Messung physiologischer Stressreaktionen in C. Elegans

Summary

Hier charakterisieren wir zelluläre proteotoxische Stressreaktionen in der Nematode C. elegans, indem wir die Aktivierung fluoreszierender Transkriptionsreporter messen und die Empfindlichkeit gegenüber physiologischem Stress beobachten.

Abstract

Organismen sind oft schwankenden Umgebungen und Veränderungen der intrazellulären Homöostase ausgesetzt, die sich nachteilig auf ihr Proteom und ihre Physiologie auswirken können. So haben Organismen gezielte und spezifische Stressreaktionen entwickelt, um Schäden zu reparieren und Homöostase aufrechtzuerhalten. Zu diesen Mechanismen gehören die entfaltete Proteinreaktion des endoplasmatischen Retikulums (UPR^ER), die entfaltete Proteinreaktion der Mitochondrien (UPR^MT), die Hitzeschockreaktion (HSR) und die oxidative Stressreaktion (OxSR). Die hier vorgestellten Protokolle beschreiben Methoden zum Nachweis und charakterisieren der Aktivierung dieser Bahnen und ihrer physiologischen Folgen im Nematode, C. elegans. Zunächst wird die Verwendung von signalspezifischen fluoreszierenden Transkriptionsreportern für eine schnelle zelluläre Charakterisierung, ein Arzneimittelscreening oder ein groß angelegtes genetisches Screening (z. B. RNAi oder mutierte Bibliotheken) beschrieben. Darüber hinaus werden ergänzende, robuste physiologische Assays beschrieben, die zur direkten Beurteilung der Empfindlichkeit von Tieren gegenüber bestimmten Stressoren verwendet werden können und als funktionelle Validierung der Transkriptionsreporter dienen. Zusammen ermöglichen diese Methoden eine schnelle Charakterisierung der zellulären und physiologischen Wirkungen interner und externer proteotoxischer Störungen.

Introduction

Die Fähigkeit eines Organismus, auf Veränderungen in der intra- und extrazellulären Umgebung zu reagieren, ist entscheidend für sein Überleben und seine Anpassung. Dies wird auf zellulärer Ebene durch zahlreiche Schutzwege erreicht, die die Integrität der Zelle gewährleisten. Während zahlreiche zelluläre Komponenten stressassoziierten Schäden ausgesetzt sind, ist eine wichtige Beteiligung an zellulären Stressreaktionen die Reparatur und der Schutz der Homöostase des zellulären Proteoms. Die Abschottung von Proteinen in spezielle Strukturen, sogenannte Organellen, stellt jedoch eine Herausforderung für die Zelle dar, da sie sich nicht auf eine zentralisierte Form der Proteinqualitätskontrolle verlassen kann, um sicherzustellen, dass alle Proteine innerhalb der Zelle richtig gefaltet und funktional sind. Um mit Störungen ihrer Proteine umzugehen, haben Organellen daher spezielle Qualitätskontrollmechanismen entwickelt, die falsch gefaltete Proteine erkennen und eine Stressreaktion aktivieren können, um den Stress innerhalb dieses Fachs zu lindern. Beispielsweise setzt das Zytosol auf die Wärmeschockreaktion (HSR), während das endoplasmatische Retikulum (ER) und die Mitochondrien auf ihre kompartidspezifischen entfalteten Proteinreaktionen (UPR) angewiesen sind. Die OxSR dient dazu, die toxischen Wirkungen reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) zu lindern. Jede Stressreaktion wird in Gegenwart von zellulären Herausforderungen und Umweltbeleidigungen ausgelöst und induziert eine maßgeschneiderte Transkriptionsreaktion. Die Kennzeichen dieser Reaktionen sind die Synthese von Molekülen, die falsch gefaltete Proteine (wie Chaperones) auf die richtige Organelle abzielen, oder alternativ beschädigte Proteine durch Proteinabbau entfernen. Wenn diese Stressreaktionen nicht aktiviert werden, entstehen beschädigte Proteine, zelluläre Dysfunktion, die sich zu systemischem Versagen des Gewebes ausbreitet, und schließlich zum Tod des Organismus. Die Funktion und Regulierung der verschiedenen Stressreaktionen wird an anderer Stelle überprüft¹.

