Mediciones de las respuestas fisiológicas de estrés en C. Elegans

Summary

Aquí, caracterizamos las respuestas de estrés proteotóxico celular en el nematodo C. elegans midiendo la activación de los reporteros transcripcionales fluorescentes y diciendo sensibilidad al estrés fisiológico.

Abstract

Los organismos a menudo están expuestos a ambientes fluctuantes y cambios en la homeostasis intracelular, que pueden tener efectos perjudiciales en su proteome y fisiología. Por lo tanto, los organismos han evolucionado respuestas de estrés específicas y específicas dedicadas a reparar el daño y mantener la homeostasis. Estos mecanismos incluyen la respuesta proteica desplegada del retículo endoplasmático (UPR^ER),la respuesta proteica desplegada de las mitocondrias (UPR^MT),la respuesta de choque térmico (HSR) y la respuesta de estrés oxidativo (OxSR). Los protocolos aquí presentados describen métodos para detectar y caracterizar la activación de estas vías y sus consecuencias fisiológicas en el nematodo, C. elegans. En primer lugar, se describe el uso de reporteros transcripcionales fluorescentes específicos de la vía para la caracterización celular rápida, la detección de drogas o la detección genética a gran escala (por ejemplo, RNAi o bibliotecas mutantes). Además, se describen ensayos fisiológicos complementarios y robustos, que pueden utilizarse para evaluar directamente la sensibilidad de los animales a factores de estrés específicos, sirviendo como validación funcional de los reporteros transcripcionales. Juntos, estos métodos permiten una rápida caracterización de los efectos celulares y fisiológicos de las perturbaciones proteotóxicas internas y externas.

Introduction

La capacidad de un organismo para responder a los cambios en el entorno intra y extracelular es crucial para su supervivencia y adaptación. Esto se logra a nivel celular a través de numerosas vías protectoras que aseguran la integridad de la célula. Mientras que numerosos componentes celulares están sujetos a daño asociado al estrés, una participación importante de las respuestas de estrés celular es reparar y proteger la homeostasis del proteome celular. Sin embargo, la compartimentación de proteínas en estructuras especiales, llamadas orgánulos, plantea un desafío para la célula, ya que no puede confiar en una forma centralizada de control de calidad de proteínas para garantizar que todas las proteínas dentro de la célula estén correctamente plegadas y funcionales. Por lo tanto, para hacer frente a las perturbaciones a sus proteínas, los orgánulos han desarrollado mecanismos de control de calidad dedicados, que pueden detectar proteínas mal dobladas y activar una respuesta de tensión en un intento de aliviar el estrés dentro de ese compartimiento. Por ejemplo, el citosol se basa en la respuesta de choque térmico (HSR), mientras que el retículo endoplasmático (ER) y las mitocondrias dependen de sus respuestas proteicas desplegadas específicas del compartimiento (UPR). El OxSR sirve para aliviar los efectos tóxicos de las especies reactivas de oxígeno (ROS). Cada respuesta de estrés se activa en presencia de desafíos celulares e insultos ambientales e induce una respuesta transcripcional personalizada. Las características distintivas de estas respuestas incluyen la síntesis de moléculas que vuelven a plegar las proteínas mal dobladas (como los chaperones) dirigidas al orgánulo adecuado, o alternativamente, eliminan las proteínas dañadas por degradación de proteínas. Si no se activan estas respuestas de tensión, se acumulan proteínas dañadas, la disfunción celular se propaga a la insuficiencia sistémica de los tejidos y, finalmente, la muerte del organismo. La función y la regulación de las diferentes respuestas de tensión se revisan en otros lugares¹.

