

1. Conditions de croissance standard des températures et OP50 vs HT115 Croissance et expansion standard Développer une culture d’OP50 en LB(tableau 1) ou des supports équivalents de choix pour 24-48 h à température ambiante (22-25 oC). Cultivez des bactéries à température ambiante car OP50 est un uracil auxotroph et il y a une incidence plus élevée de réversants (p. ex., mutants suppresseurs) lorsqu’ils sont cultivés à 37 oC. Le stockage à long terme des cultures OP50 …

Representative Results

Utilisation de reporters transcriptionnels pour mesurer l’activation des réponses au stressIci, les reporters transcriptionnels fluorescents sont utilisés, qui servent d’outils robustes pour mesurer l’activation de la plupart des réponses au stress dans C. elegans. L’expression GFP est conduite sous le promoteur de cibles canoniques des régulateurs transcriptionnels principaux impliqués dans la réponse aux contraintes spécifiques aux compartime…

Discussion

Ici, des méthodes pour interroger les réponses de stress cellulaire dans C. elegans, utilisant des reporters transcriptionnels fluorescents et des essais physiologiques de survie de stress sont décrits. Les journalistes utilisent tous l’expression GFP entraînée sous le promoteur d’une cible transcriptionnelle en aval des facteurs de transcription impliqués dans l’augmentation des réponses de stress cellulaire. L’utilisation de hsp-4p::GFP modulé par XBP-1s-mediated UPRER, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R.BZ. est soutenue par la bourse à long terme de l’EMBO et la Fondation Larry L. Hillblom. R.H.S est soutenu par une subvention 5F32AG032023-02 par l’intermédiaire du National Institute of Aging (NIA) et de la Glenn Foundation for Medical Research Postdoctoral Fellowship. A.F. est soutenu par la subvention F32AG051355 par l’intermédiaire de la NIA. H.K.G. est appuyé par une subvention DGE1752814 par l’entremise du Programme de bourses de recherche supérieures de la National Science Foundation. M.G.M. est soutenu par 1F31AG060660-01 par NIA. A.D. est soutenu par la Fondation Thomas et Stacey Siebel, le Howard Hughes Medical Institute et 4R01AG042679-04 et 5R01AG05891-02 de NIA, et 5R01ES021667-09 de NIEHS. Nous remercions Larry Joe, Melissa Sanchez, Naame Kelet et Anel Esquivel pour leur aide technique importante. Nous remercions le laboratoire Morimoto et la CCG (financé par le Bureau de l’infrastructure de recherche des NIH P40 OD010440) pour ses souches.

Materials

Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 for mitochondrial stress
Bacto Peptone Fisher Scientific DF0118072 for NGM plates
BD Difco granulated agar VWR 90000-782 for NGM plates
Calcium chloride dihydrate VWR 97061-904 for NGM plates
Carbenicillin BioPioneer C0051-25 for RNAi
Cholesterol Sigma-Aldrich 57-88-5 for NGM plates
COPAS Biosorter Union Biometrica 350-5000-000 equipped with a 488 nm light source.
COPAS Cleaning Solution Union Biometrica 300-5072-000 to use with COPAS
COPAS Sheath Solution Union Biometrica 300-5070-100 to use with COPAS
DMSO Sigma-Aldrich 472301 solvent for drugs
IPTG dioxane free Denville Scientific CI8280-4 for RNAi
LB Broth Miller Fisher Scientific BP1426500 for LB
M205FA stereoscope Leica 10450040 equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software
Magnesium sulfate heptahydrate VWR EM-MX0070-3 for NGM plates, M9
Paraquat Sigma-Aldrich 36541 for oxidative/mitochondrial stress
Potassium Chloride Fisher P217-500 for bleach soluton
Potassium phosphate dibasic VWR EM-PX1570-2 for NGM plates
Potassium phosphate monobasic VWR EM-PX1565-5 for M9
Revolve ECHO 75990-514 equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software
Sodium Azide Sigma-Aldrich 71289-50G for imaging
Sodium Chloride EMD Millipore SX0420-5 for NGM plates, M9
Sodium phosphate dibasic VWR 71003-472 for M9
Tert-butyl hydroperoxide Sigma-Aldrich 458139 for oxidative stress
Tetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich T7660-5G for RNAi
Tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-50MG for ER stress
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Keywords: C. ElegansPhysiological Stress ResponsesStress Response AssayHeat Shock ProteinEndoplasmic Reticulum Unfolded Protein ResponseGFP ReporterSodium AzideMicromanipulationHigh-throughputGenetic PerturbationsPharmacological PerturbationsMolecular And Physiological AnalysisSynchronizationImagingMicroscopy
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Bar-Ziv, R., Frakes, A. E., Higuchi-Sanabria, R., Bolas, T., Frankino, P. A., Gildea, H. K., Metcalf, M. G., Dillin, A. Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans. J. Vis. Exp. (159), e61001, doi:10.3791/61001 (2020).
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