İleri Genetik Ekran Kullanarak Transgenik Kalsiyum Reporter Aequorin Kalsiyum Sinyalyeni Hedefleri Belirlemek için
Summary
Ca2+ yüksekliğine dayalı ileri genetik ekran, bitkilerde kalsiyuma bağımlı sinyal yollarında yer alan genetik bileşenlerin tanımlanmasına yol açar.
Abstract
İleri genetik ekranlar çeşitli biyolojik yollarda yer genetik bileşenlerin tarafsız belirlenmesinde önemli araçlar olmuştur. Ekranın temeli ilgi bir fenotip ile taranabilir bir mutant popülasyon oluşturmaktır. EMS (etil metan sülfonat) herhangi bir süreçte yer alan birden fazla gentanımlamak için klasik ileri genetik ekranda rastgele mutasyon indükleyen yaygın olarak kullanılan bir alkilleyici ajandır. Sitosolik kalsiyum (Ca2+) yükseklik stres algısı üzerine aktive olan önemli bir erken sinyal yoludur. Ancak Ca2+ reseptörlerinin, kanallarının, pompalarının ve ışınlayıcılarının kimliği birçok çalışma sisteminde hala zordur. Aequorin, Aequorea victoria’dan izole edilmiş ve Arabidopsis ile ifade edilen hücresel kalsiyum muhabiri proteindir. Bunu sömürerek, aequorin transgenik eMS-mutajenize bir ileri genetik ekran tasarladık. Mutant bitkilerden elde edilen tohumlar toplandı (M1) ve ilgi fenotip için tarama ayrıştırma (M2)popülasyonunda yapıldı. 96-iyi yüksek-throughput Ca2 + ölçüm protokolü kullanılarak, çeşitli yeni mutantlar farklı bir kalsiyum yanıtı var ve gerçek zamanlı olarak ölçülür tespit edilebilir. İlgi fenotipleri olan mutantlar kurtarılır ve homozigot mutant bitki popülasyonu elde edilene kadar yayılır. Bu protokol, Ca2+ muhabir arka planında ileri genetik ekranlar için bir yöntem sağlar ve yeni Ca2+ düzenlenmiş hedefleri tanımlar.
Introduction
Biyotik veya abiyotik uyarıcı algısı üzerine sitosolik kalsiyum (Ca2 +) konsantrasyonunda bir değişiklik birçok sinyal yolları 1 aktive bir iyi çalışılmış erken sinyalolaydır 1,2,3,4. Bazal istirahat durumunda bir hücre sitosol daha düşük Bir Ca2 + konsantrasyonu korur ve çeşitli hücre içi organeller de Ca2 + fazla sekanslar ve sarp Ca 2+ gradyan5,yol açan hücre dışı apoplast ,6. Sinyal algısı üzerine, Ca2 + düzeyleri ekstrasellüler ve / veya hücre içi kaynaklardan Ca2 + bir akını nedeniyle sitosol artış ve bir uyarıcı özel kalsiyum imza oluşturmak7,8,9. Sitosol Ca2 + yükseklikleri birçok uyarantarafından aktive edilir, ancak özgüllük ca2 serbestfarklı mağazalar tarafından korunur + , benzersiz bir Ca 2+ imza ve uygun sensör proteinleri10,11.
Mutagenez için alkilleyici ajan, etil metan sülfonat (EMS) kullanımı, bir süreçte yer alan birden fazla bağımsız geni tanımlamak için klasik ileri genetik ekranlarda güçlü bir araçtır. EMS, c’den T’ye ve G’yi genomun her 125 kb’sinde rastgele a geçişlerine neden olan ve 1 bp’lik bir değişim üreten kimyasal bir mutajentir. EMS mutagenezi12genom başına ekleme/silme (InDel) veya tek nükleotit polimorfizm (SNP) olmak üzere 1000 tek baz çifti değişikliğine neden olur. EMS’ye bağlı mutasyonlar, lokus başına 1/300 ile 1/30000 arasında değişen mutasyon frekansı ile birden fazla nokta mutasyonudır. Bu, belirli bir gende mutasyon bulmak için gereken M1 bitkilerinin sayısını azaltır. 2000-3000 Bir M1 tohum popülasyon aralığı genellikle Arabidopsis thaliana13ilgi mutasyonları elde etmek için kullanılır,14.
