מדידת תגובת התרופה בזמן אמת בפרוסות רקמה אורגנוטימית לגידול
Summary
אנו מציגים פרוטוקול למדידת תגובת סמים בזמן אמת בפרוסות רקמת הגידול organotypic. האסטרטגיה הניסיונית המתוארים כאן מספקת פלטפורמה לביצוע מסכי סמים בינוניים בעלי תפוקה גבוהה על פרוסות רקמה הנגזרות מגידולים קליניים או של העכבר בתנאים vivo לשעבר.
Abstract
רקמות הגידול מורכבות של תאים סרטניים, לחדור תאים חיסוניים, תאי האנדותל, פיברוהפיצוצים, ומטריקס מסחטות. הסביבה המורכבת הזאת מהווה את מיקרואקולוגיה של הגידול (TME) והיא יכולה לווסת את התגובה לטיפול בvivo או בתגובה לסם vivo לשעבר. מסכי גילוי סמים קונבנציונליים של הסרטן מתבצעים על תאים שאינם מתורבתים במונאולייר, מערכת שחסרה באופן ביקורתי בהשפעת TME. לפיכך, מערכות נסיוניות המשלבות רגישות ותפוקה גבוהה מספר עם TME פיסיולוגי יחזק את תהליך גילוי התרופות הקדם-קליני. כאן, אנו מציגים לשעבר vivo רקמות הגידול לחתוך את התרבות כפלטפורמה בינונית-high-תפוקה ההקרנה התרופה. התרבות הפרוסה של רקמות הרקמה האורגנותית מהווה חיתוך מדויק של מקטעי גידול דקים הנשמרים בתמיכת קרום נקבובי בממשק באוויר הנוזלי. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את ההכנה והתחזוקה של פרוסות רקמה המוכנים מגידולים בעכבר וגידולים מדגמי מבע מטופל (pdx). כדי להעריך את השינויים בכדאיות של רקמות בתגובה לטיפול בסמים, אנו ממונפת את היכולת הביונסעית המבוססת על ביונציה המאפשרת מדידה בזמן אמת, מהירה ורגישה של תאים מתאימים ברקמה. באמצעות פלטפורמה זו, הערכנו הערכת תגובות תלויי-מינון של פרוסות רקמה לחומר מעכבי רב-קינאז, סטרוספורטין, וסוכן ציטוטוקסי, דוקסורוביצין. יתר על כן, אנו להדגים את היישום של פרוסות רקמה עבור לשעבר vivo פרמקולוגיה על ידי הקרנת 17 תרופות קליני וטרום קליני על פרוסות רקמה מוכן גידול PDX יחיד. שלנו מבחינה פיזיולוגית, רלבנטי, רגיש מאוד, ועמיד לשעבר vivo ההקרנה פלטפורמת הקרנה יהיה מאוד לחזק את גילוי תרופות מאונקולוגיה טרום קלינית הטיפול בקבלת החלטות.
Introduction
תאי המגע הסרטניים עם התכונות הפיזיות והביוכימי של רקמת הסטרומה המקיפים את המבנה מהווה את ה-TME. TME יכול לעורר צמיחה הגידול, גרורות, ולווסת את תגובת הגידול לטיפול1. ב התפתחות התרופה המקובלת טרום קלינית, מועמדים לסמים הם בדרך כלל הוקרן לראשונה באמצעות שורות מתרבות התאים הסרטניים, פלטפורמת שיטת הפעולה באופן ביקורתי חסר TME2. חוסר זה של TME פיסיולוגי בשלבים מבוססי-מראש תא עשוי להגביל את הגילוי של סוכנים יעילים במודלים בעלי חיים הנושאת גידול והוא עשוי לתרום שיעור התשה גבוהה של תרופות אונקולוגית מבטיח רבים בשלבים קליניים מאוחר יותר של פיתוח3.
למרות החשיבות של TME בתגובות התרופה הגידול מודייגצוב, אילוצים ניסיוניים להגביל את היישום של מערכות רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית בשלבים המוקדמים של גילוי סמים ופיתוח. זה לא מעשי להקרין מאות סוכנים טיפוליים על גידולים מדגמי בעלי חיים או דגימות הסרטן החולה. ואכן, דגימות כירורגי הן משאבים נדירים עם רקע גנטי מגוון והקרנת אלפי מולקולות של מועמדים במודלים של בעלי חיים אינה אפשרית בשל היקף ניסיוני, עלות, ורווחה בעלי חיים.
