Summary
यह प्रोटोकॉल चूहों में एथेरोस्क्लेरोटिक बोझ का विश्लेषण करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रक्रिया प्रदान करता है। जांचकर्ता इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न जानवरों में एथेरोस्क्लेरोटिक घावों की बहुतायत, स्थान और आकार की तुलना करने के लिए कर सकते हैं।
Abstract
एपोलिपोप्रोटीन ई (Apoe) - या कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन रिसेप्टर (Ldlr) की कमी वाले हाइपरलिपिडेमिक चूहे एथेरोस्क्लेरोसिस अनुसंधान के लिए दो सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले मॉडल हैं। उनका उपयोग एथेरोस्क्लेरोटिक घाव के गठन पर विभिन्न आनुवंशिक कारकों और विभिन्न सेल प्रकारों के प्रभाव का अध्ययन करने और साथ ही साथ नए उपचारों के विकास का परीक्षण करने के लिए किया जाता है। अलगाव, पूरे महाधमनी का उच्छेदन, और तेल लाल ओ-दाग एथेरोस्क्लेरोटिक घावों का परिमाणीकरण एथेरोस्क्लेरोटिक बोझ का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले बुनियादी मोर्फोमेट्रिक तरीके हैं । इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक अनुकूलित, चरण-दर-चरण सर्जिकल विधि का वर्णन करना है, जो तेल रेड ओ के साथ माउस महाधमनी में एथेरोस्क्लेरोटिक घावों को विच्छेदित करने, परफ्यूज-फिक्स, अलग, दाग, छवि और विश्लेषण करने के लिए है। क्योंकि एथेरोस्क्लेरोटिक घाव पूरे महाधमनी के पेड़ में कहीं भी बन सकते हैं, इस पूरे महाधमनी तेल रेड ओ स्टेनिंग विधि में पूरे महाधमनी और एक ही माउस में सभी शाखाओं में लिपिड-लदी सजीले टुकड़े का मूल्यांकन करने का लाभ है। तेल रेड ओ धुंधला करने के अलावा, ताजा अलग-थलग पूरे महाधमनी का उपयोग इन विट्रो और विवो प्रयोगों और सेल अलगाव में विविधता के लिए किया जा सकता है।
Introduction
कोरोनरी धमनी रोग, अमेरिका में मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण, आमतौर पर एथेरोस्क्लेरोसिस के कारण होता है, एक प्रक्रिया जो धमनी दीवारों के अंदर पट्टिका के निर्माण की ओर ले जाती है1। हाइपरलिपिडिमिया-प्रवण Apoe- और Ldlr-कमी वाले चूहे एथेरोस्क्लेरोसिस की जांच और इसकी जटिलताओं और उपचारों के विकास के लिए केंद्रीय हैं2,3,4,5। एन फेस महाधमनी से एथेरोस्क्लेरोटिक घावों का परिमाणीकरण विभिन्न सेल प्रकारों में आनुवंशिक हेरफेर के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक महत्वपूर्ण समापन बिंदु विश्लेषण है। यह एथेरोस्क्लेरोटिक रोग दीक्षा, प्रगति और प्रतिगमन को प्रभावित करने के लिए डिज़ाइन किए गए उपन्यास उपचारों का अध्ययन करने में भी मदद करता है। एथेरोस्क्लेरोटिक घाव महाधमनी और इसकी शाखाओं में कहीं भी बन सकते हैं (यानी, छाती में ब्रैकियोसेफेलिक, कैरोटिड और सबक्लेवियन धमनियों के साथ-साथ डायाफ्राम के नीचे गुर्दे, सामान्य इलियाक और ऊरु धमनियों)6। एथेरोस्क्लेरोसिस बोझ और उचित चिकित्सा के व्यापक मूल्यांकन के लिए विभिन्न स्थानों में रोग के बोझ के मूल्यांकन की आवश्यकता होती है, एक चुनौती जिसे अक्सर अनदेखा किया जाता है।
यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि एथेरोस्क्लेरोटिक घावों का एक व्यापक विश्लेषण कैसे किया जाए, जो एक खुला हुआ पूरा महाधमनी के साथ शुरू होता है और एक माउस में चेहरे की तैयारी के लिए आगे बढ़ता है। खुला हुआ पूरा महाधमनी तेल रेड ओ धुंधला पूरे महाधमनी और इसकी शाखाओं में लिपिड-लदी सजीले टुकड़े के तेजी से, गुणात्मक मूल्यांकन की अनुमति देता है, जबकि एन फेस तैयारी माउस महाधमनी में एथेरोस्क्लेरोटिक घाव वितरण का मात्रात्मक मूल्यांकन प्रदान करती है।