Aequorin transgenics Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) ekotip bitkiler p35S-apoaequorin (pMAQ2) sitosol15ifade vardır. Aequorin apoprotein ve luciferin molekülü, coelenterazin oluşan bir protez grubu oluşan bir Ca2 + bağlayıcı proteindir. Ca2+ aequorin bağlanması, hangi üç Ca2 + bağlayıcı EF-hands siteleri vardır, coelenterazine okside ve dioksettanon ara vermek için siklize sonuçları, karbondioksit ve tek-heyecanlı coelenteramideserbest eşlik eden protein konformasyonel bir değişiklik izledi16. Coelenteramid böylece üretilen bir mavi ışık yakar (λmax, 470 nm) luminometer tarafından tespit edilebilir17. Son derece hızlı Ca2 + yükseklikleri böylece gerçek zamanlı olarak ölçülebilir, ve hızlı ileri genetik ekranlar için istismar. Bu protokol, Ca2+ imzasıyla ilgili yeni kilit oyuncuları tanımlamak için kalsiyum tepkisinin özgüllüğünü kullanmayı amaçlamaktadır. Bu görevi başarmak için transgenik aequorin’de EMS mutagenezkullanır ız ve değiştirilmiş Ca2+ sinyalizasyonuile ilişkili SNP’leri tanımlarız. Protokol, uyaran ların eklenmesi üzerine Ca2+ yükseklikleri göstermeyen veya küçülten mutantları tanımlar. Bu mutantlar daha sonra Ca2 + yanıtı sorumlu genleri tanımlamak için eşlenebilir. Bu yöntem, bitkilerde Ca2+ yüksekliğiile sonuçlanan her türlü sıvı uyaran için geçerlidir. Ca2+ yüksekliği bitki savunma sinyal yolundaki ilk tepkilerden biri olduğundan, yukarı akım tepki bileşenlerinin belirlenmesi dirençli bitkiler geliştirmek için genetik mühendislik adayları sağlayabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
EMS mutagenez popülasyonda mutasyonlar oluşturmak için güçlü bir araçtır. EMS kullanan klasik ileri genetik ekranlar iki önemli nedenden dolayı yeni genleri tanımlamak için etkili bir araç olmuştur: birincisi, gen kimliği üzerinde önceden varsayımlar gerektirmez ve ikinci olarak, herhangi bir önyargı tanıtmak yok. EMS, T-DNA eklemeleri, radyasyon vb. gibi tarama popülasyonları oluşturmak için çeşitli yöntemler vardır. Tüm yöntemler arasında EMS tabanlı mutagenezinin diğer yöntemlere gö…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ulusal Bitki Genom Araştırma Enstitüsü – Bitki büyümesi için Fitotron Tesisi, video çekimi için Bombay Locale ve e-kaynaklara erişim sağlayan Biyoteknoloji- eLibrary Konsorsiyumu Bölümü’ne teşekkür ederiz. Bu çalışma Biyoteknoloji Bölümü, Hindistan Ulusal Bitki Genom Araştırma Çekirdek Hibe Enstitüsü, Max Planck Gesellschaft-Hindistan Ortak Grup programı ile desteklenmiştir; ve CSIR-Junior Araştırma Bursu (D.M ve S.M.’ye) ve Biyoteknoloji-Junior Araştırma Bursu Bölümü (R.P.’ye).
Materials
| 24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
| 96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
| Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
| Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
| MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
| Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
| Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
| Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
| Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
- Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
- Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162 (2014).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
- Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
- Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
- McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
- Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
- Koornneef, M., Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. , 1-10 (2002).
- Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G., Running, M. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). , 45-54 (2013).
- Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
- Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399 (2015).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
- Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
- Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394 (2018).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
- Maple, J., Moeller, S. G., Rosato, E. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. , 362 (2007).
- Qu, L. J., Qin, G., Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1062, (2014).
- Leyser, H. M. O., Furner, I. J., Flanders, D., Dean, C. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). , 9-10 (1993).
- Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
- Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
- Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
- Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
- Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
- Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
- Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
- Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).
