Medición de la respuesta de fármacos en tiempo real en rebanadas de tejido tumoral organotípico
Summary
Introducimos un protocolo para medir la respuesta de fármacos en tiempo real en rebanadas de tejido tumoral orgatípico. La estrategia experimental descrita aquí proporciona una plataforma para llevar a cabo pantallas de fármacos de rendimiento medio-alto en rodajas de tejido derivadas de tumores clínicos o de ratón en condiciones ex vivo.
Abstract
Los tejidos tumorales se componen de células cancerosas, células inmunitarias infiltradas, células endoteliales, fibroblastos y matriz extracelular. Este ambiente complejo constituye el microambiente tumoral (TME) y puede modular la respuesta al tratamiento in vivo o respuesta farmacológica ex vivo. Las pantallas convencionales de descubrimiento de fármacos contra el cáncer se llevan a cabo en células cultivadas en una monocapa, un sistema que carece críticamente de la influencia de la TME. Por lo tanto, los sistemas experimentales que integran ensayos sensibles y de alto rendimiento con TME fisiológico fortalecerán el proceso de descubrimiento de fármacos preclínicos. Aquí, introducimos el cultivo de rebanadas de tejido tumoral ex vivo como una plataforma para la detección de fármacos de alto rendimiento medio-alto. El cultivo de rebanadas de tejido organotípico constituye secciones tumorales delgadas y cortadas con precisión que se mantienen con el apoyo de una membrana porosa en una interfaz líquido-aire. En este protocolo, describimos la preparación y el mantenimiento de rebanadas de tejido preparadas a partir de tumores de ratón y tumores a partir de modelos de xenoinjerto sorinjertos derivados del paciente (PDX). Para evaluar los cambios en la viabilidad de los tejidos en respuesta al tratamiento farmacológico, aprovechamos un ensayo biocompatible basado en la luminiscencia que permite la medición en tiempo real, rápida y sensible de células viables en el tejido. Usando esta plataforma, evaluamos las respuestas dependientes de la dosis de las rodajas de tejido al inhibidor de la multiquinasa, la estaurosporina y el agente citotóxico, la doxorubicina. Además, demostramos la aplicación de rodajas de tejido para farmacología ex vivo mediante la detección de 17 fármacos clínicos y preclínicos en rodajas de tejido preparadas a partir de un único tumor PDX. Nuestra plataforma de cribado ex vivo, fisiológicamente relevante, altamente sensible y robusta, fortalecerá en gran medida el descubrimiento de fármacos oncológicos preclínicos y la toma de decisiones sobre el tratamiento.
Introduction
Las interacciones de las células cancerosas con las propiedades físicas y bioquímicas del tejido estromal circundante forman el TME. TME puede estimular el crecimiento del tumor, metástasis, y modular la respuesta tumoral a la terapia1. En el desarrollo de fármacos preclínicos convencionales, los candidatos a medicamentos suelen ser examinados por primera vez utilizando líneas celulares de cáncer cultivadas, una plataforma de ensayo que carece críticamente del TME2. Esta falta de TME fisiológico en las etapas de preselección basadas en células puede limitar el descubrimiento de agentes eficaces en modelos animales portadores de tumores y puede contribuir a la alta tasa de desgaste de muchos fármacos oncológicos prometedores en etapas clínicas posteriores del desarrollo3.
A pesar de la importancia de la TME en la modulación de las respuestas a los fármacos tumorales, las limitaciones experimentales limitan la aplicación de sistemas más relevantes desde el punto de vista fisiológico durante las primeras etapas del descubrimiento y desarrollo de fármacos. No es práctico examinar cientos de agentes terapéuticos en tumores de modelos animales o muestras de tumores de pacientes. De hecho, los especímenes quirúrgicos son recursos escasos con orígenes genéticos variados y el cribado de miles de moléculas candidatas en modelos animales no es factible debido a la escala experimental, el costo y el bienestar animal.
El cultivo de rebanadas de tejido tumoral, donde se cultivan con precisión secciones de tumores delgados ex vivo, puede abordar la limitación de la TME fisiológica en los ensayos de detección de drogas. Históricamente, el campo de la neurociencia fue pionero e hizo extensas optimizaciones del cultivo de rebanadas para el tejido cerebral4. Recientemente, muchos estudios han demostrado la preparación de rodajas de varios tipos de tejido tumoral, incluyendo tumores derivados de líneas celulares, modelos tumorales espontáneos, xenoinjertos derivados del paciente (PDX) y tumores primarios de pacientes. El cultivo de rebanadas de tejido ex vivo integra beneficios tanto del cultivo in vivo como del in vitro5. Las rebanadas de tejido tumoral conservan la arquitectura intacta del tejido y la composición celular variable, lo que permite el estudio de las células cancerosas dentro del contexto TME.
Este protocolo introduce un sistema de cultivo de rebanadas de tejido tumoral organotípico combinado con un ensayo de viabilidad altamente sensible en tiempo real para evaluar las respuestas de los medicamentos. Las pruebas de eficacia de fármacos en rodajas de tejido tumoral organotípico en protocolos introducidos anteriormente se basan en la medición de los cambios en la viabilidad celular mediante la incorporación de tintes fluorescentes, inmunohistoquímica (IHC), o MTT ((3- [4, 5-dimetiltiazol-2-yl]-2, 5 bromuro de tetrazolio difenil) ensayo6,7,8,9. Sin embargo, todos estos métodos son ensayos de punto final y sufren de baja sensibilidad, largo tiempo de procesamiento, análisis de datos complejos, rango de señal estrecho y alto error experimental. Nuestro reactivo compatible con células vivas basado en luminiscencia mejora estos ensayos al proporcionar un amplio rango de señal y una medición instantánea (5 min) sin procesamiento previo y postprocesamiento mínimo. Este reactivo es altamente sensible y puede coexistir en los medios de cultivo celular, permitiendo la medición continua y de tiempo de viabilidad celular. Este sistema de ensayo es aplicable a la detección de alto rendimiento de los candidatos a fármacos en rebanadas de tejido en el desarrollo de fármacos preclínicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, demostramos una plataforma para estudios cuantitativos y en tiempo real de eficacia de fármacos en rodajas de tejido tumoral organotípico. El sistema de cultivo de rebanadas de tejido proporciona ventajas distintas sobre los métodos in vitro tradicionales basados en células mediante la captura de la heterogeneidad celular y las características fisiológicas del microambiente tumoral nativo. Esta plataforma también permite un mayor rendimiento para las pruebas de eficacia de fármacos, ayudando a …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704] y Sidney Kimmel Foundation [Kimmel Scholar Award], Lung Cancer Discovery Award (LCD-505536). Nos gustaría agradecer a la Dra. Alana Welm (Universidad de Utah) por proporcionar el tumor PDX de cáncer de mama. También nos gustaría agradecer al personal de Medicina Comparada, Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) por el mantenimiento del modelo PDX y a los miembros del laboratorio Gujral por sus útiles discusiones. N.N.A cuenta con el apoyo de la Beca de Investigación en el Extranjero JSPS y la Beca de Capacitación Interdisciplinaria de FHCRC. A.J.B. es apoyado por la Beca de Metabolismo De cromosomas y Entrenamiento del Cáncer de FHCRC.
Materials
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
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