तकनीक एक चिकनी मांसपेशी सेल के साथ 8 सप्ताह पुराने चूहों का उपयोग करता है-विशिष्ट TGFπR2 Apoe-/- हाइपरलिपिडेमिक पृष्ठभूमि (MYH11-CreERT2) पर विलोपन; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/-; इसके बाद TGFπR2iSMC-Apoe चूहों) और littermate Apoe-/- नियंत्रण (MYH11-CreERT2; mT/mGf/f) के रूप में जाना जाता है; Apoe-/-; इसके बाद Apoe-/- चूहों के रूप में संदर्भित किया जाता है)। जानवरों को अध्ययन सामग्री के रूप में उच्च कोलेस्ट्रॉल उच्च वसा वाले आहार (HCHFD) पर 16 सप्ताह के लिए रखा जाता है। अध्ययन समाप्ति पर, अप्रकाशित पूरे महाधमनी दाग और छवि (सभी प्रमुख शाखाओं सहित) लिपिड से भरे सजीले टुकड़े के गुणात्मक मूल्यांकन के लिए तेल लाल ओ के साथ कर रहे हैं। महाधमनी को एन फेस तैयारी के माध्यम से काटा जाता है, और सभी एथेरोस्क्लेरोटिक घावों को चित्रित और परिमाणित किया जाता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग Apoe-/- या Ldlr-/- हाइपरलिपिडिमिया चूहों के मॉडल में एथेरोस्क्लेरोटिक घाव विकास का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है और सामान्य महाधमनी से संबंधित संवहनी जीव विज्ञान अनुप्रयोगों तक बढ़ाया जा सकता है।
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Protocol
एमटी / एमजी (स्टॉक नंबर 007676), और एपो-/ - (स्टॉक नंबर 002052) चूहों को जैक्सन प्रयोगशाला से खरीदा गया था। Myh11-CreERT2 चूहों स्टीफन Offermanns से एक उपहार थे (स्टॉक नंबर 019079 के रूप में जैक्सन प्रयोगशाला से उपलब्ध). Tgfbr2fl / fl चूहों को हेरोल्ड एल मूसा (वेंडरबिल्ट विश्वविद्यालय) से प्राप्त किया गया था। येल विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग करके सभी पशु प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया था।
1. चूहों
- MYH11-CreERT2; mT/mGf/f का उत्पादन करें; Apoe-/- और MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/- चूहों के रूप में पहले वर्णित7. दस से अधिक पीढ़ियों के लिए C57BL / 6J पृष्ठभूमि के लिए उत्परिवर्ती उपभेदों नस्ल।
नोट: Myh11-CreERT2 Cre माउस लाइन संवहनी होमियोस्टैसिस और संवहनी विकृति में चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है। क्रे एलील को वाई गुणसूत्र में डाला जाता है; इस प्रकार, मादा चूहे इस निर्माण को व्यक्त नहीं करते हैं।
2. माउस जीनोटाइपिंग, tamoxifen प्रेरण, और उच्च कोलेस्ट्रॉल उच्च वसा आहार खिला
- माउस कान डीएनए और पीसीआर विश्लेषण का उपयोग कर माउस जीनोटाइपिंग प्रदर्शन करें। माउस कान डीएनए को निर्माता के निर्देशों के अनुसार रक्त और ऊतक डीएनए अलगाव किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके अलग किया जाना चाहिए। PCR प्राइमरों को तालिका 1 में सूचीबद्ध किया गया है।
- 6 सप्ताह पुराने MYH11-CreERT2; mT/mGf/f में 5 दिनों के लिए 1 mg/day i.p. पर tamoxifen injection द्वारा Cre-Lox पुनर्संयोजन को प्रेरित करें; Apoe-/- और MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/- नर चूहों.