Muchos conocimientos sobre la regulación y la actividad de las respuestas al estrés celular se han atribuido al nematodo, Caenorhabditis elegans, un organismo modelo multicelular en la investigación genética. Los nematodos no sólo permiten estudiar la activación de las respuestas de estrés a nivel celular, sino también a nivel de organismo; nematodos se han utilizado para estudiar los efectos de las perturbaciones genéticas o la exposición a fármacos y contaminantes en su crecimiento y supervivencia. Su tiempo de generación rápida, isogenia, transparencia, tractabilidad genética y facilidad de uso durante la experimentación los hacen ideales para tales estudios. Además, la respuesta fisiológica relativamente rápida al estrés (entre horas y unos días) y la conservación evolutiva de las vías celulares hacen de los nematodos una herramienta prominente en el estudio de la resistencia al estrés.

Hay dos cepas de E. coli comúnmente utilizadas como fuente de alimento para cultivar C. elegans: OP50 estándar, una cepa B en la que la mayoría de la experimentación se ha realizado históricamente² y HT115, una cepa K-12 que se utiliza para casi todos los experimentos RNAi^3,4. Es importante tener en cuenta que hay diferencias significativas entre las dietas bacterianas OP50 y HT115. Crecimiento en estas diferentes fuentes bacterianas se ha demostrado para causar grandes diferencias en el perfil metabólico, número de copia de ADN mitocondrial, y varios fenotipos principales, incluyendo la vida útil⁵. Algunas de estas diferencias se atribuyen a la deficiencia de vitamina B12 asociada con el crecimiento de bacterias OP50, que puede resultar en defectos en la homeostasis mitocondrial y mayor sensibilidad a patógenos y tensiones. Todos estos fenotipos han demostrado ser aliviados por el crecimiento de bacterias HT115, que tienen niveles más altos de vitamina B12^6. Por lo tanto, se recomienda que todos los experimentos sobre respuestas de estrés fisiológico se realicen en bacterias HT115, independientemente de la necesidad de condiciones de ARNi. Sin embargo, debido a la facilidad de mantener los animales en OP50, todo el crecimiento estándar (es decir, el mantenimiento y la amplificación de los animales) se puede realizar en OP50, ya que no se detectaron diferencias significativas en los paradigmas experimentales descritos aquí en los gusanos mantenidos en OP50 siempre y cuando se trasladaran a la sincronización posterior HT115 (es decir, desde el post-blanqueamiento de escotillas con o sin detención de L1) hasta la experimentación.

Aquí, se describe la caracterización de la actividad de las respuestas de estrés celular utilizando dos métodos funcionales. Cabe señalar que los protocolos presentados se centran principalmente en las respuestas de estrés celular y su impacto en la homeostasis proteica. En primer lugar, se utilizan reporteros transcripcionales fluorescentes, que están regulados por promotores de genes endógenos que se activan específicamente en respuesta a diferentes tensiones celulares. Estos reporteros transcripcionales fluorescentes se basan en la inducción transcripcional de genes específicos que son nativos parte de la respuesta al estrés. Por ejemplo, HSP-4, una proteína de choque térmico ortolista para el chaperone humano HSPA5/BiP, se activa al er-estrés y localiza a la sala de er para aliviar el estrés. En condiciones de estrés er (por ejemplo, la exposición a la tunicamicina), una proteína fluorescente verde (GFP), colocada bajo la regulación del promotor hsp-4, se sintetiza en niveles elevados, como puede evaluarse mediante microscopía fluorescente o medir cuantitativamente utilizando citometría de flujo de partículas grandes de nematodos^7. Del mismo modo, el promotor de un chaperón mitocondrial, hsp-6 (ortologous a mamífero HSPA9), se utiliza para monitorear la activación de la UPR^MT8,y el promotor de la chaperona citosólica hsp-16.2 (ortopéloga a los genes alfa de cristalino humana) se utiliza para evaluar la actividad del HSR^9. Estos reporteros permiten una rápida caracterización de las vías activadas en respuesta a diversas perturbaciones.

