오르가노티픽 종양 조직 슬라이스에서 실시간 약물 반응 측정
Summary
우리는 organotypic 종양 조직 조각에 있는 실시간 약 반응을 측정하기 위한 프로토콜을 소개합니다. 여기에 설명된 실험 전략은 생체 내 조건에서 임상 또는 마우스 종양에서 유래한 조직 조각에 중고 처리량 약물 스크린을 수행하는 플랫폼을 제공한다.
Abstract
종양 조직은 암 세포, 침투 된 면역 세포, 내피 세포, 섬유 아세포 및 세포 외 매트릭스로 구성됩니다. 이러한 복잡한 밀리외는 종양 미세환경(TME)을 구성하고 생체내 또는 약물 반응 ex vivo에서 치료에 대한 반응을 조절할 수 있다. 종래의 암 약물 발견 스크린은 단층에서 배양된 세포에서 수행되며, TME의 영향이 비판적으로 결여된 시스템이다. 따라서 민감하고 처리량이 높은 실험을 생리적 TME와 통합하는 실험 시스템은 전임상 약물 발견 과정을 강화할 것이다. 여기서, 우리는 중간 높은 처리량 약물 스크리닝을 위한 플랫폼으로서 생체내 종양 조직 슬라이스 배양을 소개한다. Organotypic 조직 슬라이스 배양은 액체 공기 계면에서 다공성 멤브레인의 지지로 유지되는 정밀하게 절단된 얇은 종양 섹션을 구성합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 환자 유래 이종이식(PDX) 모델로부터 마우스 종양 및 종양으로부터 제조된 조직 조각의 제조 및 유지를 설명한다. 약물 치료에 반응하여 조직 생존 력의 변화를 평가하기 위해, 우리는 조직에서 생존 가능한 세포의 실시간, 신속하고 민감한 측정을 가능하게 하는 생체 적합성 발광 기반 생존 성 분석기를 활용했습니다. 이 플랫폼을 사용하여, 우리는 다중 키나아제 억제제, staurosporine 및 세포 독성 에이전트, 독소 루비신에 조직 조각의 복용량 의존적 반응을 평가했습니다. 또한, 단일 PDX 종양으로부터 제조된 조직 슬라이스상에서 17개의 임상 및 전임상 약물을 스크리닝하여 생체내 약리학에 대한 조직 슬라이스의 적용을 입증한다. 우리의 생리학적 관련성, 매우 민감하고 강력한 생체 내 스크리닝 플랫폼은 전임상 종양학 약물 발견 및 치료 의사 결정을 크게 강화할 것입니다.
Introduction
암 세포와 주변 기질 조직의 물리적 및 생화학적 특성과의 상호 작용은 TME를 형성한다. TME는 종양 성장을 자극할 수 있고, 전이, 및 치료에 종양 반응을 조절할 수있습니다 1. 종래의 전임상 약물 개발에서, 약물 후보는 전형적으로 배양된 암 세포주를 사용하여 먼저 스크리밍되며, TME2가비판적으로 결여된 분석 플랫폼이다. 이러한 세포 기반 사전 스크리닝 단계에서생리학적 TME의 부족은 종양을 지탱하는 동물 모델에서 효과적인 제제의 발견을 제한할 수 있으며, 개발3의후기 임상 단계에서 많은 유망한 종양학 약물의 높은 감소율에 기여할 수 있다.
종양 약물 반응을 조절하는 TME의 중요성에도 불구하고, 실험적 제약은 약물 발견 및 개발의 초기 단계에서 보다 생리적으로 관련된 시스템의 적용을 제한합니다. 동물 모형 또는 참을성 있는 종양 견본에서 종양에 치료에이전트의 수백을 가리기 위하여 비실용적입니다. 실제로, 외과 표본은 다양한 유전적 배경을 가진 부족한 자원이며 동물 모델에서 수천 개의 후보 분자를 선별하는 것은 실험적 규모, 비용 및 동물 복지로 인해 실현 가능하지 않습니다.
종양 조직 슬라이스 배양은, 정밀하게 절단된, 얇은 종양 절편이 생체내에서 배양되는 경우, 약물 스크리닝 어세이에서 생리적 TME의 한계를 해결할 수 있다. 역사적으로, 신경 과학의 분야는 개척하고 뇌 조직에 대한 슬라이스 문화의 광범위한 최적화를 했다4. 최근, 많은 연구는 세포주 유래 종양, 자발적 종양 모델, 환자 유래 이종이식 (PDX) 및 1 차적인 참을성 있는 종양을 포함하여 종양 조직의 각종 모형에서 조각의 준비를 설명했습니다. Ex vivo 조직 슬라이스 배양은 생체 내 및 체외 배양 모두에서 혜택을통합5. 종양 조직 조각은 손상되지 않은 조직 구조 및 변종 된 세포 조성을 유지하여 TME 컨텍스트 내에서 암세포의 연구를 가능하게합니다.
이 프로토콜은 약물 반응을 평가하기 위해 실시간, 매우 민감한 생존 가능성 분석과 결합된 orgnotnotypic 종양 조직 슬라이스 배양 시스템을 소개합니다. 이전에 도입된 프로토콜에서 orgnotnotypic 종양 조직 조각에 대한 약물 효능 시험은 형광 염료 혼입, 면역 조직 화학 (IHC) 또는 MTT ((3- [4, 5-디메틸티아졸-2-yl]-2, 5 디페닐 테트라졸륨,브로마이드) 분석6,,7,8, 8에의한 세포 생존력의 변화를 측정하는 데 의존합니다.89 그러나 이러한 모든 방법은 종점 분석이며 낮은 감도, 긴 처리 시간, 복잡한 데이터 분석, 좁은 신호 범위 및 높은 실험 오차로 고통받고 있습니다. 당사의 발광 기반 라이브 셀 호환 시약은 사전 처리 및 최소한의 사후 처리 없이 광범위한 신호 범위와 순간(~5분) 측정을 제공하여 이러한 공술을 개선합니다. 이 시약은 매우 민감하고 세포 배양 배지에 공존할 수 있어 세포 생존가능성을 지속적으로 그리고 시간 과정으로 측정할 수 있습니다. 이 분석 시스템은 전임상 약물 개발에서 조직 슬라이스에 대한 약물 후보의 높은 처리량 스크리닝에 적용가능하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서, 우리는 organotypic 종양 조직 조각에 정량적, 실시간 약물 효능 연구를위한 플랫폼을 보여줍니다. 조직 슬라이스 배양 시스템은 네이티브 종양 미세 환경의 세포 이질성 및 생리학적 특성을 포착함으로써 기존의 세포 기반 체외 방식에 비해 뚜렷한 이점을 제공한다. 이 플랫폼은 또한 약물 효능 테스트를 위한 더 높은 처리량을 가능하게 하여 세포 배양 연구와 생체 내 실험 사이의…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704], 시드니 킴멜 재단 [킴멜 학자 상], 폐암 발견 상 (LCD-505536)에 의해 지원되었다. 우리는 유방암 PDX 종양을 제공해 준 Alana Welm 박사(유타 대학교)에게 감사드립니다. 우리는 또한 PDX 모형의 정비를 위한 비교 의학, 프레드 허친슨 암 연구 센터 (FHCRC)에 있는 직원 및 유용한 토론을 위한 Gujral 실험실의 일원에게 감사하고 싶습니다. N.N.A는 FHCRC의 JSPS 해외 연구 펠로우십 및 학제 간 교육 교부금의 지원을 받고 있습니다. A.J.B.는 FHCRC의 염색체 대사 및 암 훈련 교부금에 의해 지원됩니다.
Materials
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
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