- 16 सप्ताह के लिए एचसीएचएफ आहार (40% किलो कैलोरी वसा, 1.25% कोलेस्ट्रॉल, 0% कोलिक एसिड) पर 8 सप्ताह के पुरुष चूहों (टैमोक्सीफेन उपचार के 2 सप्ताह बाद) रखकर एथेरोस्क्लेरोसिस को प्रेरित करें।
3. अभिकर्मकों और विच्छेदन उपकरण की तैयारी
- स्टॉक तेल लाल ओ समाधान तैयारी: आइसोप्रोपिल अल्कोहल के 100 मिलीलीटर में 1 ग्राम तेल लाल ओ को भंग करें।
- वर्किंग ऑयल रेड ओ समाधान तैयारी: dH2O के 16 mL के साथ स्टॉक ऑयल रेड O समाधान के 24 mL को मिलाएं। पतला तेल लाल O को 0.45 μm बाँझ सिरिंज फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर करें (समाधान केवल 1-2 h के लिए अच्छा है)।
- 60% आइसोप्रोपाइल अल्कोहल की तैयारी: 40 मिलीलीटर डीएच 2 ओ के साथ आइसोप्रोपिल अल्कोहल के 60 मिलीलीटर को मिलाएं।
- 1x DPBS तैयारी में 4% formaldehyde: 1x DPBS के 30 mL में 16% formaldehyde के 10 mL पतला।
- 70% इथेनॉल (चित्रा 1) के साथ सभी विच्छेदन उपकरण साफ करें।
4. इच्छामृत्यु (चित्रा 2A)
- इच्छामृत्यु से पहले माउस के वजन को मापें।
- केटामाइन और xylazine के intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा माउस euthanize (प्रत्येक milliliter 10 मिलीग्राम / एमएल केटामाइन और 2 मिलीग्राम / एमएल xylazine शामिल हैं)।
- माउस को सुपाइन स्थिति (पेट की ओर फेस-अप) में रखें।
5. छाती और उदर गुहा और दिल परफ्यूजन के उद्घाटन (चित्रा 2B)
- 1x DPBS के 10 mL के साथ एक 10 mL सिरिंज तैयार करें। एक 25 जी सुई के साथ टोपी. सिरिंज का उपयोग दिल को फ्लश करने के लिए किया जाएगा।
- चिमटी (स्टाइल 5) के साथ त्वचा को पकड़ो और पेट के आधार से गर्दन के शीर्ष तक ठीक कैंची के साथ काटें।
- रिबकेज के नीचे पेट की दीवार खोलें।
- चिमटी (स्टाइल 5) के साथ उरोस्थि को उठाएं और डायाफ्राम को काटें, फिर वक्ष गुहा को उजागर करने के लिए रिबकेज को काट दें।
- दिल के दाहिने आलिंद में एक छोटा सा चीरा लगाएं।
- एपिकल बाएं वेंट्रिकुलर पंचर के माध्यम से धीरे-धीरे 1x DPBS के 10 मिलीलीटर इंजेक्ट करके perfuse। एक बार अच्छी तरह से perfused, जिगर और गुर्दे हल्के भूरे रंग के हो जाते हैं।
- सामग्री को अवशोषित करने के लिए एक गैर-बुने हुए स्पंज का उपयोग करके बाहरी रक्त और तरल पदार्थ की छाती गुहा को साफ करें।
6. महाधमनी और शाखाओं का अलगाव (चित्रा 2C)
- अंगों (यानी, फेफड़े, जिगर, प्लीहा, और जठरांत्र संबंधी और प्रजनन अंगों) को हटा दें और दिल, गुर्दे और महाधमनी को सीटू में बरकरार रखते हुए चिमटी (स्टाइल 5) और ठीक कैंची का उपयोग करके क्लैविकल को काट दें।
नोट: सुनिश्चित करें कि दिल या किसी भी प्रमुख रक्त वाहिकाओं को कम न करें। - माउस को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे रखें।
- महाधमनी और महाधमनी शाखाओं को विच्छेदित करें जिसमें ब्रैकियोसेफेलिक धमनी, कैरोटिड धमनियां, सबक्लेवियन धमनियां, गुर्दे की धमनियां, आम इलियाक धमनियां, और चिमटी (शैली 4) और वसंत कैंची का उपयोग करके ऊरु धमनियां शामिल हैं।
नोट: महाधमनी शाखाओं को विच्छेदन करते समय निर्जलीकरण से बचने के लिए एक गीले, गैर-बुने स्पंज के साथ महाधमनी को कवर करें। - चिमटी (स्टाइल 4) और वसंत कैंची का उपयोग करके महाधमनी और महाधमनी शाखाओं के चारों ओर एडवेंटियल वसा और संयोजी ऊतक को सावधानीपूर्वक विच्छेदित और हटा दें।
नोट: चूंकि एन्यूरिज्म हाइपरलिपिडिमिया माउस में सूजन प्रमुख है, इसलिए एडवेंटिटिया को हटाना मुश्किल है। महाधमनी और महाधमनी शाखाओं को फाड़ने या निक न करने के लिए सावधान रहें। इस कदम के लिए अभ्यास और धैर्य की आवश्यकता होती है।
7. दिल और महाधमनी के फिक्सिंग (चित्रा 2 डी, ई)
- DPBS के 1x में 4% formaldehyde के 10 mL के साथ एक 10 mL सिरिंज तैयार करें। एक 25 जी सुई के साथ टोपी.
