Beeldvorming Intranucleaire Actin Staven in Live Heat Stressed Drosophila Embryo's
Summary
Het doel van dit protocol is om Rhodamine-geconjugeerde bolvormige actine te injecteren in Drosophila embryo’s en beeld intranucleaire actine staaf assemblage na hitte stress.
Abstract
Het doel van dit protocol is om intranucleaire actinestaven te visualiseren die zich verzamelen in levende Drosophila melanogaster embryo’s na hittestress. Actin staven zijn een kenmerk van een geconserveerde, induceerbare Actin Stress Response (ASR) die gepaard gaat met menselijke pathologieën, waaronder neurodegeneratieve ziekte. Eerder toonden we aan dat de ASR bijdraagt aan morfogenesefalen en verminderde levensvatbaarheid van het ontwikkelen van embryo’s. Dit protocol maakt de voortdurende studie mogelijk van mechanismen die ten grondslag liggen aan actine staafassemblage en de ASR in een modelsysteem dat zeer vatbaar is voor beeldvorming, genetica en biochemie. Embryo’s worden verzameld en op een afdeklip gemonteerd om ze voor te bereiden op injectie. Rhodamine-geconjugeerde bolvormige actine (G-actineRed) wordt verdund en in een microneedle geladen. Een enkele injectie wordt gemaakt in het midden van elk embryo. Na injectie worden embryo’s geïncubeerd bij verhoogde temperatuur en intranucleaire actinestaven worden vervolgens gevisualiseerd door confocale microscopie. Fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP) experimenten kunnen worden uitgevoerd op de actinestaven; en andere actinerijke structuren in het cytoplasma kunnen ook in beeld worden We vinden dat G-actineRed polymeriseert als endogene G-actine en op zichzelf de normale embryoontwikkeling niet verstoort. Een beperking van dit protocol is dat er tijdens de injectie op moet worden gelet om ernstig letsel aan het embryo te voorkomen. Echter, met de praktijk, het injecteren van G-actineRood de Drosophila embryo’s is een snelle en betrouwbare manier om actine staven te visualiseren en kan gemakkelijk worden gebruikt met vliegen van elk genotype of met de introductie van andere cellulaire spanningen, waaronder hypoxie en oxidatieve stress.
Introduction
Dit protocol beschrijft hoe G-actineRood te injecteren om de assemblage van intranucleaire actine staven in hitte-gestresste embryo’s die een induceerbare Actin Stress Response (ASR)ondergaan visualiseren 1. We ontwikkelden dit protocol ter ondersteuning van studies van de ASR, die in embryo’s leidt tot verstoorde morfogenese en verminderde levensvatbaarheid, en bij volwassen menselijke celtypen wordt geassocieerd met pathologieën zoals nierfalen2, spier myopathieën3, en Alzheimer en De Ziekte van Huntington4,5,6,7,8. Deze ASR wordt veroorzaakt door talrijke cellulaire spanningen, waaronder hitteschok9,10,11,oxidatieve stress4,6, verminderde ATP-synthese12, en abnormale Huntingtine of β-amyloïde oligomerisatie4,5,6,7,9,13,14,15,16. Een kenmerk van de ASR is de assemblage van afwijkende actinestaven in het cytoplasma of de kern van aangetaste cellen, die wordt aangedreven door stress-geïnduceerde hyperactivatie van een actine interacterend eiwit, Cofilin1,5,6,10. Helaas blijven er belangrijke kennislacunes bestaan met betrekking tot de ASR. De functie van de actinestaven is bijvoorbeeld niet bekend. We begrijpen niet waarom staven zich vormen in het cytoplasma van sommige celtypen, maar de kern van anderen. Het is ook niet duidelijk of de ASR beschermend of onaantastelijk is voor cellen of embryo’s die stress ervaren. Tot slot kennen we nog steeds niet de gedetailleerde mechanismen die ten grondslag liggen aan Cofilin hyperactivatie of actine staafassemblage. Dit protocol biedt dus een snelle en veelzijdige test om de ASR te onderzoeken door actine staafvorming en dynamiek in het zeer tracteerbare experimentele systeem van het levende fruitvliegembryo te visualiseren.
Het protocol om G-actineRed te micro-injecteren in levende Drosophila-embryo’s werd aanvankelijk ontwikkeld om de dynamiek van normale cytoplasmatische actinestructuren17 te bestuderen tijdens weefselopbouwgebeurtenissen. In die studies ontdekten we dat G-actineRode injectie geen negatieve invloed had op vroege ontwikkelingsprocessen in het embryo, waaronder cytokinese of gastrulatie17,18. Vervolgens hebben we het protocol gewijzigd, waarbij we de embryobehandeling en G-actineRed-injectie hebben aangepast om beeldvorming van actinestaven in hittebelaste embryo’s die de ASR1ondergaan mogelijk te maken. Andere methoden naast G-actineRode injectie kunnen worden gebruikt om actine in embryo’s te visualiseren. Deze methoden zijn gebaseerd op het uitdrukken van fluorescerende eiwitten (FPs) die zijn getagd op actine of op domeinen van actinebindende eiwitten, zoals Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP en Moesin-GFP (herzien in19). Het gebruik van deze FP-sondes vereist echter voorzichtigheid, omdat ze sommige actinestructuren kunnen stabiliseren of verstoren, niet alle actinestructuren gelijk labelen20, en in het geval van actin-GFP, zeer overexpressie hebben – problematisch voor de analyse van staafassemblage die niet alleen stressafhankelijk is, maar ook actineconcentratieafhankelijk1. Zo is G-actinRed de voorkeursonde voor staafstudies in vliegenembryo’s, en de grote omvang van het embryo maakt de eenvoudige injectie mogelijk.
