تؤدي الشاشة الجينية الأمامية المستندة إلى ارتفاع Ca2+ كمطالعة إلى تحديد المكونات الوراثية المشاركة في مسارات الإشارة المعتمدة على الكالسيوم في النباتات.
وكانت الشاشات الجينية الأمامية أدوات هامة في تحديد المكونات الجينية التي تنطوي عليها عدة مسارات بيولوجية غير متحيزة. أساس الشاشة هو توليد السكان المتحولين التي يمكن فحصها مع النمط الظاهري من الفائدة. EMS (سلفونات الميثان الإيثيلي) هو عامل الألكيلات الشائع الاستخدام لتحفيز الطفرة العشوائية في شاشة جينية أمامية كلاسيكية لتحديد جينات متعددة تشارك في أي عملية معينة. السيتوسوليك الكالسيوم (كاليفورنيا2+) ارتفاع هو مفتاح في وقت مبكر من مسار الإشارات التي يتم تنشيطها على الإدراك الإجهاد. ومع ذلك، فإن هوية المستقبلات والقنوات والمضخات وناقلات كاليفورنيا2+ لا تزال بعيدة المنال في العديد من أنظمة الدراسة. Aequorin هو بروتين مراسل الكالسيوم الخلوي المعزول من Aequorea فيكتوريا وsquly أعرب في arabidopsis. استغلال هذا، قمنا بتصميم شاشة الجينية إلى الأمام التي نحن EMS-mutagenized aequorin المعدلة وراثيا. جمعت البذور من النباتات متحولة ([م1و1و1′) وفرز لل نوع ظاهريّة الفائدة كان نفذت في الفصل ([م2و2و2و2].” باستخدام بروتوكول قياس 96-77777777776-77766676-77766666766-7006، يمكن التعرف على العديد من المسوخ الجديدة التي لها استجابة مختلفة من الكالسيوم ويتم قياسها في الوقت الحقيقي.2+ يتم إنقاذ المسوخ مع النمط الظاهري من الفائدة ونشرها حتى يتم الحصول على سكان النباتات متحولة homozygous. يوفر هذا البروتوكول طريقة للشاشات الجينية الأمامية في Ca2+ خلفية مراسل وتحديد أهداف رواية Ca2+ المنظمة.
وهناك تغيير في الكالسيوم السيتوسوليك (كاليفورنيا2 +) تركيز على إدراك من التحفيز الحيوي أو اللاأحيائي هو جيد درس مبكر إشارة الحدث الذي ينشط العديد من مسارات الإشارات1,2,3,4. وهناك خلية في حالته الراحة القاعدية يحافظ على أقل Ca2 + التركيز في السيتوسول وعزلات الزائد Ca2 + في مختلف العضيات داخل الخلايا وapoplast خارج الخلية مما يؤدي إلى حاد كاليفورنيا2 + التدرج5,6. عند إدراك الإشارة ، ترتفع مستويات Ca2+ في السيتوسول بسبب تدفق Ca2 + من مصادر خارج الخلية و / أو داخل الخلايا وتولد توقيع الكالسيوم محدد من المحفزات7،8،9. Ca2+ يتم تنشيط الارتفاعات في السيتوسول من قبل العديد من المحفزات، ولكن يتم الحفاظ على خصوصية من قبل مخازن متميزة الافراج عن كاليفورنيا2+، فريدة من نوعها كاليفورنيا2 + توقيع وبروتينات الاستشعار المناسبة10،11.