सावधानी: Formaldehyde खतरनाक है। इस रसायन के साथ काम करने से पहले MSDS पढ़ें। दस्ताने और सुरक्षा चश्मा पहनें और एक धुएं हुड के अंदर कमजोर पड़ने वाले समाधान का उत्पादन करें।
नोट: 4% formaldehyde समाधान समय के साथ degrades. निर्धारण के लिए ताजा निर्मित 4% फॉर्मेल्डिहाइड का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। - एपिकल बाएं वेंट्रिकुलर पंचर के माध्यम से संवहनी पेड़ को धीरे-धीरे 4% फॉर्मेल्डिहाइड के 10 मिलीलीटर इंजेक्ट करके ठीक करें।
नोट: Formaldehyde निर्धारण कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों, जैसे सेल संस्कृति, FACS विश्लेषण, और एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप करता है। महाधमनी इन अनुप्रयोगों में से किसी के लिए उपयोग किया जाएगा, तो इस चरण को छोड़ दें। - सामग्री को अवशोषित करने के लिए एक गैर-बुने हुए स्पंज के साथ किसी भी बाहरी तरल पदार्थ की छाती गुहा को साफ करें।
- चिमटी (स्टाइल 4) के साथ दिल को पकड़कर और माइक्रो-विच्छेदन वसंत कैंची का उपयोग करके महाधमनी से दिल को अलग करें।
नोट:: इस चरण के बाद एन फेस ऑयल रेड ओ स्टेनिंग करने के लिए, पूर्व विवो के बजाय सीटू में महाधमनी खोलने और अनुभाग 8 पर आगे बढ़ने की सिफारिश की जाती है। यह एन फेस महाधमनी के लिए फ्लैट रखना आसान बनाता है। - महाधमनी और इसके प्रमुख को कैरोटिड धमनी के ऊपर 1 मिमी से चिमटी (स्टाइल 4) और वसंत कैंची का उपयोग करके ऊरु धमनी के अंत तक अलग और एक्साइज करें।
- एक मोम पेट्री डिश या 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पोत को स्थानांतरित करें और 1x DPBS के साथ भरें जब तक कि यह महाधमनी को कवर न करे।
नोट:: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।
8. तेल लाल ओ धुंधला और खुला पूरा महाधमनी की इमेजिंग (चित्रा 3)
- एक मोम पेट्री पकवान पर पोत पिन minutien पिन (चित्रा 3A) का उपयोग कर पिन.
- 1x DPBS के साथ एक बार बर्तन कुल्ला.
- पेट्री डिश (चित्रा 3 बी) में ताजा तेल रेड ओ समाधान के 25 मिलीलीटर डालें।
नोट: (1) Isopropanol खतरनाक और एक ज्वलनशील तरल है। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें। (2) तेल लाल ओ समाधान आसानी से अवक्षेपित कर सकते हैं. अवक्षेपित कण बाद के दाग के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। उपयोग करने से पहले 0.45 μm फ़िल्टर के माध्यम से तेल लाल ओ समाधान को फ़िल्टर करके अवक्षेप को हटाना महत्वपूर्ण है। (3) ताजा तेल रेड ओ समाधान तैयार करना और किसी भी अप्रयुक्त समाधान को त्यागना सबसे अच्छा है। (4) तेल रेड ओ के अलावा, सूडान IV एक और रासायनिक यौगिक है जिसका उपयोग लिपिड, ट्राइग्लिसराइड्स और लिपोप्रोटीन के दाग के लिए किया जाता है। हालांकि, तेल लाल ओ ने धीरे-धीरे सूडान IV को बदल दिया है क्योंकि तेल लाल ओ द्वारा उत्पादित लाल रंग अधिक तीव्र है और इस प्रकार वसा को देखना बहुत आसान बना सकता है। - कमरे के तापमान (आरटी) पर 60 मिनट के लिए महाधमनी को दाग दें। तेल लाल ओ लिपिड युक्त पट्टिका लाल दाग देगा, जिससे अन्य गैर-पट्टिका युक्त क्षेत्रों को रंग में पीला छोड़ दिया जाएगा।
- आरटी पर 60% आइसोप्रोपेनॉल के साथ 20 मिनट के लिए एक बार धोएं।
नोट: ओवर-रिंसिंग पट्टिका destain कर सकते हैं. - isopropanol को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए dH2O के साथ महाधमनी 3x कुल्ला।
- एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, चिमटी (स्टाइल 4) और स्प्रिंग कैंची (चित्रा 3 सी, डी) का उपयोग करके महाधमनी के चारों ओर सभी पेरिवैस्कुलर वसा ऊतक को धीरे से साफ करें।
नोट: धुंधला होने के बाद महाधमनी और इसकी शाखाओं के आसपास के सभी पेरिवैस्कुलर वसा ऊतक को साफ करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि तेल लाल ओ-सना हुआ पेरिवैस्कुलर वसा ऊतक झूठी पृष्ठभूमि उत्पन्न कर सकता है और पट्टिका मॉर्फोमेट्री और पट्टिका क्षेत्र परिमाणीकरण के साथ हस्तक्षेप कर सकता है। सुनिश्चित करें कि महाधमनी की दीवार के एक हिस्से को न निकालें। मोम पकवान को dH2O के साथ भरें जब तक कि यह सफाई के दौरान दाग महाधमनी को कवर न करे। इस कदम के लिए अभ्यास और धैर्य की आवश्यकता होती है। - पोत को एक साफ, ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड में स्थानांतरित करें।
- एक प्रकाश माइक्रोस्कोप से जुड़े कैमरे का उपयोग करके डिजिटल माइक्रोग्राफ प्राप्त करें। उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियों को सहेजें, अधिमानतः टैग की गई छवि फ़ाइल प्रारूप (TIFF) (चित्रा 3E) में।
नोट:: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है। महाधमनी को सूखने से रोकने के लिए, पोत को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 1x DPBS से भरें जब तक कि यह महाधमनी को कवर न करे। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
9. एन चेहरा महाधमनी बढ़ते (चित्रा 4, चित्रा 5)
- एक मोम पेट्री पकवान के लिए पोत हस्तांतरण और 1x DPBS के साथ भरने जब तक यह महाधमनी को कवर.