רקמת הגידול התרבות פרוסה, שם לחתוך בדיוק, מקטעים הגידול דק הם מvivo לשעבר תרבותי, יכול להתמודד עם המגבלה של TME פיסיולוגיים בסינון תרופות assays. מבחינה היסטורית, התחום של מדעי המוח החלוץ ועשה מיטוב נרחב של תרבות הפרוסה עבור רקמת המוח4. לאחרונה, מחקרים רבים הפגינו הכנה של פרוסות מסוגים שונים של רקמת הגידול כולל שורה של תאים הנגזרים, מודלים הגידול ספונטנית, החולה נגזר xenografts (PDX), וגידולים החולה העיקרי. תרבות הפרוסה vivo Ex משלבת הטבות הן בvivo והן בתרבות החוץ-גופית5. פרוסות רקמת הגידול לשמור על ארכיטקטורת רקמה שלמה והרכב התא מזנים, המאפשר לימוד של תאים סרטניים בתוך ההקשר TME.
פרוטוקול זה מציג מערכת הגידול organotypic רקמות הגידולים בשילוב עם שיטת הכדאיות בזמן אמת, רגיש מאוד להערכת תגובות הסמים. בדיקות יעילות התרופה על פרוסות רקמת הגידול אורגאוטיפקס בפרוטוקולים שהוצגו בעבר להסתמך על מדידת שינויים הכדאיות התא על ידי התאגדות צבען פלורסנט, אימונוהיסטוכימיה (ihc), או mtt (3-[4, 5-diמתילטיק-2-yl]-2, 5 דיפנקסילטטרזויום ברומיד) שיטת6,7,8,9. עם זאת, כל השיטות הללו מסתיימות בנקודת הסיום וסובלות מרגישות נמוכה, זמן עיבוד ארוך, ניתוח נתונים מורכב, טווח אותות צר ושגיאה ניסויית גבוהה. שלנו מבוסס האור המבוססת על תאים לחיות בקנה מידה משפר את בחני אלה על ידי מתן טווח אותות רחב (~ 5 דקות) מדידה ללא עיבוד קודם ועיבוד מינימלי post. מגיב זה הוא רגיש מאוד ויכול להתקיים יחד במדיה של תרבות התא, המאפשר מדידה רציפה וזמן מסלול של הכדאיות התא. מערכת שיטה זו ישימה להקרנה בתפוקה גבוהה של מועמדים לסמים על פרוסות רקמה בהתפתחות תרופות טרום-קלינית.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו מדגימים פלטפורמה עבור כמותית, ובזמן אמת מחקרים על יעילות הסמים על פרוסות רקמות הגידול אורגאוטימית. מערכת התרבות פרוסה הרקמה מספק יתרונות ברורים על פני התא המסורתי מבוסס בשיטות מבחנה על ידי לכידת תא טרוגניות ואת המאפיינים הפיזיולוגיים של הסביבה מיקרו הגידול הטבעי. פלטפו?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704], והקרן סידני קימל [פרס המלומד קימל], פרס גילוי סרטן הריאות (LCD-505536). אנחנו רוצים להודות ד ר. אלנה Welm (אוניברסיטת יוטה) למתן סרטן השד PDX גידול. כמו כן, אנו רוצים להודות לצוות ברפואה השוואתית, פרד האצ לחקר הסרטן (מרכז המחקר) לתחזוקת מודל PDX וחברי מעבדת Gujral לדיונים מועילים. N. N. A נתמך על ידי מלגת מחקר בחו ל של JSPS ומענק הדרכה בין-תחומי מ-מע. A.J.B. נתמכת על ידי המענק של כרומוזום מטבוליזם וסרטן הדרכה מ-מע.
Materials
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
- Klemm, F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer. Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).
- Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
- Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. Failures in Phase III: Causes and Consequences. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neurosciences. 305, 86-98 (2015).
- Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment. Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).
- van der Kuip, H., et al. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6, 86 (2006).
- Nagaraj, A. S., et al. Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. Journal of Visualized Experiments. (141), e58569 (2018).
- Naipal, K. A., et al. Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer. BMC Cancer. 16, 78 (2016).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
- Sivakumar, R., et al. Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery. Oncoimmunology. 8 (12), 1670019 (2019).
- Duellman, S. J., et al. Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Lazaro, C. A., et al. Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes. Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).
- Chadwick, E. J., et al. A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2015).
- Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2017).
