칼슘 신호의 새로운 표적을 확인하기 위해 트랜스제닉 칼슘 리포터 Aequorin을 사용하여 유전자 화면을 전달
Summary
읽기 아웃으로 Ca2 + 고도에 따라 앞으로 유전 화면은 식물에서 칼슘 의존 신호 경로에 관련된 유전 구성 요소의 식별에 이르게.
Abstract
앞으로 유전 스크린은 몇몇 생물학 통로에 관련되었던 유전 분대의 편견없는 식별에 있는 중요한 공구되었습니다. 화면의 기초는 관심표현형으로 스크리핑할 수 있는 돌연변이 집단을 생성하는 것이다. EMS (에틸 메탄 설포네이트)는 주어진 과정에 관련된 여러 유전자를 식별하기 위해 고전적인 전방 유전 화면에서 임의의 돌연변이를 유도하기 위한 일반적으로 사용되는 알킬팅 에이전트입니다. 세포성 칼슘(Ca2+)고도는 스트레스 지각시 활성화되는 주요 초기 신호 경로입니다. 그러나 Ca2 +의 수용체, 채널, 펌프 및 수송기의 정체성은 여전히 많은 연구 시스템에서 애매합니다. Aequorin은 Aequorea 빅토리아에서 분리되고 아비도시스에서 안정적으로 발현되는 세포 칼슘 리포터 단백질입니다. 이를 악용하여, 우리는 우리가 Aequorin 형질화EMS돌연변이를 하는 전진 유전 스크린을 디자인했습니다. 돌연변이 식물로부터의 종자(M1)를 채취하고, 관심 표현형에 대한 스크리닝은 분리(M2) 집단에서 수행되었다.12 96웰의 고처리량 Ca2+ 측정 프로토콜을 사용하여 다양한 칼슘 반응을 가지며 실시간으로 측정되는 몇 가지 새로운 돌연변이를 식별할 수 있습니다. 관심의 표현형을 가진 돌연변이는 호머지구균 돌연변이 식물 인구가 얻어질 때까지 구조되고 전파됩니다. 이 프로토콜은 Ca2+ 리포터 배경에서 유전 화면을 전달하는 방법을 제공하고 새로운 Ca2+ 규제 대상을 식별합니다.
Introduction
생체 내 자극또는 아바이오틱 자극의 지각시 세포칼슘(Ca2+)의 농도변화는 많은 신호경로2+1,2,,33,4를활성화시키는 잘 연구된 초기 신호이벤트이다., 기저 휴식 상태의 세포는 다양한 세포 세포 세포 및 세포 외 세포 세포 세포5,6로이어지는 세포 외 세포 세포 세포 및 세포 외 세포 세포 세포 세포에서 Ca2 + 초과 Ca 2+ 농도를유지합니다.2+ 신호 지각시, Ca2+ 수준은 세포외 및/또는 세포내 공급원으로부터 Ca2+의 유입으로 인해 사이토솔에서 상승하고 자극 특정 칼슘 시그니처7,,8,,9를생성한다. 시토솔의 Ca2+ 고도는 많은 자극에 의해 활성화되지만, 특이성은 Ca2+,독특한 Ca2+ 시그니처 및 적절한 센서 단백질10,,11을해제하는 뚜렷한 상점에 의해 유지된다.
돌연변이 발생을 위한 알킬 메탄 설포네이트(EMS)의 사용은 공정에 관여하는 다중 독립적인 유전자를 확인하기 위한 고전적인 전방 유전 스크린의 강력한 도구입니다. EMS는 주로 C내지 T와 G를 유전체 전체에 걸쳐 무작위로 전환하도록 유도하는 화학 돌연변이원이며 게놈의 125kb마다 1bp 변화를 일으킵니다. EMS 돌연변이 발생은 게놈12당삽입/삭제(InDel) 또는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 유도하여 1000개의 단일 염기 쌍 변화를 유도한다. EMS 유도 돌연변이는 궤적 당 1/300에서 1/300000에 이르는 돌연변이 주파수를 가진 다중 점 돌연변이입니다. 이것은 주어진 유전자에 있는 돌연변이를 찾아는 데 필요한 M1 식물의 수를 감소시킵니다. 2000-3000의 M1 종자 인구 범위는 전형적으로 아라비도시스 탈리아나,13,14에대한 관심의 돌연변이를 얻기 위해 사용된다.