- महाधमनी चाप और इलियाक धमनियों के कैरोटिड, सबक्लेवियन धमनियों को पेट की महाधमनी में विभाजित करने के बाद 1-2 मिमी विभाजित करें। वृक्क धमनियों को अलग करें। (चित्र 4A)
- अनुदैर्ध्य रूप से आंतरिक वक्रता (चित्रा 4B1) और अकेले इलियाक धमनियों (चित्रा 4B2) के साथ महाधमनी तैयारी को सूक्ष्म-विच्छेदन वसंत कैंची के साथ खोलता है।
- महाधमनी मेहराब की तीन शाखाओं को खोलें (यानी, innominate, बाएं आम कैरोटिड, बाएं सबक्लेवियन धमनी) अधिक वक्रता के साथ-साथ आंतरिक वक्रता (एक्स-मार्क) के आधार स्तर तक (चित्रा 4B3-B8) सूक्ष्म-विच्छेदन वसंत कैंची के साथ।
- मिनुटिन पिन के साथ एक मोम डिश में महाधमनी फ्लैट (लुमेन साइड फेस-अप) को पिन करें और 1x DPBS लागू करें जब तक कि यह महाधमनी को सूखने से रोकने के लिए कवर न करे (चित्रा 4 सी)।
नोट: (1) रोल्ड-अप महाधमनी को सपाट बनाना और इसे बिना खींचे चेहरे पर पिन करना महत्वपूर्ण है। एथेरोस्क्लेरोसिस की गंभीरता के आधार पर इस कदम में कुछ दिन लगेंगे। (2) Apoe-/- या Ldlr-/- जानवरों से महाधमनी के लिए, 24 घंटे के लिए महाधमनी फ्लैट को पिन करने की सिफारिश की जाती है( 3) प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है। - 70% इथेनॉल और नाजुक कार्य वाइपर (चित्रा 5 ए) के साथ ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड को साफ करें।
- एक साफ ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड में महाधमनी को स्थानांतरित करें और इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) यौगिक की 15 बूंदों को एक और साफ ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड (चित्रा 5 बी) पर रखें।
- महाधमनी पर OCT यौगिक के साथ कांच माइक्रोस्कोप स्लाइड को ध्यान से रखें और स्लाइड पर हवा के बुलबुले को फँसाने से बचें (चित्रा 5 C)।
- स्लाइड्स को नमूना नामों (चित्र 5D) के साथ लेबल करें.
नोट: घुड़सवार एन फेस महाधमनी स्लाइड को कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमी कक्ष में संग्रहीत किया जा सकता है।
10. इमेजिंग और एन चेहरा महाधमनी के घाव परिमाणीकरण (चित्रा 6)
- एक प्रकाश माइक्रोस्कोप से जुड़े कैमरे का उपयोग करके डिजिटल माइक्रोग्राफ प्राप्त करें। उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियों को सहेजें, अधिमानतः टैग की गई छवि फ़ाइल प्रारूप (TIFF) (चित्रा 6A) में।
- छविजे सॉफ्टवेयर के साथ सुसज्जित एक कंप्यूटर के लिए एन चेहरे दाग पूरे महाधमनी की छवियों को स्थानांतरित करें।
- ImageJ में, "फ्रीहैंड चयन" उपकरण का चयन करें और "Alt" कुंजी (Windows PC के लिए) या "Shift" कुंजी (मैक के लिए) दबाते समय सभी तेल लाल O-दाग पट्टिका को मैन्युअल रूप से (तीव्र लाल धब्बे) सर्कल करें। उसके बाद, परिणाम विंडो में घाव क्षेत्रों को प्रदर्शित करने के लिए "विश्लेषण" मेनू में "माप" क्लिक करें (चित्रा 6B बाईं ओर).
नोट: एथेरोस्क्लेरोटिक घावों के परिमाणीकरण के कई नुकसान हैं: (1) दाग वाले एडवेंटियल वसा के किसी भी छोटे टुकड़े जो चरण 8.7 से महाधमनी से जुड़े रहे, झूठी पृष्ठभूमि पैदा कर सकते हैं और पट्टिका परिमाणीकरण में हस्तक्षेप कर सकते हैं; (2) महाधमनी की दीवार के एक हिस्से को हटाने या चरण 6.4 और 8.7 से महाधमनी को नुकसान पहुंचाने से पट्टिका परिमाणीकरण में हस्तक्षेप हो सकता है; (3) बुलबुले और बढ़ते (चरण 9.8) के बाद महाधमनी में गठित सिलवटों पट्टिका परिमाणीकरण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं; और (4) एथेरोस्क्लेरोटिक पट्टिका एक 3 डी घटना है, और 2 डी विमान में किए गए माप पट्टिका की सही सीमा को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं। एन फेस महाधमनी पट्टिका क्षेत्र के विश्लेषण के अलावा, महाधमनी जड़, ब्रैकियोसेफेलिक धमनी, आरोही महाधमनी और पेट की महाधमनी में पट्टिका के आकार का अलग से विश्लेषण करने की सिफारिश की जाती है। - महाधमनी की बाहरी बॉर्डर लाइन को सर्कल करें और परिणाम विंडो (चित्रा 6B दाईं ओर) में महाधमनी क्षेत्र प्रदर्शित करने के लिए "विश्लेषण" मेनू में "माप" पर क्लिक करें।
- किसी Excel फ़ाइल में सभी माप निर्यात करें.
