قياس الاستجابة للمخدرات في الوقت الحقيقي في شرائح أنسجة الورم Organotypic
Summary
نقدم بروتوكوللقياس استجابة المخدرات في الوقت الحقيقي في شرائح أنسجة الورم organotypic. توفر الاستراتيجية التجريبية المبينة هنا منصة لتنفيذ شاشات الأدوية المتوسطة والعالية على شرائح الأنسجة المشتقة من أورام سريرية أو فأرة في ظروف الجسم الحي.
Abstract
تتكون أنسجة الورم من خلايا سرطانية وخلايا مناعية مخترقة وخلايا إنهيليلية وخلايا ليفية ومصفوفة خارج الخلية. هذا الوسط المعقد يشكل البيئة الدقيقة الورم (TME) ويمكن تعديل الاستجابة للعلاج في الجسم الحي أو استجابة المخدرات على سبيل الكفو. يتم تنفيذ شاشات اكتشاف أدوية السرطان التقليدية على الخلايا المستزرعة في طبقة أحادية ، وهو نظام يفتقر بشكل خطير إلى تأثير TME. وبالتالي ، فإن الأنظمة التجريبية التي تدمج المقالات الحساسة وعالية الإنتاجية مع TME الفسيولوجية ستعزز عملية اكتشاف الأدوية قبل السريرية. هنا، نقدم زراعة شريحة أنسجة ورم الجسم الحي كمنصة لفحص المخدرات متوسطة-عالية الإنتاجية. تشكل زراعة شرائح الأنسجة المنقّبة على وجه التحديد أقسام الورم الرقيقة التي يتم الحفاظ عليها بدعم من غشاء مسامي في واجهة السائل والهواء. في هذا البروتوكول، ونحن نصف إعداد وصيانة شرائح الأنسجة المعدة من أورام الفئران والأورام من نماذج xenograft المشتقة من المريض (PDX). لتقييم التغيرات في قابلية الأنسجة للاستمرار استجابة للعلاج من المخدرات، استفدنا من فحص قابلية البقاء القائم على الإضاءة المتوافق بيولوجيًا والذي يتيح قياس الخلايا القابلة للحياة في الأنسجة في الوقت الحقيقي والسريع والحساس. باستخدام هذه المنصة، قمنا بتقييم الاستجابات المعتمدة على الجرعة من شرائح الأنسجة إلى مثبط اتيبيز متعدد الكيناز، staurosporine، وعامل السامة للخلايا، دوكسوروبيسين. علاوة على ذلك ، نبين تطبيق شرائح الأنسجة لعلم الأدوية على سبيل الكفيو عن طريق فحص 17 دواءً سريريًا وما قبل سريري على شرائح الأنسجة المعدة من ورم PDX واحد. لدينا ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، وحساسة للغاية، وقوية منصة فحص الجسم الحي السابق سوف تعزز إلى حد كبير اكتشاف المخدرات الأورام قبل السريرية واتخاذ القرارات العلاجية.
Introduction
تفاعلات الخلايا السرطانية مع الخصائص الفيزيائية والبيوكيميائية للأنسجة سترومال المحيطة تشكل TME. TME يمكن أن تحفز نمو الورم، الانبثاث، وتعدل استجابة الورم للعلاج1. في تطوير الأدوية التقليدية قبل السريرية ، عادة ما يتم فحص المرشحين للأدوية لأول مرة باستخدام خطوط الخلايا السرطانية المثقفة ، وهي منصة فحص تفتقر بشكل حرج إلى TME2. هذا النقص في TME الفسيولوجية في مراحل الفحص المسبق القائمة على الخلايا قد يحد من اكتشاف العوامل الفعالة في النماذج الحيوانية الحاملة للورم وقد يساهم في ارتفاع معدل الاستنزاف للعديد من أدوية الأورام الواعدة في المراحل السريرية اللاحقة من التطور3.
على الرغم من أهمية TME في تعديل استجابات أدوية الورم ، فإن القيود التجريبية تحد من تطبيق أنظمة أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية خلال المراحل المبكرة من اكتشاف المخدرات وتطويرها. من غير العملي فحص مئات العوامل العلاجية على الأورام من النماذج الحيوانية أو عينات أورام المريض. والواقع أن العينات الجراحية هي موارد شحيحة ذات خلفيات وراثية متنوعة، كما أن فحص الآلاف من الجزيئات المرشحة في النماذج الحيوانية غير ممكن بسبب النطاق التجريبي والتكلفة ورعاية الحيوان.