A menudo, los reporteros presentados aquí son fotodos usando microscopía, que proporciona una salida cualitativa de la activación de las respuestas de estrés. Sin embargo, mientras que las técnicas de diagnóstico por imágenes proporcionan información sobre la intensidad y la ubicación de los tejidos de los reporteros descritos anteriormente, su cuantificación no siempre es precisa o robusta. Si bien es posible cuantificar la activación fluorescente utilizando herramientas de análisis de imágenes, estos métodos son relativamente bajos y el tamaño de la muestra es pequeño, debido al número relativamente bajo de animales en la imagen. La facilidad y la capacidad de obtener grandes cantidades de animales rápidamente hacen de C. elegans un sistema de modelo ideal para analizar la activación de los reporteros de estrés fluorescente a través del uso de un gran citómetro de flujo de partículas. Un citómetro de flujo de partículas grandes es capaz de registrar, analizar y clasificar en función del tamaño y la fluorescencia de muchos animales vivos. Usando este método, es posible obtener la intensidad fluorescente, el tamaño y también la información espacial (2D) para miles de gusanos. El sistema se controla mediante FlowPilot, que permite la adquisición y el análisis de datos en tiempo real de los parámetros medidos. Aquí, los métodos para la toma de imágenes microscópicas y el análisis cuantitativo utilizando un citómetro de flujo de partículas grandes se ofrecen como métodos para medir la activación de las respuestas de tensión.

Más allá del análisis del reportero, la sensibilidad o resistencia de los animales al estrés se puede medir mediante ensayos fisiológicos de estrés. Esto se logra mediante la exposición de los animales a ambientes estresantes que activan vías de estrés celular específicos. Aquí, se proporcionan varios métodos para medir la sensibilidad de animales enteros a tipos específicos de factores de estrés.

El estrés ER se aplica a C. elegans utilizando el agente químico, la tunicamicina, que bloquea la glicosilación ligada a N, causando la acumulación de proteínas mal plegadas en el ER¹⁰. En C. elegans, el crecimiento tras la exposición a la tunicamicina da lugar a perturbaciones importantes en la función de ER, y una vida útil significativamente disminuida¹¹. Mediante la medición de la supervivencia de los animales en placas que contienen tunicamicina, se puede cuantificar la sensibilidad al estrés de los animales en ER. Por ejemplo, los animales con inducción ECtópica de^URGENCIA supeditada y, por lo tanto, una mayor resistencia al estrés dedesdoblamiento de proteínas en el ER tienen una mayor supervivencia tras la exposición a la tunicamicina en comparación con los animales de tipo salvaje^12.

El estrés oxidativo y mitocondrial se aplica a C. elegans al exponer animales al agente químico, paraquat. Paraquat es un herbicida de uso común, que causa la formación de superóxido específicamente en las mitocondrias^13. Debido a la localización específica de las especies de oxígeno reactivo derivadas de las mitocondrias (ROS), los ensayos de paraquat se utilizan a menudo como un ensayo de estrés “mitocondrial”. Sin embargo, el superóxido se convierte rápidamente en peróxido de hidrógeno por dismutas de superóxido mitocondrial (SOD)¹⁴. Posteriormente, el peróxido de hidrógeno puede salir de las mitocondrias y causar estrés oxidativo en otros compartimentos de la célula. Por lo tanto, describimos los ensayos de supervivencia de paraquat como la medición de la sensibilidad al estrés mitocondrial y oxidativo (otros ensayos de estrés oxidativo se pueden encontrar¹⁵).

Los ensayos de termotolerancia se realizan en C. elegans colocando animales a temperaturas elevadas. Las temperaturas ambiente de los nematodos son de 15-20 oC y se induce tensión térmica a temperaturas superiores a 25 oC^16,17. Los ensayos de termotolerancia se realizan generalmente a temperaturas que oscilan entre 30-37 oC, ya que los animales presentan defectos celulares importantes a esta temperatura, y los ensayos de supervivencia se completan dentro de las 24 horas^16,,18. Aquí, se proporcionan dos métodos alternativos para la realización de ensayos de termotolerancia: crecimiento a 34 oC y crecimiento a 37 oC. Juntos, los protocolos presentados aquí se pueden utilizar para realizar pantallas a gran escala cuando se combinan con el derribo de genes estándar utilizando interferencia de ARN o bibliotecas de fármacos químicos.