- कुल महाधमनी क्षेत्र से पट्टिका क्षेत्र के अनुपात की गणना करें और कुल तेल रेड ओ सतह क्षेत्र के प्रतिशत के रूप में मान को सामान्य करें।
- 8-10 Apoe-/- और 8–10 TGFπR2iSMC-Apoe चूहों में पट्टिका क्षेत्र के अनुपात की गणना कीजिये। SEM (चित्रा 6C) ± माध्य के रूप में डेटा प्रस्तुत करें।
- किसी अन्य माउस समूह की तुलना में पट्टिका क्षेत्र डेटा के अनुपात के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक अनपेयर्ड छात्र का टी-टेस्ट करें। पी < 0.05 पर महत्वपूर्ण के रूप में माध्य मानों में अंतर पर विचार करें।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल में, TGFπR2iSMC-Apoe चूहों में एथेरोस्क्लेरोटिक घावों का विश्लेषण HCHF diet7 पर 4 महीने के बाद किया गया था। व्यापक एथेरोस्क्लेरोसिस के अलावा, इन चूहों ने वक्षीय और पेट महाधमनी एन्यूरिज्म दोनों विकसित किए, जैसा कि पहले बताया गया था। Apoe-/- चूहों की तुलना में, TGFπR2iSMC-Apoe चूहों की महाधमनी दीवारों ने गंभीर एथेरोस्क्लेरोसिस दिखाया, जिससे घावों को विच्छेदन करना मुश्किल हो गया (चित्रा 2C, D, E)। इसके अलावा, एन्यूरिज्म विशेष रूप से सुपररेनल महाधमनी के नीचे व्यापक हैं, जो उन्नत मानव महाधमनी एन्यूरिज्म की अत्यधिक याद दिलाते हैं।
HCHFD-फेड TGFπR2iSMC-Apoe माउस से एक प्रतिनिधि unopened महाधमनी तेल लाल O धुंधला छवि चित्र 3E में दिखाया गया है। छवि एक TGFΠR2iSMC-Apoe माउस है कि दोनों आरोही और पेट महाधमनी धमनीविस्फार विकसित से पता चलता है, और यह महाधमनी शाखाओं में त्वरित atherosclerotic घाव गठन से पता चलता है (यहाँ, brachiocephalic धमनी, कैरोटिड धमनी, subclavian धमनियों, iliac धमनियों, ऊरु धमनियों, और गुर्दे धमनियों).
चित्रा 6A एन चेहरे तेल लाल ओ Apoe की धुंधला छवि से पता चलता है - / - और TGFπR2iSMC-Apoe चूहों की छवि. Apoe-/- समूह की तुलना में, TGFπR2iSMC-Apoe चूहों ने गंभीर एन्यूरिज्मल इज़ाफ़ा का प्रदर्शन किया और पूरे महाधमनी के विस्तार को चिह्नित किया।
चित्रा 1: विच्छेदन उपकरण प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: HCHF आहार पर माउस से महाधमनी के उच्छेदन के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल।
यह एक 24 सप्ताह पुराने TGFπR2iSMC-Apoe माउस से एक उच्च कोलेस्ट्रॉल उच्च वसा (HCHF) आहार पर 4 महीने के लिए खिलाया जाता है। (A) केटामाइन / जाइलीन संज्ञाहरण के तहत माउस। डैश्ड लाइनें इंगित करती हैं कि त्वचा को कहां काटना है। (बी) वक्ष और उदर गुहाओं को उजागर करने के लिए माउस का विच्छेदन। (सी) आंतरिक अंगों (यानी, फेफड़े, जिगर, प्लीहा, और जठरांत्र संबंधी और प्रजनन अंगों) को सावधानीपूर्वक हटाने के बाद एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत माउस महाधमनी के संपर्क में आते हैं। (d) महाधमनी के साथ संयोजी ऊतकों को यथासंभव सफाई से सावधानीपूर्वक हटाना। (ई) शाखाओं के साथ अलग-थलग पूरे महाधमनी की छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: खुला महाधमनी तेल लाल ओ धुंधला और इमेजिंग के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल।
(ए) एक मोम पेट्री डिश पर शाखाओं के साथ पूरे महाधमनी का पिनिंग। (बी) तेल लाल ओ धुंधला समाधान के साथ महाधमनी का कवर। (C) तेल लाल ओ धुंधला होने के बाद पूरे महाधमनी का चित्रण। (डी) सफाई के बाद तेल लाल ओ-दाग पूरे महाधमनी का चित्रण। (ई) एक HCHF आहार पर 4 महीने के बाद तेल लाल O-दाग पूरे महाधमनी TGF के प्रतिनिधि फोटोमाइक्रोग्राफR2iSMC-Apoe चूहों। (क') (ए) से आरोही महाधमनी की उच्च आवर्धन छवि, और (बी') (बी) से पेट की महाधमनी की उच्च आवर्धन छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: एन फेस महाधमनी तैयारी के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल।
(A, B) ऑयल रेड ओ के साथ सना हुआ धमनी पेड़ इमेजिंग के लिए महाधमनी को समतल करने के लिए अनुदैर्ध्य रूप से खोला जाता है। पोत की दीवार और संख्याओं के साथ बिंदीदार रेखाएं अनुक्रमिक कटौती का संकेत देती हैं जो जहाजों को खोलने के लिए बनाई जाती हैं। (सी) अनुदैर्ध्य रूप से विभाजित और एक वाई-आकार में एक मोम पेट्री डिश पर पूरे महाधमनी पिन किया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: एन फेस महाधमनी बढ़ते के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल।
