Schermo genetico in avanti utilizzando Transgenic Calcium Reporter Aequorin per identificare nuovi obiettivi nella segnalazione di calcio
Summary
Uno screening genetico in avanti basato sull’elevazione di Ca2 o più come lettura porta all’identificazione dei componenti genetici coinvolti nei percorsi di segnalazione dipendenti dal calcio nelle piante.
Abstract
Gli screening genetici in avanti sono stati strumenti importanti nell’identificazione imparziale dei componenti genetici coinvolti in diversi percorsi biologici. La base dello schermo è quello di generare una popolazione mutante che può essere vagliata con un fenotipo di interesse. L’EMS (ethyl eilfonato di metano) è un agente alchilante comunemente usato per indurre mutazioni casuali in uno screening genetico classico in avanti per identificare più geni coinvolti in un dato processo. L’elevazione del calcio citosolico (Ca2)è una via di segnalazione precoce chiave che si attiva sulla percezione dello stress. Tuttavia, l’identità di recettori, canali, pompe e trasportatori di Ca2 è ancora sfuggente in molti sistemi di studio. Aequorin è una proteina reporter di calcio cellulare isolata da Aequorea victoria e stabilmente espressa in Arabidopsis. Sfruttando questo, abbiamo progettato uno schermo genetico in avanti in cui abbiamo EMS-mutagenizzato l’aequorin transgenico. I semi delle piante mutanti sono stati raccolti (M1)e lo screening per il fenotipo di interesse è stato effettuato nella popolazione segregazione (M2). Utilizzando un protocollo di misurazione Ca2o, con 96 pozzedi ad alto rendimento, è possibile identificare diversi nuovi mutanti che hanno una risposta di calcio variabile e vengono misurati in tempo reale. I mutanti con il fenotipo di interesse vengono salvati e propagati fino a ottenere una popolazione di piante mutanti omozice. Questo protocollo fornisce un metodo per gli schermi genetici in avanti in secondo piano per i giornalisti ca2 e per identificare i nuovi obiettivi regolamentati ca2.
Introduction
Un cambiamento nella concentrazione di calcio citosolico (Ca2)dopo la percezione dello stimolo biotico o abiotico è un evento di segnalazione precoce ben studiato che attiva molte vie di segnalazione1,2,3,4.4 Una cellula nel suo stato di riposo basale mantiene una minore concentrazione di Ca2 o nel citosol e sequestri in eccesso Ca2 , in vari organelli intracellulari e apoplasta extracellulare che porta ad un ripido Ca2o gradiente5,6. Dopo la percezione del segnale, i livelli di Ca2 s in n nel citosol a causa di un afflusso di Ca2 o da fonti extracellulari e/o intracellulari e generano una firma di calcio specifica di stimoli7,8,9.9 Le elevazioni Ca2 nel citosol sono attivate da molti stimoli, ma la specificità è mantenuta da negozi distinti che rilasciano Ca2 ,firma unica Ca2 e proteine del sensore appropriate10,11.
L’uso di agente alchilante, il solfato di metano etilico (EMS) per la mutagenesi è un potente strumento negli schermi genetici classici in avanti per identificare più geni indipendenti coinvolti in un processo. L’eMS è un mutageno chimico che induce prevalentemente transizioni da C a T e da G ad A in modo casuale in tutto il genoma e produce un cambiamento di 1 bp ogni 125 kb del genoma. La mutagenesi EMS indurrà cambiamenti nella coppia di base singola di 1000 dollari, ovvero inserimenti/delezioni (InDel) o polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) per genoma12. Le mutazioni indotte da EMS sono mutazioni multiple puntiformi con una frequenza di mutazione che va da 1/300 a 1/30000 per locus. Questo riduce il numero di piante M1 necessarie per trovare una mutazione in un dato gene. Un aumento della popolazione di semi M1 di 2000-3000 è tipicamente utilizzato per ottenere mutazioni di interesse in Arabidopsis thaliana13,14.
Aequorin transgenics sono Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) piante di ecotipo che esprimono p35S-apoaequorin (pMAQ2) nel citosol15. Aequorin è una proteina legante Ca2 e un gruppo protesico composto da molecola di luciferina, coelenterazina. Il legame di Ca2o all’aequorina, che ha tre siti di mani di EF leganti Ca2, si traduce in ossidazione e celio eccitato singlet16. La coelenteramide così prodotta emette una luce blu (zmax, 470 nm) che può essere rilevata dal luminometro17. Le elevazioni estremamente veloci svolte Ca 2 opiù possono quindi essere misurate in tempo reale e sfruttate per schermi genetici rapidi in avanti. Questo protocollo ha lo scopo di utilizzare la specificità della risposta al calcio per identificare i nuovi attori chiave che sono coinvolti nella firma di Ca2. Per raggiungere questo compito, utilizziamo la mutagenesi EMS nell’equorina transgenica e identifichiamo gli SNP associati alla segnalazione di Ca2. Il protocollo identifica i mutanti che non mostrano o riducono le elevazioni di Ca 2 o l’aggiuntadi stimoli. Questi mutanti possono quindi essere mappati per identificare i geni responsabili della risposta ca2. Il metodo è applicabile a qualsiasi tipo di stimoli liquidi nelle piante che si traduce in un’elevazione Ca2. Dal momento che l’elevazione di Ca2 è una delle prime risposte nel percorso di segnalazione della difesa delle piante, l’identificazione dei componenti di risposta a monte può fornire candidati per l’ingegneria genetica per sviluppare piante resilienti.
Protocol
Representative Results
Discussion
La mutagenesi EMS è un potente strumento per generare mutazioni nella popolazione. Gli schermi genetici classici che utilizzano lo SME sono stati uno strumento efficace per identificare nuovi geni per due motivi principali: in primo luogo, non richiedono alcuna ipotesi preliminare sull’identità genica e, in secondo luogo, non introducono alcuna distorsione. Ci sono diversi metodi per generare una popolazione di screening come EMS, inserimenti T-DNA, radiazioni ecc. Tra tutti i metodi, la mutagenesi basata su EMS ha poc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo l’Istituto Nazionale di Ricerca sul Genoma Vegetale – Phytotron Facility per la crescita delle piante, Bombay Locale per le riprese video e il Consorzio Department of Biotechnology- eLibrary per aver fornito l’accesso alle risorse e-resources. Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento di Biotecnologia, India attraverso il National Institute of Plant Genome Research Core Grant, Max Planck Gesellschaft-India Partner Group programma; e CSIR-Junior Research Fellowship (a D.M e S.M) e Department of Biotechnology-Junior Research Fellowship (a R.P).
Materials
| 24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
| 96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
| Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
| Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
| MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
| Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
| Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
| Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
| Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |
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