Aequorin 형질전환은 사이토솔15에서p35S-아포아에쿠린(pMAQ2)을 발현하는 아라비도시스 컬럼비아-0(Col-0) 에코타입 식물이다. Aequorin은 혈관 단백질및 루시페린 분자, coelenterazine로 구성된 보철군으로 구성된 Ca2+ 결합 단백질입니다. Ca2+의 결합은 3개의 Ca2+ 결합 EF 손 부위를 가지고 있으며, 코엘엔테아진은 산화되고 분화되어 디옥세타네 중간체를 제공하고, 이산화탄소와 단일 흥분 코엘엔테아미드16의방출과 함께 단백질의 형성적 변화가 뒤따릅니다. 생성된 코엘엔테아미드는광미계(17)에의해 검출될 수 있는 청색광(λmax,470 nm)을 방출한다. 매우 빠른 Ca2+ 고도는 따라서 실시간으로 측정될 수 있고, 급속한 전진 유전 스크린을 위해 이용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 Ca2+ 서명에 관련된 새로운 주요 플레이어를 식별하기 위해 칼슘 반응의 특이성을 사용하는 것을 목표로 합니다. 이 작업을 수행하기 위해, 우리는 형질 전환 aequorin에서 EMS 돌연변이 발생을 사용하고 변경 된 Ca2 + 신호와 관련된 SNP를 식별합니다. 이 프로토콜은 각성부리 추가 시 Ca2+ 고도가 감소하지 않거나 감소된 돌연변이를 식별합니다. 이러한 돌연변이는 Ca2+ 반응을 담당하는 유전자를 식별하기 위해 매핑될 수 있습니다. 이 방법은 Ca2+ 고도를 초래하는 식물의 모든 종류의 액체 자극에 적용됩니다. Ca2+ 고도는 식물 방어 신호 경로의 첫 번째 응답 중 하나이므로 업스트림 응답 구성 요소의 식별은 유전 공학후보자에게 탄력성 식물을 개발할 수 있는 후보자를 제공할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
EMS 돌연변이 발생은 인구에서 돌연변이를 생성하는 강력한 도구입니다. EMS를 사용하는 고전적인 미래 유전 화면은 두 가지 주요 이유로 새로운 유전자를 식별하는 효과적인 도구였습니다 : 첫째로, 유전자 정체성에 대한 사전 가정을 필요로하지 않으며 둘째, 편견을 소개하지 않습니다. EMS, T-DNA 삽입, 방사선 등과 같은 선별 인구를 생성하는 몇 가지 방법이 있습니다. 모든 방법 중 EMS 기반 돌연변…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
국립 식물게놈 연구 연구소 – 식물 성장을 위한 식물성 자, 비디오 촬영을 위한 봄베이 로케일, e-리소스에 대한 접근성을 제공하는 생명공학-eLibrary 컨소시엄에 감사드립니다. 이 작품은 국립 식물 게놈 연구 코어 그랜트, 막스 플랑크 Gesellschaft-인도 파트너 그룹 프로그램을 통해 생명 공학부, 인도의 부에 의해 지원되었다; CSIR-주니어 연구 펠로우십(D.M 및 S.M) 및 생명공학-주니어 연구 펠로우십(R.P).
Materials
| 24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
| 96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
| Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
| Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
| MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
| Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
| Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
| Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
| Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
- Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
- Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162 (2014).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
- Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
- Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
- McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
- Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
- Koornneef, M., Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. , 1-10 (2002).
- Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G., Running, M. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). , 45-54 (2013).
- Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
- Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399 (2015).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
- Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
- Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394 (2018).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
- Maple, J., Moeller, S. G., Rosato, E. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. , 362 (2007).
- Qu, L. J., Qin, G., Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1062, (2014).
- Leyser, H. M. O., Furner, I. J., Flanders, D., Dean, C. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). , 9-10 (1993).
- Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
- Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
- Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
- Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
- Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
- Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
- Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
- Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).