El protocolo se puede dividir en 4 procedimientos generales: crecimiento de C. elegans y preparación para la toma de imágenes (secciones 1 y 2), imágenes de reporteros transcripcionales mediante microscopía fluorescente (secciones 3-5), mediciones cuantitativas de reporteros utilizando un citómetro de flujo de partículas grandes (sección 6), y ensayos fisiológicos para medir la sensibilidad al estrés en C. elegans (sección 7).

Protocol

1. Condiciones de crecimiento estándar de las temperaturas y OP50 vs HT115 Crecimiento y expansión estándar Cultivar un cultivo de OP50 en LB (Tabla 1) o medios equivalentes de elección para 24-48 h a temperatura ambiente (22-25 oC). Crecer bacterias a temperatura ambiente ya que OP50 es un auxotrofi de uracilo y hay una mayor incidencia de revertientes (por ejemplo, mutantes supresores) cuando se cultiva a 37 oC. No se recomienda el almacenamiento a largo plazo de cultivos OP50 (m?…

Representative Results

Uso de reporteros transcripcionales para medir la activación de las respuestas de estrésAquí, se utilizan reporteros transcripcionales fluorescentes, que sirven como herramientas robustas para medir la activación de la mayoría de las respuestas de estrés en C. elegans. La expresión gFP se impulsa bajo el promotor de objetivos canónicos de los reguladores transcripcionales maestros involucrados en la respuesta a las tensiones específicas del compartim…

Discussion

Aquí, se describen métodos para interrogar las respuestas de estrés celular en C. elegans,utilizando reporteros transcripcionales fluorescentes y ensayos fisiológicos de supervivencia por estrés. Todos los reporteros utilizan la expresión GFP impulsada bajo el promotor de un objetivo transcripcional descendente de los factores de transcripción involucrados en el montaje de las respuestas de estrés celular. El uso de hsp-4p::GFP modulado por XBP-1s-mediada UPR^ER, hsp-6p::GFP c…

Materials

Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674	for mitochondrial stress
Bacto Peptone	Fisher Scientific	DF0118072	for NGM plates
BD Difco granulated agar	VWR	90000-782	for NGM plates
Calcium chloride dihydrate	VWR	97061-904	for NGM plates
Carbenicillin	BioPioneer	C0051-25	for RNAi
Cholesterol	Sigma-Aldrich	57-88-5	for NGM plates
COPAS Biosorter	Union Biometrica	350-5000-000	equipped with a 488 nm light source.
COPAS Cleaning Solution	Union Biometrica	300-5072-000	to use with COPAS
COPAS Sheath Solution	Union Biometrica	300-5070-100	to use with COPAS
DMSO	Sigma-Aldrich	472301	solvent for drugs
IPTG dioxane free	Denville Scientific	CI8280-4	for RNAi
LB Broth Miller	Fisher Scientific	BP1426500	for LB
M205FA stereoscope	Leica	10450040	equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software
Magnesium sulfate heptahydrate	VWR	EM-MX0070-3	for NGM plates, M9
Paraquat	Sigma-Aldrich	36541	for oxidative/mitochondrial stress
Potassium Chloride	Fisher	P217-500	for bleach soluton
Potassium phosphate dibasic	VWR	EM-PX1570-2	for NGM plates
Potassium phosphate monobasic	VWR	EM-PX1565-5	for M9
Revolve	ECHO	75990-514	equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	71289-50G	for imaging
Sodium Chloride	EMD Millipore	SX0420-5	for NGM plates, M9
Sodium phosphate dibasic	VWR	71003-472	for M9
Tert-butyl hydroperoxide	Sigma-Aldrich	458139	for oxidative stress
Tetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	T7660-5G	for RNAi
Tunicamycin	Sigma-Aldrich	T7765-50MG	for ER stress