Viele Erkenntnisse über die Regulierung und Aktivität von zellulären Stressreaktionen wurden dem Nematoden Caenorhabditis eleganszugeschrieben, einem mehrzelligen Modellorganismus in der Genforschung. Nematoden ermöglichen nicht nur die Untersuchung der Aktivierung von Stressreaktionen auf zellulärer Ebene, sondern auch auf der Ebene des Organismus; Nematoden wurden verwendet, um die Auswirkungen genetischer Störungen oder der Exposition gegenüber Medikamenten und Schadstoffen auf ihr Wachstum und Überleben zu untersuchen. Ihre schnelle Erzeugungszeit, Isogenie, Transparenz, genetische Traktionsfähigkeit und Benutzerfreundlichkeit während des Experimentierens machen sie ideal für solche Studien. Darüber hinaus machen die relativ schnelle physiologische Reaktion auf Stress (zwischen Stunden und ein paar Tagen) und die evolutionäre Erhaltung der zellulären Bahnen Nematoden zu einem herausragenden Werkzeug bei der Untersuchung der Stressresistenz.

Es gibt zwei häufig verwendete E. coli-Stämme, die als Nahrungsquelle für den Anbau von C. elegansverwendet werden: Standard-OP50, ein B-Stamm, bei dem die meisten Experimente historisch durchgeführt wurden² und HT115, ein K-12-Stamm, der für fast alle RNAi-Experimente^3,4verwendet wird. Es ist wichtig zu beachten, dass es erhebliche Unterschiede zwischen OP50 und HT115 bakterielle Diäten. Das Wachstum auf diesen verschiedenen bakteriellen Quellen hat gezeigt, dass große Unterschiede im metabolischen Profil verursachen, mitochondriale DNA-Kopierzahl, und mehrere wichtige Phänotypen, einschließlich Lebensdauer⁵. Einige dieser Unterschiede werden auf Vitamin B12-Mangel im Zusammenhang mit dem Wachstum von OP50-Bakterien zurückgeführt, was zu Defekten bei der mitochondrialen Homöostase und einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber Krankheitserregern und Belastungen führen kann. Alle diese Phänotypen haben gezeigt, dass durch wachstum auf HT115 Bakterien gelindert werden, die höhere Konzentrationen von Vitamin B12⁶haben. Daher wird empfohlen, alle Experimente mit physiologischen Stressreaktionen an HT115-Bakterien durchzuführen, unabhängig von der Notwendigkeit von RNAi-Bedingungen. Aufgrund der einfachen Haltung von Tieren auf OP50 kann jedoch das gesamte Standardwachstum (d. h. Die Erhaltung und Verstärkung von Tieren) auf OP50 durchgeführt werden, da signifikante Unterschiede in den hier beschriebenen experimentellen Paradigmen bei Würmern, die auf OP50 gehalten werden, nicht nachgewiesen wurden, solange sie nach der Synchronisation (d. h. von Derluke nach dem Abbleichung mit oder ohne L1-Ableiter) bis zum Experimentieren auf HT115 verschoben wurden.

Hier wird die Charakterisierung der Aktivität zellulärer Stressreaktionen mit zwei funktionellen Methoden beschrieben. Es sollte beachtet werden, dass die vorgestellten Protokolle in erster Linie auf zelluläre Stressreaktionen und ihre Auswirkungen auf die Proteinhomöostase konzentriert sind. Zunächst werden fluoreszierende Transkriptionsreporter eingesetzt, die durch endogene Genpromotoren reguliert werden, die speziell als Reaktion auf unterschiedliche zelluläre Spannungen aktiviert werden. Diese fluoreszierenden Transkriptionsreporter basieren auf der transkriptionellen Induktion bestimmter Gene, die nativ Teil der Stressreaktion sind. Zum Beispiel wird HSP-4, ein Hitzeschockprotein orthologous zum menschlichen Chaperon HSPA5/BiP, bei ER-Stress aktiviert und lokalisiert sich zum ER, um den Stress zu lindern. Unter Bedingungen von ER-Stress (z. B. Exposition gegenüber Tunicamycin) wird ein grünes fluoreszierendes Protein (GFP), das unter die Regulation des hsp-4-Promotors gestellt wird, in hohen Konzentrationen synthetisiert, wie es durch fluoreszierende Mikroskopie beurteilt oder quantitativ mit der Großpartikeldurchflusszytometrie von Nematoden⁷gemessen werden kann. In ähnlicher Weise wird der Promotor eines mitochondrialen Chaperons, hsp-6 (orthologous to mammalian HSPA9), zur Überwachung der Aktivierung des UPR^MT8verwendet, und der Promotor des zytosolischen Chaperons hsp-16.2 (orthologous zu den menschlichen Kristallin-Alpha-Genen) wird zur Beurteilung der Aktivität des HSR⁹verwendet. Diese Reporter ermöglichen eine schnelle Charakterisierung der Pfade, die als Reaktion auf verschiedene Störungen aktiviert werden.

Oft werden die hier vorgestellten Reporter mit Hilfe der Mikroskopie abgebildet, die eine qualitative Ausgabe der Aktivierung von Stressreaktionen liefert. Während bildgebende Verfahren jedoch sowohl Informationen über die Intensität als auch über die Gewebeposition der oben beschriebenen Reporter liefern, ist ihre Quantifizierung nicht immer genau oder robust. Während es möglich ist, die Fluoreszenzaktivierung mit bildgebenden Analysewerkzeugen zu quantifizieren, sind diese Methoden aufgrund der relativ geringen Anzahl von abgebildeten Tieren relativ geringer Durchsatz und die Stichprobengröße gering. Die Leichtigkeit und Fähigkeit, große Mengen von Tieren zu erhalten, machen C. elegans schnell zu einem idealen Modellsystem, um die Aktivierung von fluoreszierenden Stressreportern durch den Einsatz eines großen Partikelstromzytometers zu überprüfen. Ein großflätiges Durchflusszytometer ist in der Lage, auf der Grundlage von Größe und Fluoreszenz vieler lebender Tiere zu erfassen, zu analysieren und zu sortieren. Mit dieser Methode ist es möglich, die fluoreszierende Intensität, Größe und auch räumliche (2D) Informationen für Tausende von Würmern zu erhalten. Das System wird über FlowPilot gesteuert, was die Datenerfassung und Analyse der gemessenen Parameter in Echtzeit ermöglicht. Hier werden Methoden sowohl für die mikroskopische Bildgebung als auch für die quantitative Analyse mit einem Großpartikel-Durchflusszytometer als Methoden zur Messung der Aktivierung von Spannungsreaktionen angeboten.

Über die Reporteranalyse hinaus kann die Empfindlichkeit oder Widerstandsfähigkeit von Tieren gegenüber Stress mit physiologischen Stresstests gemessen werden. Dies wird erreicht, indem Tiere stressigen Umgebungen aussetzen, die bestimmte zelluläre Stresswege aktivieren. Hier werden verschiedene Methoden zur Messung der Empfindlichkeit ganzer Tiere gegenüber bestimmten Arten von Stressoren angeboten.

ER-Stress wird auf C. elegans angewendet, indem das chemische Mittel Tunikamycin verwendet wird, das die N-verknüpfte Glykosylierung blockiert und eine Ansammlung falsch gefalteter Proteine im ER¹⁰verursacht. In C. elegansführt das Wachstum bei Exposition gegenüber Tunikamycin zu erheblichen Störungen in der ER-Funktion und einer signifikant verringerten Lebensdauer¹¹. Durch messung des Überlebens von Tieren auf Tunikamycin-haltigen Platten kann die ER-Stressempfindlichkeit von Tieren quantifiziert werden. Beispielsweise haben Tiere mit ektopischer UPR-ER-Induktion und damit erhöhter Resistenz gegen Proteinfehlfaltungsstress im ER ein erhöhtes Überleben bei Tunikamycin-Exposition im Vergleich zu Wildtieren¹².^ER

Oxidativer und mitochondrialer Stress wird auf C. elegans angewendet, indem Tiere dem chemischen Mittel Paraquat aussetzt werden. Paraquat ist ein häufig verwendetes Herbizid, das eine Superoxidbildung speziell in der Mitochondrien¹³verursacht. Aufgrund der spezifischen Lokalisierung von mitochondrien abgeleiteten reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) werden Paraquat-Assays oft als “mitochondrialer” Stresstest verwendet. Superoxid wird jedoch durch mitochondriale Superoxiddismutasen (SODs)¹⁴schnell in Wasserstoffperoxid umgewandelt. Wasserstoffperoxid kann anschließend aus den Mitochondrien diffundieren und oxidativen Stress in anderen Zellteilen verursachen. Daher beschreiben wir Paraquat-Überlebens-Assays als Messung der Empfindlichkeit sowohl gegenüber mitochondrialem als auch oxidativem Stress (andere oxidative Stress-Assays finden Sie¹⁵).

Thermoverträglichkeitstests werden in C. elegans durchgeführt, indem Tiere in erhöhte Temperaturen versetzt werden. Die Umgebungstemperaturen für Nematoden liegen bei 15-20 °C und thermische Belastung wird bei Temperaturen über 25 °C^16,17induziert. Thermoverträglichkeitstests werden in der Regel bei Temperaturen von 30-37 °C durchgeführt, da Tiere bei dieser Temperatur große zelluläre Defekte aufweisen und Überlebenstests innerhalb von 24 Stunden^16,18abgeschlossen werden. Hier bei der Durchführung von Thermotoleranz-Assays sind zwei alternative Methoden vorgesehen: Wachstum bei 34 °C und Wachstum bei 37 °C. Zusammen können die hier vorgestellten Protokolle verwendet werden, um groß angelegte Bildschirme durchzuführen, wenn sie mit Standard-Gen-Knock-down mit RNA-Interferenz oder chemischen Medikamentenbibliotheken kombiniert werden.

