トランスジェニックカルシウムレポーターエークオリンを用いたニューシグナル伝達の新しい標的の同定を用いた遺伝子スクリーンの前方
Summary
読み出しとしてCa2+の標高に基づく前方遺伝的スクリーンは、植物のカルシウム依存性シグナル伝達経路に関与する遺伝的成分の同定につながる。
Abstract
前方の遺伝的スクリーンは、いくつかの生物学的経路に関与する遺伝的構成要素の公平な同定において重要なツールであった。画面の基礎は、目的の表現型でスクリーニングすることができる変異体集団を生成することです。EMS(エチルメタンスルホン酸)は、古典的な前方遺伝子スクリーンでランダムな突然変異を誘導し、任意のプロセスに関与する複数の遺伝子を同定するために一般的に使用されるアルキル化剤である。細胞構造カルシウム(Ca2+)上昇は、ストレス知覚時に活性化される重要な初期シグナル伝達経路である。しかし、Ca2+の受容体、チャネル、ポンプ、トランスポーターのアイデンティティは、多くの研究システムにおいて依然として不可解です。Aequorinは、エーコレアビクトリアから分離され、シロイヌナズナで安定して発現する細胞カルシウムレポータータンパク質です。これを利用して、我々はEMS-変異原性のエクオリントランスジェニックを形成する前方遺伝子スクリーンを設計した。変異植物から種子を採取し(M1)、目的とする表現型のスクリーニングを分離(M2)集団で行った。96ウェルハイスループットCa2+測定プロトコルを使用して、様々なカルシウム応答を有し、リアルタイムで測定されるいくつかの新しい変異体を同定することができる。目的の表現型を有する変異体は、ホモ接合変異植物集団が得られるまで救出され、伝播される。このプロトコルは、Ca2+レポーターのバックグラウンドで遺伝的画面を転送するための方法を提供し、新しいCa2+規制対象を同定する。
Introduction
生物または非生物的刺激の知覚時の細胞細胞分解性カルシウム(Ca2+)濃度の変化は、多くのシグナル伝達経路1、2、3、42,を活性化する十分に1研究された早期シグナル伝達事象である。3,4その基底安静状態の細胞は、細胞質および隔離剤の細胞質2+濃度を、種々の細胞内小器官および細胞外アポプラストにおいてより低いCa2+濃度を維持し、急なCa2+勾配5,66に至る。5シグナル知覚の際に、細胞外および/または細胞内源からのCa2+の流入により、Ca2+レベルが細胞質ゾル内で上昇し、刺激特異的なカルシウムシグネチャ77、8、98,9を生成する。サイトゾル内のCa2+上昇は多くの刺激によって活性化されるが、特異性はCa2+を放出する別個の店舗によって維持され、ユニークなCa2+シグネチャと適切なセンサータンパク質10,11,11である。
アルキル化剤の使用、変異生成のためのエチルメタンスルホン酸塩(EMS)は、プロセスに関与する複数の独立した遺伝子を同定するための古典的な前方遺伝子スクリーンの強力なツールです。EMSは、主にCからT、GをAに誘導する化学変異原であり、ゲノム全体にランダムに移行し、ゲノムの125kbごとに1bpの変化を生じる。EMS変異生成は、ゲノム12当たり挿入/欠失(InDel)または一塩基多型(SNP)のいずれかの単一塩基対の変化を誘導する。EMS誘導突然変異は、1/300から1/30000の変異頻度を有する複数点突然変異である。これにより、所定の遺伝子に変異を見つけるために必要なM1植物の数が減少します。2000-3000のM1シード集団範囲は、典型的には、シロイヌナズナ13、14,14で関心のある変異を得るために使用される。
エケオリントランスジェニックは、シロイヌナズミシコロンビア-0(Col-0)の植物植物であり、p35S-アポエクオリン(pMAQ2)をサイトゾル15に発現する。Aequorinは、アポタンパク質とルシフェリン分子、コエンテラジンからなる補綴基で構成されるCa2+結合タンパク質である。Ca2+と3つのCa2+結合EF-手部位を有するエクオリンへの結合により、コエンテラジンが酸化され、サイクチ化されてジオキセタノン中間体を得て、続いて二酸化炭素および単一励起したコエレンタミド16の放出を伴うタンパク質の立体構造変化が生じる。生成されたコエンテラミドは、光計17で検出できる青色光(λ max,470 nm)を発光する。max非常に高速なCa2+の標高は、このようにリアルタイムで測定することができ、迅速な前方の遺伝的スクリーンのために利用されます。このプロトコルは、カルシウム応答の特異性を使用して、Ca2+署名に関与する新しい主要プレーヤーを特定することを目的としています。このタスクを達成するために、トランスジェニック・エクポリンでEMS変異生成を使用し、変更されたCa2+シグナル伝達に関連するSNPを同定する。このプロトコルは、刺激付加時にCa2+の標高を示さないか、または減少させた変異体を識別する。これらの変異体は、次いで、Ca2+応答の原因となる遺伝子を同定するためにマッピングすることができる。この方法は、Ca2+の標高をもたらす植物の液体刺激の任意の種類に適用されます。Ca2+上昇は植物防御シグナル経路における最初の応答の1つであるため、上流応答成分の同定は、弾力性のある植物を開発するための遺伝子工学の候補を提供することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
EMS変異誘発は、集団の突然変異を生成するための強力なツールです。EMSを用いた古典的なフォワード遺伝子スクリーンは、2つの主な理由で新しい遺伝子を同定するための効果的なツールとなっています:第一に、遺伝子同一性に関する事前の仮定を必要とせず、第二に、彼らはバイアスを導入しません。EMS、T-DNA挿入、放射線などのスクリーニング集団を生成する方法はいくつかあります。す…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
植物ゲノム研究所 – 植物の成長のためのフィトトロン施設、ビデオ撮影のためのボンベイロケール、および電子資源へのアクセスを提供するためのバイオテクノロジー省eLibraryコンソーシアムに感謝します。この研究は、国立植物ゲノム研究所コアグラント、マックスプランクゲセルシャフト-インドパートナーグループプログラムを通じて、インドのバイオテクノロジー省によって支援されました。CSIRジュニア研究フェローシップ(D.MおよびS.M)およびバイオテクノロジー・ジュニア研究フェローシップ(R.P.へ)を含む。
Materials
| 24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
| 96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
| Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
| Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
| MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
| Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
| Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
| Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
| Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
- Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
- Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162 (2014).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
- Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
- Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
- McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
- Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
- Koornneef, M., Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. , 1-10 (2002).
- Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G., Running, M. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). , 45-54 (2013).
- Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
- Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399 (2015).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
- Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
- Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394 (2018).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
- Maple, J., Moeller, S. G., Rosato, E. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. , 362 (2007).
- Qu, L. J., Qin, G., Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1062, (2014).
- Leyser, H. M. O., Furner, I. J., Flanders, D., Dean, C. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). , 9-10 (1993).
- Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
- Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
- Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
- Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
- Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
- Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
- Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
- Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).