زراعة شرائح الأنسجة السرطانية ، حيث قطع بدقة ، يتم استزراع أقسام الورم الرقيقة على سبيل المثال ، يمكن معالجة الحد من TME الفسيولوجية في فحوصات فحص الدواء. تاريخيا، كان مجال علم الأعصاب رائداً وحقق تحسينات واسعة النطاق لثقافة الشريحة لأنسجة الدماغ4. في الآونة الأخيرة، أظهرت العديد من الدراسات إعداد شرائح من أنواع مختلفة من الأنسجة السرطانية بما في ذلك الأورام المشتقة من خط الخلية، ونماذج الورم العفوية، xenografts المشتقة من المريض (PDX)، وأورام المريض الرئيسي. الثقافة شريحة الأنسجة الأفو السابقين يدمج فوائد من كل من في الجسم الحي والثقافة في المختبر5. تحافظ شرائح الأنسجة السرطانية على بنية الأنسجة السليمة وتكوين الخلايا المتنوعة ، مما يتيح دراسة الخلايا السرطانية في سياق TME.
يقدم هذا البروتوكول نظام زراعة شرائح أنسجة الورم الأورغية مقرونة بشهادة قابلية البقاء الحساسة للغاية في الوقت الحقيقي لتقييم استجابات الأدوية. اختبارات فعالية الدواء على شرائح أنسجة الورم organotypic في بروتوكولات أدخلت سابقا تعتمد على قياس التغيرات في قابلية الخلية من خلال دمج الصبغة الفلورية، الكيمياء المناعية (IHC)، أو MTT ((3- [4- 5-dimethylthiazol-2-yl]-2، 5 ثنائي الفينيل تترازوليوم بروميد) قياس66،7،,8،,9. ومع ذلك، كل هذه الأساليب هي المقالات نقطة النهاية وتعاني من حساسية منخفضة، وقت المعالجة الطويل، تحليلات البيانات المعقدة، نطاق الإشارة الضيقة، والخطأ التجريبي العالي. يعمل كاشف الخلايا الحية المتوافق مع الخلايا المتوافق مع الخلايا المعتمة على تحسين هذه المقالات من خلال توفير نطاق إشارة واسع وقياس فوري (~ 5 دقيقة) دون معالجة مسبقة والحد الأدنى من المعالجة. هذا الكاشف حساس للغاية ويمكن أن يتعايش في وسائط ثقافة الخلية ، مما يسمح بقياس مستمر وزمني لصلاحية الخلية. ينطبق نظام الفحص هذا على فحص الإنتاجية العالية للمرشحين للأدوية على شرائح الأنسجة في تطوير الأدوية قبل السريرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، ونحن نظهر منصة لدراسات فعالية المخدرات الكمية والوقت الحقيقي على شرائح أنسجة الورم organotypic. يوفر نظام زراعة شرائح الأنسجة مزايا متميزة على الطرق المختبرية التقليدية القائمة على الخلايا من خلال التقاط عدم تجانس الخلايا والخصائص الفسيولوجية للبيئة الدقيقة للورم الأصلي. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة / NCI [K22CA201229 ، P30CA015704] ، ومؤسسة سيدني كيميل [جائزة الباحث كيميل] ، جائزة اكتشاف سرطان الرئة (LCD-505536). نود أن نشكر الدكتورألا نالة (جامعة يوتا) لتوفير سرطان الثدي PDX الورم. كما نود أن نشكر العاملين في مركز فريد هاتشينسون لأبحاث السرطان في الطب المقارن على صيانة نموذج PDX وأعضاء مختبر غوجرال على المناقشات المفيدة. يتم دعم N.N.A من قبل زمالة JSPS للبحوث في الخارج ومنحة التدريب متعددة التخصصات من FHCRC. ويدعم A.J.B. من قبل عملية التمثيل الغذائي للكروموسوم ومنحة التدريب على السرطان من FHCRC.
Materials
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
- Klemm, F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer. Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).
- Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
- Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. Failures in Phase III: Causes and Consequences. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neurosciences. 305, 86-98 (2015).
- Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment. Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).
- van der Kuip, H., et al. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6, 86 (2006).
- Nagaraj, A. S., et al. Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. Journal of Visualized Experiments. (141), e58569 (2018).
- Naipal, K. A., et al. Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer. BMC Cancer. 16, 78 (2016).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
- Sivakumar, R., et al. Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery. Oncoimmunology. 8 (12), 1670019 (2019).
- Duellman, S. J., et al. Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Lazaro, C. A., et al. Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes. Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).
- Chadwick, E. J., et al. A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2015).
- Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2017).
