Вперед генетический экран Использование трансгенных кальций репортер Aequorin для выявления новых целей в кальций сигнализации
Summary
Передний генетический экран, основанный на высоте Ca2 “ в качестве считывания, приводит к выявлению генетических компонентов, участвующих в зависимых от кальция сигнальных путей в растениях.
Abstract
Передние генетические экраны были важными инструментами в объективной идентификации генетических компонентов, участвующих в нескольких биологических путей. Основой экрана является создание популяции мутантов, которые могут быть проверены с фенотипом интереса. EMS (сульфонат этилового метана) является широко используемым алкилатированием для индуцирования случайных мутаций в классическом переднем генетическом экране для выявления нескольких генов, участвующих в том или ином процессе. Цитосорический кальций (Ca2″)высота является ключевым ранним сигнальным путем, который активируется при восприятии стресса. Однако личность рецепторов, каналов, насосов и транспортеров Ca2 “по-прежнему неуловимы во многих системах исследования. Aequorin является клеточным кальция репортер белка изолированы от Aequorea Виктория и стабильно выражается в Arabidopsis. Используя это, мы разработали передний генетический экран, в котором мы EMS-мутагенизированные трансгенные аекворин. Семена из растений-мутантов были собраны (M1) и скрининг на фенотип интереса был проведен в сегрегации (M2) населения. Используя 96-хорошо высокопроизводительный протокол измерения Ca2, можно определить несколько новых мутантов, которые имеют различную реакцию кальция и измеряются в режиме реального времени. Мутанты с фенотипом интереса спасаются и распространяются до получения гомозиготной популяции растений-мутантов. Этот протокол обеспечивает метод для передних генетических экранов в Ca2 “репортер фон и определить роман Ca2 ” регулируемых целей.
Introduction
Изменение в цитозолических кальция (Ca2 “)концентрация на восприятие биотического или абиотического стимула является хорошо изучены раннего сигнализации событие, которое активирует многие сигнальные пути1,2,3,4. Клетка в его базальном состоянии отдыха поддерживает более низкую концентрацию Ca2 “в цитозоле и секвестраторов избыток Ca2 “ в различных внутриклеточных органелл и внеклеточной апопласт, ведущих к крутой Ca2 “градиент5,6. При восприятии сигнала, Ca2 “уровни поднимаются в цитозоле из-за притока Ca2 “ из внеклеточных и / или внутриклеточных источников и генерировать стимулы конкретных подписи кальция7,8,9. Ca2 “высоты в цитосол активируются многими стимулами, но специфика поддерживается различных магазинов, выпускающих Ca2 “,уникальный Ca2 “ подпись и соответствующие белки датчика10,11.
Использование алкилатового агента, этил-метанового сульфоната (ЭМС) для мутагенеза является мощным инструментом в классических передних генетических экранах для выявления нескольких независимых генов, участвующих в процессе. EMS является химическим мутагеном, преимущественно вызывающим C к T и G к переходу случайным образом по всему геному и производит 1 bp изменение в каждых 125 кб генома. EMS mutagenesis вызовет изменения ≈1000 однобазовой пары, либо вставки / удаления (InDel) или одного нуклеотида полиморфизма (SNP) на геном12. МУТАЦИи, индуцированные EMS, представляют собой множественные точечные мутации с частотой мутаций от 1/300 до 1/30000 за локус. Это уменьшает количество растений M1, необходимых для поиска мутации в данном гене. Диапазон популяций семян M1 2000-3000 обычно используется для получения мутаций, представляющих интерес в Arabidopsis thaliana13,14.
Aequorin трансгенитики являются Arabidopsis Колумбия-0 (Col-0) экотип растений, выражающих p35S-apoaequorin (pMA’2) вцитозоле 15. Aequorin является Ca2 “связывающий белок, состоящий из апопротеина и протезной группы, состоящей из молекулы люциферина, коэлентеразин. Связывание Ca2 “к aequorin, который имеет три Ca2 “ связывающих EF-руки сайтов, приводит к coelenterazine окисляется и циклизируются, чтобы дать диоксетанон промежуточных, а затем конформационное изменение белка сопровождается выпуском двуокиси углерода и синглет-возбужденных coelenteramide16. Coelenteramide так производится испускает синий свет(no max, 470 нм), которые могут быть обнаружены люминесометр17. Таким образом, чрезвычайно быстрые высоты Ca2 можно измерять в режиме реального времени и использовать для быстрого перемотки на задние экраны. Этот протокол направлен на использование специфичности кальция ответ для выявления новых ключевых игроков, которые участвуют в Ca2 “подпись. Для достижения этой задачи мы используем МУТагенез EMS в трансгенном акурерине и идентифицируем SNPs, связанные с измененной сигнализацией Ca2. Протокол определяет мутантов, которые не показывают или уменьшены Ca2 “высоты при добавлении стимулов. Эти мутанты могут быть отображены для определения генов, ответственных за ответ Ca2. Метод применим к любому виду жидких стимулов в растениях, что приводит к ca2 “высота. Так как высота Ca2 является одним из первых ответов в пути сигнализации защиты растений, идентификация компонентов реагирования вверх по течению может обеспечить кандидатов на генную инженерию для разработки устойчивых растений.
Protocol
Representative Results
Discussion
EMS mutagenesis является мощным инструментом для генерации мутаций в популяции. Классические передние генетические экраны с использованием EMS были эффективным инструментом для выявления новых генов по двум основным причинам: во-первых, они не требуют каких-либо предварительных предположени…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Национальный институт исследований генома растений – Фитотронный фонд для роста растений, Bombay Locale за видеосъемка, и Департамент биотехнологии- eLibrary consortium за предоставление доступа к электронным ресурсам. Эта работа была поддержана Департаментом биотехнологии, Индия через Национальный институт исследования генома растений Основной Грант, Макс Планк Gesellschaft-Индия Партнерская группа программы; и стипендию CSIR-Junior Research fellowship (до D.M и S.M) и Кафедра биотехнологии-младшего научно-исследовательского стипендий (к Р.П.).
Materials
| 24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
| 96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
| Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
| Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
| MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
| Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
| Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
| Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
| Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
- Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
- Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162 (2014).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
- Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
- Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
- McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
- Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
- Koornneef, M., Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. , 1-10 (2002).
- Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G., Running, M. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). , 45-54 (2013).
- Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
- Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399 (2015).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
- Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
- Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394 (2018).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
- Maple, J., Moeller, S. G., Rosato, E. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. , 362 (2007).
- Qu, L. J., Qin, G., Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1062, (2014).
- Leyser, H. M. O., Furner, I. J., Flanders, D., Dean, C. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). , 9-10 (1993).
- Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
- Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
- Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
- Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
- Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
- Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
- Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
- Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).