(ए) 70% इथेनॉल के साथ ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड की कोमल सफाई और स्वच्छ प्रयोगशाला पोंछे के साथ सुखाने। (बी) एक ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड की सतह पर ओसीटी यौगिक का अनुप्रयोग, फिर दूसरे ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर एन फेस महाधमनी फ्लैट का प्रसार। (सी) एन फेस महाधमनी नमूने के शीर्ष पर ओसीटी यौगिक के साथ ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड का कोमल प्लेसमेंट। (D) नमूना नाम के साथ स्लाइड का लेबलिंग. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6: एन फेस महाधमनी इमेजिंग और एथेरोस्क्लेरोटिक घाव परिमाणीकरण के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल।
(ए) एक एचसीएचएफ आहार पर 4 महीने के बाद एपो-/- और टीजीएफ πR2iSMC-Apoe चूहों से एन फेस महाधमनी के माइक्रोफोटोग्राफ और तेल लाल ओ (बी) छवियों के साथ दाग एथेरोस्क्लेरोटिक घावों के कंप्यूटर-सहायता प्राप्त परिमाणीकरण के लिए प्रक्रिया को दर्शाते हुए। (C) घाव क्षेत्र परिमाणीकरण: % घाव क्षेत्र कुल महाधमनी सतह के % के रूप में तेल लाल ओ-दाग को संदर्भित करता है। SEM ± माध्य के रूप में दिखाए गए सभी डेटा (***p < 0.001; अनपेयर्ड दो-पूंछ वाले छात्र का टी-टेस्ट; एन = 9 एपो-/- चूहों के लिए और एन = 9 के लिए टीजीएफ के लिए ΠR2iSMC-Apoe चूहों)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| MYH11-Creert2 | 5'-TGA CCC CAT CTC TTC ACT CC-3' | |
| 5'-AAC TCC ACG ACC ACC TCA TC-3' | ||
| 5'-AGT CCC TCA CAT CCT CAG GTT-3' | ||
| Tgfbr2fl/fl | 5'-TAA ACA AGG TCC GGA GCC CA-3' | |
| 5'-ACT TCT GCA AGA GGT CCC CT-3' | ||
| Apoe | 5'-GCC टैग CCG AGG GAG AGC CG-3' | |
| 5'-TGT GAC TTG GGA GCT CTG CAG C-3' | ||
| 5'-जीसीसी जीसीसी सीसीजी अधिनियम जीसीए टीसीटी -3' | ||
तालिका 1: जीनोटाइपिंग प्राइमर।
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Discussion
एपोलिपोप्रोटीन ई (एपोई) और कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन रिसेप्टर (एलडीएलआर) की कमी वाले चूहे एथेरोस्क्लेरोसिस के विकास और उपचार का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हैं। जांचकर्ता एथेरोस्क्लेरोसिस से संबंधित बीमारियों की दीक्षा, प्रगति और प्रतिगमन पर आनुवांशिकी और चिकित्सीय जोड़तोड़ के प्रभाव का मूल्यांकन कर सकते हैं, जो पूरे महाधमनी 9 के तेल रेड ओ स्टेनिंग का उपयोग कर रहे हैं। महाधमनी तेल लाल ओ धुंधला और घाव परिमाणीकरण एथेरोस्क्लेरोसिस अनुसंधान के लिए सोने का मानक समापन बिंदु है। यह तकनीक सस्ती है और इसके लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, उच्च गुणवत्ता वाले तेल लाल ओ-दाग ऊतक प्राप्त करना आसान नहीं है। पूर्व अनुभव के आधार पर, इस प्रोटोकॉल में तीन महत्वपूर्ण चरण हैं, और पूरी प्रक्रिया के लिए अभ्यास और धैर्य की आवश्यकता होती है। पहला महत्वपूर्ण कदम महाधमनी और इसकी शाखाओं के चारों ओर सभी पेरिवैस्कुलर वसा ऊतकों को विच्छेदन, हटाने और साफ करने की क्षमता है, इससे पहले और बाद में तेल लाल ओ धुंधला (चित्रा 2 डी, चित्रा 3 सी, डी)। दूसरा महत्वपूर्ण कदम ताजा बनाया और फ़िल्टर किए गए तेल रेड ओ समाधान की तैयारी है। अंत में, यह महत्वपूर्ण है कि एन फेस महाधमनी ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड (चित्रा 4 सी, चित्रा 5 बी, सी) पर बढ़ने से पहले एक मोम डिश पर सपाट है।
अन्य तेल रेड ओ स्टेनिंग प्रोटोकॉल की तुलना में, यह विधि एक माउस से खुले महाधमनी और एन फेस महाधमनी में लिपिड-लदी सजीले टुकड़े के गुणात्मक और मात्रात्मक मूल्यांकन प्रदान करती है। खुला तेल रेड ओ धुंधला का प्रारंभिक गुणात्मक मूल्यांकन महाधमनी में पट्टिका वितरण और पट्टिका के आकार के बारे में एक सामान्य विचार प्रदान करता है, साथ ही एन फेस महाधमनी के परिमाणीकरण से पहले सभी शाखाओं को भी प्रदान करता है। अध्ययन की सीमाएं यह हैं कि (1) 2 डी तुलना और 3 डी एथेरोस्क्लेरोटिक सजीले टुकड़े का विश्लेषण एथेरोस्क्लेरोटिक पट्टिका की मात्रा की सही सीमा को प्रतिबिंबित नहीं करता है, (2) एथेरोस्क्लेरोटिक घाव परिमाणीकरण समय लेने वाला है, और (3) इसके लिए पशु बलि की आवश्यकता होती है।