De workflow van dit protocol is vergelijkbaar met andere gevestigde micro-injectietechnieken die zijn gebruikt voor het injecteren van eiwitten, nucleïnezuren, geneesmiddelen en fluorescerende indicatoren in Drosophila-embryo ‘s21,22,23,24,25,26,27. Echter, na de micro-injectie van G-actineRood hier, embryo’s worden blootgesteld aan milde hitte stress om de ASR en intranucleaire actine staaf assemblage te induceren. Voor laboratoria met toegang tot vliegen en een injectieplatform moet deze methode gemakkelijk uitvoerbaar en aanpasbaar zijn voor specifieke studielijnen met betrekking tot de ASR, met inbegrip van de inductie ervan door verschillende spanningen of modulatie in verschillende genetische achtergronden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het belang van deze methode is dat het gebruik maakt van het gevestigde protocol van micro-injectie in Drosophila embryo’s21,22,23,24,25,26,27 om nieuw onderzoek met betrekking tot de ASR en de bijbehorende actin staaf assemblage mogelijk te maken. Een groot voordeel van het injecte…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen dankbaar het werk van Liuliu Zheng en Zenghui Xue, die deze techniek hielpen pionieren in het Sokac-lab, evenals Hasan Seede die hielp met de analyse. Het werk voor deze studie wordt gefinancierd door een subsidie van NIH (R01 GM115111).
Materials
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Component of G buffer |
| Apple juice, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Component of apple juice plates |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Component of apple juice plates |
| Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite | KIK International | 059647210020 | For dechorionating embryos |
| Calcium chloride | Millipore-Sigma | C1016500G | Component of G buffer |
| Cell strainer, 70 μm | Falcon | 352350 | For collecting dechorionated embryos |
| Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | For imaging intranuclear actin rods |
| Desiccant | Drierite | 24001 | For desiccating embryos |
| Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom | Zeiss | 4350649000000 | For arranging embryos on agar wedge |
| Dissecting needle, 5 in | Fisher Scientific | 08965A | For arranging embryos on agar wedge |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Component of G buffer |
| Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in | 3M | 021200010323 | For making embryo glue |
| Embryo collection cage | Genessee Scientific | 59100 | For housing adult flies and collecting embryos |
| Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72701D | For arranging embryos on agar wedge |
| Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | For microneedles |
| Halocarbon oil 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | For hydration of embryos |
| Heated stage incubator | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | For confocal imaging |
| Lab Tissue Wipers, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Lab tissue wipers |
| Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished | Zeiss | Discontinued | Injection microscope |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Millipore-Sigma | H36471KG | Component of apple juice plates |
| Microinjector, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Microinjector |
| Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL | Eppendorf | 5242956003 | For loading microneedles |
| Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Custom | For performing microinjections |
| Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | For pulling capillary tubes to make microneedles |
| Microscope cover glass 24×50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | For mounting embryos |
| Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | For mounting embryos for injection |
| n-Heptane | Fisher Scientific | H3601 | Component of embryo glue |
| Objective, 10x | Zeiss | Discontinued | 10x objective for injection microscope |
| Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | 40x water objective for confocal |
| Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) | Zeiss | 4208529871000 | 25x mixed immersion objective for confocal |
| Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x oil objective for confocal |
| Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | For transferring embryos |
| Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white | Kimberly-Clark | 884266344845 | For blotting cell strainer |
| Pasteur pipette, 5 3/4 in | Fisher Scientific | 1367820A | For covering embryos with oil |
| Petri dish, glass, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | For humid incubation chamber |
| Petri dish, plastic, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | For apple juice plates |
| Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL | Eppendorf | 2231000604 | For loading the microneedle |
| Pipette tip, xTIP4 250 μL | Biotix | 63300006 | For adding embryo glue to coverslip |
| Razor blade | VWR | 55411050 | For cutting agar wedge, tape, pipette tips |
| Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4×10 μg) | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | G-actin^Red |
| Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps | Fisher Scientific | 033377 | For making embryo glue |
| Screw top jar, 16 oz | Nalgene | 000194414195 | For desiccating embryos |
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 602104PG | For calibrating volume of G-actin injection |
| Sucrose | Millipore-Sigma | 840971KG | Component of apple juice plates |
| Trizma base | Millipore-Sigma | T15031KG | Component of G buffer |
| Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz | Lesaffre Yeast Corporation | 117929157002 | Component of yeast paste |
References
- Figard, L., et al. Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos. Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).
- Ashworth, S. L., et al. ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion. American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).
- Vandebrouck, A., et al. In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).
- Bamburg, J. R., et al. ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases. Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).
- Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress. Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).
- Iida, K., Iida, H., Yahara, I. Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells. Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).
- Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).
- Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin. Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).
- Minamide, L. S., et al. Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods. Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).
- Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons. The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).
- Feldman, M. L., Peters, A. Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus. Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).
- Nishida, E., et al. Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells. Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).
- Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).
- Xue, Z., Sokac, A. M. Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage. The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).
- Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Biologie du développement. 393 (2), 209-226 (2014).
- Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. Formins filter modified actin subunits during processive elongation. Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (50), 2477 (2011).
- Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 81, 50750 (2013).
- Carreira-Rosario, A., et al. Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (77), 50346 (2013).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo. Journal of Visualized Experiments. (31), 1382 (2009).
- Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers. Journal of Visualized Experiments. (148), 58545 (2019).
- Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology. Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).
- Mollinari, C., González, A., Cid-Arregui, A., García-Carrancá, Microinjection and transgenesis. Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. , 587-603 (1998).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (49), 2503 (2011).
- Oesterle, A. . Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers. , (2018).
- Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).
- Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing. Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).