Das Protokoll kann in 4 allgemeine Verfahren unterteilt werden – Wachstum von C. Eleganen und Vorbereitung für die Bildgebung (Abschnitte 1 und 2), Bildgebung von Transkriptionsreportern mittels fluoreszierender Mikroskopie (Abschnitte 3-5), quantitative Messungen von Reportern mit einem Großpartikel-Flow-Zytometer (Abschnitt 6) und physiologische Naden zur Messung der Stressempfindlichkeit in C. elegans (Abschnitt 7).

Protocol

1. Standard-Wachstumsbedingungen von Temperaturen & OP50 vs HT115 Standardwachstum und Expansion Wachsen Sie eine Kultur von OP50 in LB (Tabelle 1) oder gleichwertige Medien der Wahl für 24-48 h bei Umgebungstemperatur (ca. 22-25 °C). Wachsen Sie Bakterien bei Raumtemperatur, da OP50 ein Uracil-Auxotroph ist und es eine höhere Inzidenz von Revertanten (z. B. Suppressormutanten) gibt, wenn sie bei 37 °C angebaut werden. Eine Langzeitlagerung von OP50-Kulturen wird nicht empfohlen (ma…

Representative Results

Verwenden von Transkriptionsreportern zur Messung der Aktivierung von StressreaktionenHier kommen fluoreszierende Transkriptionsreporter zum Einsatz, die als robuste Werkzeuge dienen, um die Aktivierung der meisten Stressreaktionen in C. eleganszu messen. Die GFP-Expression wird unter dem Träger kanonischer Ziele von Master-Transkriptionsregulatoren angetrieben, die an der Reaktion auf fachspezifische Belastungen beteiligt sind. Eine umfassende Liste der hä…

Discussion

Hier werden Methoden zur Abhörung zellulärer Stressreaktionen in C. elegans,mit fluoreszierenden Transkriptionsreportern und physiologischen Stressüberlebenstests beschrieben. Die Reporter nutzen alle GFP-Expression, die unter dem Promotor eines nachgelagerten Transkriptionsziels der Transkriptionsfaktoren angetrieben wird, die an der Erhöhung zellulärer Stressreaktionen beteiligt sind. Die Verwendung von hsp-4p::GFP moduliert durch XBP-1s-vermittelte UPR^ER, hsp-6p::GFP gesteuer…

Materials

Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674	for mitochondrial stress
Bacto Peptone	Fisher Scientific	DF0118072	for NGM plates
BD Difco granulated agar	VWR	90000-782	for NGM plates
Calcium chloride dihydrate	VWR	97061-904	for NGM plates
Carbenicillin	BioPioneer	C0051-25	for RNAi
Cholesterol	Sigma-Aldrich	57-88-5	for NGM plates
COPAS Biosorter	Union Biometrica	350-5000-000	equipped with a 488 nm light source.
COPAS Cleaning Solution	Union Biometrica	300-5072-000	to use with COPAS
COPAS Sheath Solution	Union Biometrica	300-5070-100	to use with COPAS
DMSO	Sigma-Aldrich	472301	solvent for drugs
IPTG dioxane free	Denville Scientific	CI8280-4	for RNAi
LB Broth Miller	Fisher Scientific	BP1426500	for LB
M205FA stereoscope	Leica	10450040	equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software
Magnesium sulfate heptahydrate	VWR	EM-MX0070-3	for NGM plates, M9
Paraquat	Sigma-Aldrich	36541	for oxidative/mitochondrial stress
Potassium Chloride	Fisher	P217-500	for bleach soluton
Potassium phosphate dibasic	VWR	EM-PX1570-2	for NGM plates
Potassium phosphate monobasic	VWR	EM-PX1565-5	for M9
Revolve	ECHO	75990-514	equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	71289-50G	for imaging
Sodium Chloride	EMD Millipore	SX0420-5	for NGM plates, M9
Sodium phosphate dibasic	VWR	71003-472	for M9
Tert-butyl hydroperoxide	Sigma-Aldrich	458139	for oxidative stress
Tetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	T7660-5G	for RNAi
Tunicamycin	Sigma-Aldrich	T7765-50MG	for ER stress