महाधमनी को सफलतापूर्वक अलग करने के बाद, इसका उपयोग आणविक अध्ययन के लिए विभिन्न प्रकार के assays के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इसका उपयोग रेजनल महाधमनी आकृति विज्ञान 11 को चिह्नित करने के लिए बायोमैकेनिकल अध्ययन और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, उपयोगकर्ता कोशिका संस्कृति, FACS विश्लेषण और एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण विश्लेषण के लिए ताजा अलग-थलग पूरे महाधमनी से एंडोथेलियल कोशिकाओं और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं को अलग कर सकते हैं। संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल चूहों में एथेरोस्क्लेरोटिक बोझ का विश्लेषण करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रक्रिया प्रदान करता है। जांचकर्ता इस प्रोटोकॉल का उपयोग जानवरों के बीच एथेरोस्क्लेरोटिक घाव बहुतायत, स्थान और आकार की तुलना करने के लिए कर सकते हैं।
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Disclosures
लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
इस काम को भाग में, एनआईएच अनुदान P30AR070253 (P.-Y.C.), और HL135582 (एमएस) के तहत प्रदान किए गए एक संयुक्त जीव विज्ञान कंसोर्टियम माइक्रोग्रांट द्वारा समर्थित किया गया था। हम इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले चूहों को बनाए रखने के लिए आर वेबर और एल कून के आभारी हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | DENVILLE | C2170 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 16% Formaldehyde | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% ethanol | VWR | RC2546.70-5 | To clean the dissection tools |
| Black dissection wax | CR Scientific | C3541 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | Solvent for Tamoxifen |
| DNeasy Blood & Tissue kit | QIAGEN | 69506 | To isolate DNA from mouse ear |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| High cholesterol high fat diet | Research Diets | D12108 | To induce atherosclerosis |
| Imaging software | National Institutes of Health | Image J | Aortic lesion quantification |
| Isopropanol | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | To clean the glass microscope slides |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | ROBOZ | RS-5602 | To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches |
| Microscope control software | Olympus | DP Controller | For aorta imaging |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Needle-25G | BD | 305124 | |
| NonWoven Sponge | McKesson | 94442000 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | To stain the atherosclerosis lesions |
| Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane | VWR | 28143-312 | To filter working Oil Red O solution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | To dissect and clean the aorta |
| Statistical software | GraphPad | Prism 8 | Statical analysis |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | For aorta dissection |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | For aorta imaging |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | To induce Cre-loxP recombination |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Tweezer Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 0302-5-PO | To dissect and clean the aorta |
References
- Lusis, A. J.
- Emini Veseli, B., et al.
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71, 343-353 (1992).
- Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258, 468-471 (1992).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).
- Chen, P. Y., et al. Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms. Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).
- Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root. Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).
- Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences. Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).