إن استخدام عامل الألكيلات، سلفونات الإيثيل-الميثان (EMS) في الطفرات الجينية هو أداة قوية في الشاشات الجينية الأمامية الكلاسيكية لتحديد الجينات المستقلة المتعددة المشاركة في العملية. EMS هو مطفرة كيميائية في الغالب تحفيز C إلى T و G إلى A التحولات بشكل عشوائي في جميع أنحاء الجينوم وتنتج 1 BP تغيير في كل 125 كيلوبايت من الجينوم. سوف EMS الطفرات تحفز التغييراتدلفين 1000 قاعدة واحدة، إما الإدراج / الحذف (InDel) أو متعددة الأشكال النوكليوتيد واحد (SNP) لكل الجينوم12. الطفرات الناجمة عن EMS هي طفرات متعددة نقطة مع تردد طفرة تتراوح بين 1/300 إلى 1/30000 لكل مكان. وهذا يقلل من عدد النباتات M1 اللازمة للعثور على طفرة في جين معين. ويستخدم عادة مجموعة من السكان البذور M1 من 2000-3000 للحصول على طفرات من الاهتمام في Arabidopsis ثالينا13,14.
Aequorin هي aequorin transgenics arabidopsis Columbia-0 (Col-0) النباتات ecotype التي تعبر عن p35S-apoaequorin (pMAQ2) في cytosol15. أيكورين هو بروتين Ca2+ ملزم يتكون من أبوبروتين ومجموعة اصطناعية تتكون من جزيء لوسيفيرين، coelenterazine. إن ربط Ca2+ إلى aequorin ، الذي يحتوي على ثلاثة مواقع CA2 + ملزمة EF-hands ، يؤدي إلى coelenterazine يتم أكسدةه وcyclized لإعطاء dioxetanone الوسيط ، يليه تغيير في التشكل من البروتين مصحوبًا بإطلاق ثاني أكسيد الكربون وكويليناراميد وحيد متحمس16. coelenteramide حتى تنتج تنبعث منها الضوء الأزرق (λماكس، 470 نانومتر) التي يمكن الكشف عنها من قبل17luminometer. وهكذا يمكن قياس الارتفاعات Ca2+ السريعة للغاية في الوقت الفعلي، واستغلالها للشاشات الجينية السريعة إلى الأمام. يهدف هذا البروتوكول إلى استخدام خصوصية استجابة الكالسيوم لتحديد اللاعبين الرئيسيين رواية التي تشارك في التوقيع Ca2+ . لتحقيق هذه المهمة، ونحن نستخدم EMS mutagenesis في aequorin المعدلة وراثيا وتحديد SNPs المرتبطة تغيير Ca2+ الإشارات. يحدد البروتوكول المسوخ التي لا تظهر أي ارتفاعات Ca2+ أو تخفضها عند إضافة المحفزات. ويمكن بعد ذلك تعيين هذه المسوخ لتحديد الجينات المسؤولة عن استجابة Ca2+ . الطريقة قابلة للتطبيق على أي نوع من المحفزات السائلة في النباتات التي تؤدي إلى ارتفاع كاليفورنيا2+ . منذ كاليفورنيا2 + الارتفاع هي واحدة من الاستجابات الأولى في مسار إشارة الدفاع النباتية، وتحديد مكونات استجابة المنبع يمكن أن توفر المرشحين للهندسة الوراثية لتطوير النباتات مرنة.
إن الطفرات التي تُنتج في نظام الإدارة البيئية هي أداة قوية لتوليد الطفرات في عدد السكان. كانت الشاشات الجينية الأمامية الكلاسيكية باستخدام نظام الإدارة البيئية أداة فعالة لتحديد الجينات الجديدة لسببين رئيسيين: أولاً، أنها لا تتطلب أي افتراضات مسبقة حول هوية الجينات، وثانياً، أنها لا تق?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر المعهد الوطني لبحوث الجينوم النباتي – مرفق Phytotron لنمو النبات ، وبومباي المحلية لتصوير الفيديو ، وإدارة التكنولوجيا الحيوية – eLibrary كونسورتيوم لتوفير الوصول إلى الموارد الإلكترونية. وقد دعم هذا العمل من قبل وزارة التكنولوجيا الحيوية، الهند من خلال المعهد الوطني لبحوث الجينوم النباتي منحة الأساسية، ماكس بلانك Gesellschaft الهند شريك برنامج المجموعة; و CSIR-جونيور زمالة البحث (لD.M و S.M) وقسم التكنولوجيا الحيوية – زمالة البحوث المبتدئين (إلى R.P).
24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
Aequorin | |||
Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |