Tela genética avançada usando aequorin repórter de cálcio transgênico para identificar novos alvos na sinalização de cálcio
Summary
Uma tela genética para a frente baseada na elevação de Ca2+ como leitura leva à identificação de componentes genéticos envolvidos em vias de sinalização dependentes de cálcio nas plantas.
Abstract
Telas genéticas avançadas têm sido ferramentas importantes na identificação imparcial de componentes genéticos envolvidos em várias vias biológicas. A base da tela é gerar uma população mutante que pode ser rastreada com um fenótipo de interesse. EMS (sulfonato de metano etílico) é um agente alquilante comumente usado para induzir mutação aleatória em uma tela genética clássica para a frente para identificar múltiplos genes envolvidos em qualquer processo. A elevação do cálcio citosomico (Ca2+) é uma via de sinalização inicial chave que é ativada após a percepção do estresse. No entanto, a identidade dos receptores, canais, bombas e transportadores do Ca2+ ainda é evasiva em muitos sistemas de estudo. Aequorin é uma proteína repórter de cálcio celular isolada da Aequorea victoria e expressa em Arabidopsis. Explorando isso, projetamos uma tela genética avançada na qual ems-mutagenizamos a aequorin transgênica. As sementes das plantas mutantes foram coletadas (M1) e a triagem para o fenótipo de interesse foi realizada na população segregadora (M2). Usando um protocolo de medição Ca2+ de alta produtividade de 96 poços, vários novos mutantes podem ser identificados que têm uma resposta de cálcio variada e são medidos em tempo real. Os mutantes com o fenótipo de interesse são resgatados e propagados até que uma população de plantas mutantes homozigosa seja obtida. Este protocolo fornece um método para encaminhar telas genéticas em fundo de repórter Ca2+ e identificar novos alvos regulamentados ca2+.
Introduction
Uma mudança na concentração de cálcio citosomico (Ca2+) na percepção de estímulo biótico ou abiótico é um evento de sinalização precoce bem estudado que ativa muitas vias de sinalização1,,2,,3,4. Uma célula em seu estado de repouso basal mantém uma concentração ca2+ mais baixa no citosol e sequesters em excesso ca2+ em várias organelas intracelulares e apoplasto extracelular levando a um gradiente Ca2+ íngreme5,6. Após a percepção do sinal, os níveis de Ca2+ aumentam no citosol devido a um influxo de Ca2+ de fontes extracelulares e/ou intracelulares e geram uma assinatura específica de cálcio7,,8,,9. As elevações ca2+ no citosol são ativadas por muitos estímulos, mas a especificidade é mantida por lojas distintas que liberam Ca2+,uma assinatura ca2+ exclusiva e proteínas sensoriais apropriadas10,,11.
O uso de agente alquilante, sulfonato de metano etílico (EMS) para mutagênese é uma ferramenta poderosa em telas genéticas avançadas clássicas para identificar múltiplos genes independentes envolvidos em um processo. EMS é um mutagênico químico que induz as transições C para T e G para A aleatoriamente em todo o genoma e produz uma mudança de 1 bp em cada 125 kb do genoma. A mutagênese EMS induzirá ≈1000 alterações de par de base única, inserção/exclusões (InDel) ou polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) por genoma12. Mutações induzidas pelo EMS são mutações de vários pontos com uma frequência de mutação que varia de 1/300 a 1/30000 por lócus. Isso reduz o número de plantas M1 necessárias para encontrar uma mutação em um determinado gene. Uma faixa populacional de sementes M1 de 2000-3000 é tipicamente usada para obter mutações de interesse em Arabidopsis thaliana13,14.
Os transgênicos de aequorin são plantas ecotipos Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) expressando p35S-apoaequorin (pMAQ2) no citosol15. Aequorina é uma proteína de ligação Ca2+ composta de apoproteína e um grupo protético composto por molécula de luciferina, coelenterazina. A ligação de Ca2+ à aequorina, que possui três sítios ca2+ de ligação EF-hands, resulta em coelenterazina sendo oxidada e ciclizada para dar o intermediário dioxetanona, seguida de uma alteração conformacional da proteína acompanhada pela liberação de dióxido de carbono e coelenteramida singlet-excited16. A coelenteramida tão produzida emite uma luz azul (λmax, 470 nm) que pode ser detectada pelo luminômetro17. As elevações extremamente rápidas de Ca2+ podem, portanto, ser medidas em tempo real e exploradas para telas genéticas rápidas. Este protocolo visa usar a especificidade da resposta ao cálcio para identificar novos atores-chave que estão envolvidos na assinatura do Ca2+. Para alcançar essa tarefa, usamos mutagênese EMS em aequorina transgênica e identificamos os SNPs associados à sinalização alterada de Ca2+. O protocolo identifica mutantes que não mostram elevações de Ca2+ reduzidas após a adição de estímulos. Esses mutantes podem então ser mapeados para identificar os genes responsáveis pela resposta ca2+. O método é aplicável a qualquer tipo de estímulo líquido em plantas que resulte em uma elevação de Ca2+. Uma vez que a elevação do Ca2+ é uma das primeiras respostas na via de sinalização de defesa vegetal, a identificação de componentes de resposta a montante pode fornecer candidatos para a engenharia genética para desenvolver plantas resistentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
A mutagênese EMS é uma ferramenta poderosa para gerar mutações na população. As telas genéticas avançadas clássicas usando EMS têm sido uma ferramenta eficaz para identificar novos genes por duas razões principais: em primeiro lugar, eles não exigem quaisquer suposições prévias sobre identidade genética e, em segundo lugar, eles não introduzem qualquer viés. Existem vários métodos para gerar uma triagem de populações como EMS, inserções de T-DNA, radiações etc. De todos os métodos, a mutagênes…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Instituto Nacional de Pesquisa de Genomas Vegetais – Instalação Fitotrona pelo crescimento da planta, Bombaim Locale pela filmagem, e pelo Departamento de Biotecnologia- Consórcio ELibrary por fornecer acesso aos recursos eletrônicos. Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Biotecnologia da Índia através do Programa de Núcleo de Pesquisa de Genomas Vegetais do Instituto Nacional de Plantas, Max Planck Gesellschaft-India Partner Group; e CSIR-Junior Research Fellowship (para D.M e S.M) e Departamento de Biotecnologia-Junior Research Fellowship (para R.P).
Materials
| 24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
| 96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
| Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
| Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
| MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
| Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
| Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
| Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
| Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
- Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
- Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162 (2014).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
- Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
- Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
- McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
- Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
- Koornneef, M., Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. , 1-10 (2002).
- Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G., Running, M. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). , 45-54 (2013).
- Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
- Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399 (2015).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
- Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
- Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394 (2018).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
- Maple, J., Moeller, S. G., Rosato, E. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. , 362 (2007).
- Qu, L. J., Qin, G., Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1062, (2014).
- Leyser, H. M. O., Furner, I. J., Flanders, D., Dean, C. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). , 9-10 (1993).
- Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
- Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
- Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
- Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
- Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
- Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
- Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
- Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).
