Écran génétique avancé utilisant l’aequorin de journaliste transgénique de calcium pour identifier de nouvelles cibles dans la signalisation de calcium
Summary
Un écran génétique avancé basé sur l’élévation de Ca2+ comme lecture conduit à l’identification des composants génétiques impliqués dans les voies de signalisation dépendantes du calcium dans les plantes.
Abstract
Les écrans génétiques avancés ont été des outils importants dans l’identification impartiale des composants génétiques impliqués dans plusieurs voies biologiques. La base de l’écran est de générer une population mutante qui peut être projeté avec un phénotype d’intérêt. Le SME (sulfonate de méthane éthylique) est un agent alcalinant couramment utilisé pour induire une mutation aléatoire dans un écran génétique avancé classique afin d’identifier plusieurs gènes impliqués dans un processus donné. L’élévation du calcium cytosolique (Ca2+) est une voie de signalisation précoce clé qui est activée lors de la perception du stress. Toutefois, l’identité des récepteurs, des canaux, des pompes et des transporteurs de Ca2+ est encore insaisissable dans de nombreux systèmes d’étude. L’aequorine est une protéine de journaliste de calcium cellulaire isolée d’Aequorea victoria et stablement exprimée dans l’Arabidopsis. En exploitant cela, nous avons conçu un écran génétique avancé dans lequel nous EMS-mutagationnized l’aequorin transgénique. Les graines des plantes mutantes ont été recueillies (M1) et le dépistage du phénotype d’intérêt a été effectué dans la population de ségrégation (M2). À l’aide d’un protocole de mesure Ca2+ de 96 puits, plusieurs nouveaux mutants peuvent être identifiés qui ont une réponse variable en calcium et sont mesurés en temps réel. Les mutants avec le phénotype d’intérêt sont sauvés et propagés jusqu’à ce qu’une population de plantes mutantes homozygotes soit obtenue. Ce protocole fournit une méthode pour les écrans génétiques avancés dans le contexte du journaliste Ca2+ et d’identifier les nouvelles cibles réglementées Ca2+ .
Introduction
Un changement dans la concentration de calcium cytosolic (Ca2+) sur la perception du stimulus biotique ou abiotique est un événement de signalisation précoce bien étudié qui active de nombreuses voies de signalisation1,2,3,4. Une cellule dans son état de repos basal maintient une concentration inférieure de Ca2+ dans le cytosol et séquestres excès de Ca2+ dans divers organites intracellulaires et apoplaste extracellulaire menant à un gradient raide de Ca2+ 5,6. Sur la perception du signal, les niveaux de Ca2+ augmentent dans le cytosol en raison d’un afflux de Ca2+ provenant de sources extracellulaires et/ou intracellulaires et génèrent une signature spécifique de calcium de stimuli7,8,9. Ca2+ élévations dans le cytosol sont activés par de nombreux stimuli, mais la spécificité est maintenue par des magasins distincts libérant Ca2 +, une signature unique Ca2 + et les protéines de capteur appropriée10,11.
L’utilisation d’un agent alkylating, le sulfonate d’éthyle-méthane (EMS) pour la mutagenèse est un outil puissant dans les écrans génétiques avant classiques pour identifier plusieurs gènes indépendants impliqués dans un processus. Ems est un mutagène chimique induisant principalement C à T et G à A transitions aléatoirement dans tout le génome et produit un changement de 1 pb dans chaque 125 kb du génome. La mutanéèse EMS entraînera 1000 changements de paires de base uniques, soit l’insertion/suppressions (InDel) soit le polymorphisme nucléotidique unique (SNP) par génome12. Les mutations induites par le SME sont des mutations à plusieurs points avec une fréquence de mutation allant de 1/300 à 1/30000 par locus. Cela réduit le nombre de plantes M1 nécessaires pour trouver une mutation dans un gène donné. Une gamme de population de semences M1 de 2000-3000 est généralement utilisée pour obtenir des mutations d’intérêt dans Arabidopsis thaliana13,14.
Les transgéniques d’Aequorin sont des plantes d’écotype Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) exprimant p35S-apoaequorine (pMAQ2) dans le cytosol15. L’aequorine est une protéine de liaison Ca2+ composée d’apoprotéine et d’un groupe prothétique composé de molécule de luciferine, coelenterazine. La liaison de Ca2+ à l’aequorin, qui a trois Ca2+ liant les sites de mains EF, a comme conséquence la coelenterazine étant oxydée et cyclisée pour donner la dioxétanone intermédiaire, suivie d’un changement conformational de la protéine accompagné par la libération de dioxyde de carbone et de coelenteramide singlet-excité16. Le coelentermine ainsi produit émet une lumière bleue (λmax, 470 nm) qui peut être détectée par le luminomètre17. Les altitudes extrêmement rapides de Ca2+ peuvent ainsi être mesurées en temps réel et exploitées pour des écrans génétiques avancés rapidement. Ce protocole vise à utiliser la spécificité de la réponse de calcium pour identifier les nouveaux acteurs clés qui sont impliqués dans la signature Ca2+. Pour réaliser cette tâche, nous utilisons la mutagène EMS dans l’aequorin transgénique et identifions les SNP associés à la signalisation Ca2+ modifiée. Le protocole identifie les mutants qui ne montrent pas ou réduit Ca2+ altitudes sur l’addition de stimuli. Ces mutants peuvent ensuite être cartographiés pour identifier les gènes responsables de la réponse Ca2+. La méthode s’applique à tout type de stimuli liquides dans les plantes qui se traduit par une altitude Ca2+. Puisque l’élévation de Ca2+ est l’une des premières réponses dans la voie de signalisation de défense de plante, l’identification des composants de réponse en amont peut fournir des candidats pour le génie génétique pour développer des usines résilientes.
Protocol
Representative Results
Discussion
La mutanéèse ems est un outil puissant pour générer des mutations dans la population. Les écrans génétiques avancés classiques utilisant le SME ont été un outil efficace pour identifier de nouveaux gènes pour deux raisons principales : premièrement, ils ne nécessitent aucune hypothèse préalable sur l’identité génétique et, deuxièmement, ils n’introduisent aucun biais. Il existe plusieurs méthodes pour générer un dépistage des populations comme le SME, les insertions d’ADN T, les radiations, e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le National Institute of Plant Genome Research – Phytotron Facility for plant growth, Bombay Locale pour la séance vidéo et le Department of Biotechnology- eLibrary Consortium d’avoir fourni l’accès aux ressources électroniques. Ces travaux ont été soutenus par le Département de biotechnologie de l’Inde par l’intermédiaire du National Institute of Plant Genome Research Core Grant, Max Planck Gesellschaft-India Partner Group program; et bourse de recherche CSIR-Junior (à D.M et S.M) et De la Bourse de recherche du Département de biotechnologie-junior (à R.P).
Materials
| 24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
| 96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
| Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
| Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
| MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
| Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
| Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
| Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
| Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |
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