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Abstract
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Biologie du développement

ライブ熱ストレスショ ウジョウバエ 胚における核内アクチンロッドのイメージング

Published: May 15, 2020
doi:
10.3791/61297
, ,
1Integrative Molecular and Biomedical Sciences,Baylor College of Medicine, 2Department of Cell and Molecular Biology, School of Molecular and Cellular Biology,University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology,Baylor College of Medicine

Summary

このプロトコルの目的は、熱ストレスに続いて、ショ ウジョウバエ 胚および画像核内アクチン棒集合体にローダミン共役球状アクチンを注入することです。

Abstract

このプロトコルの目的は、熱ストレスに続く生きたショウジョウバエメラノガスター胚に集まり、核内アクチン棒を可視化することです。アクチンロッドは、神経変性疾患を含むヒト病理に付随する保存された誘導アクチンストレス応答(ASR)の特徴である。以前は、ASRが形態形成の失敗と胚の発達の生存率の低下に寄与することを示した。このプロトコルは、イメージング、遺伝学および生化学に非常に適したモデルシステムにおけるアクチンロッドアセンブリおよびASRの基礎となるメカニズムの継続的な研究を可能にする。胚は回収され、注入のためにそれらを準備するためにカバースリップに取り付けられる。ローダミン共役球状アクチン(G-アクチンレッド)を希釈し、マイクロニードルに装填する。各胚の中心に1回の注射が行われる。注射後、胚は高温でインキュベートされ、核内アクチン棒は共焦点顕微鏡で視覚化される。光漂白(FRAP)実験後の蛍光回復はアクチン棒に対して行われ得る。細胞質中のアクチンが豊富なその他の構造も画像化することができる。我々は、G-アクチンレッドが内因性G-アクチンのように重合し、単独では正常な胚の発達を妨げないことを発見した。このプロトコルの1つの制限は、胚への重大な傷害を避けるために注射中に注意を払わなければならないということです。しかし、練習では、ショウジョウバエ胚にG-actinRedを注入することは、アクチンロッドを視覚化するための迅速かつ信頼性の高い方法であり、任意の遺伝子型のハエや低酸素症や酸化ストレスを含む他の細胞ストレスの導入で簡単に使用することができます。

Introduction

このプロトコルは、誘導アクチンストレス応答(ASR)1を受けている熱ストレス胚における核内アクチン棒の集合体を可視化するためにG-アクチンレッドを注入する方法を説明する。我々は、胚において形態形成の破壊および生存率の低下をもたらすASRの研究を支援するためにこのプロトコルを開発し、成人のヒト細胞型は腎不全2、筋筋筋症3、アルツハイマー病およびハンチントン病4、5、6、7、8を含む病理に関連している。このASRは、ヒートショック9、10、11、酸化ストレス4、6、および異常ハンチンチンまたはβアミロイドオリゴマー化4、5、6、7、9、13、14、15、16を含む多数の細胞ストレスによって誘発される。ASRの特徴は、アクチン相互作用タンパク質のストレス誘発過活性化によって駆動される細胞質または影響を受ける細胞の核のいずれかに異常なアクチン棒の組み立てであり、Cofilin1、5、6、10。残念ながら、ASRに関する重要な知識のギャップは残っています。例えば、アクチン棒の機能は知られていない。私たちは、いくつかの細胞型の細胞質にロッドが形成される理由を理解していないが、他の人の核。また、ASRがストレスを受けている細胞や胚に対して保護的または不適応であるかどうかも明らかではない。最後に、コフィリンの過剰活性化やアクチンロッドアセンブリの根底にある詳細なメカニズムはまだ分かりません。したがって、このプロトコルは、生きたフルーツフライ胚の非常に難しい実験システムにおけるアクチンロッド形成およびダイナミクスを視覚化することによってASRを探査するための迅速かつ汎用性の高いアッセイを提供する。

生きているショウジョウバエ胚にG-アクチンレッドをマイクロインジェクトするプロトコルは、組織構築イベント中に正常な細胞質アクチン構造17のダイナミクスを研究するために最初に開発された。これらの研究では、G-アクチンレッド注射は、サイトカネシスまたは胃の17、18を含む胚の初期の発達過程に悪影響を及ぼさないことを発見した。その後、プロトコルを変更し、ASR1を受けている熱ストレス胚のアクチンロッドのイメージングを可能にするために、胚処理およびG-アクチンレッド注入を適応させる。G-アクチン赤注射以外の他の方法は、胚中のアクチンを視覚化するために使用することができる。これらの方法は、アクチンまたはウトロフィン-mCherry、ライフアクト、F-トラチンGFP、およびモージンGFPなどのアクチン結合タンパク質のドメインにタグ付けされた蛍光タンパク質(FP)を発現させることに依存している(19でレビュー)。しかし、これらのFPプローブを使用すると、いくつかのアクチン構造を安定または破壊する可能性があるため注意が必要であり、すべてのアクチン構造20に等しくラベルを付け、アクチンGFPの場合は、応力依存だけでなくアクチン濃度依存性のロッドアセンブリの分析に問題がある。したがって、G-アクチンレッドは、フライ胚のロッド研究のための好ましいプローブであり、胚の大きなサイズは、その容易な注射を可能にする。

このプロトコルのワークフローは、ショウジョウバエ胚21、22、23、24、25、26、27にタンパク質、核酸、薬物、および蛍光指標を注入するために使用されてきた他の確立されたマイクロインジェクション技術に似ています。しかし、ここでのG-アクチンレッドのマイクロインジェクションに続いて、胚は、ASRおよび核内アクチン棒集合体を誘導するために軽度の熱ストレスにさらされる。ハエや注入リグにアクセスできるラボでは、異なるストレスによる誘導や、異なる遺伝的背景での変調など、ASRに関する特定の研究ラインに対して、この方法を容易に実装し、適応可能にする必要があります。

Protocol

1. 胚コレクションカップとリンゴジュース寒天プレートを準備する 注射実験の5日前に、28 を構築するか、または少なくとも2つの小さな胚採取カップを調達する。小さなコレクションカップ28で使用される新鮮な60ミリメートルリンゴジュース寒天プレートを作ります。4°Cで湿ったペーパータオルで覆われたプラスチック製の箱にプレートを保管し?…

Representative Results

胚処理の概略的なワークフローを 図 1に示し、代表的な実験のタイムテーブルを 表 1に示します。良好な実験結果の推定は、注入された10個の胚ごとに、見られる胚の少なくとも半分が正しい発達段階にあり、損傷を受けておらず、32°Cの熱ストレスを伴う堅牢なASRを示すということです。 このASRは、 図2A( 右パネル)の胚の代表的な表…

Discussion

この方法の意義は、ショウジョウバエ胚21、22、23、24、25、26、27におけるマイクロインジェクションの確立されたプロトコルを利用して、ASRおよび付随するアクチンロッドアセンブリに関する新しい研究を可能にすることです。<s…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、ソカック研究所でこの技術のパイオニアを助けたリリウ・ジェンとゼングイ・シューと、分析を支援したハサン・シーデの作品を感謝して認めている。この研究のための仕事はNIHからの助成金によって資金を提供される(R01 GM115111)。

Materials

Adenosine triphosphate (ATP) Millipore-Sigma A23835G Component of G buffer
Apple juice, Mott's, 64 fl oz Mott's 014800000344 Component of apple juice plates
Bacto Agar BD 214010 Component of apple juice plates
Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite KIK International 059647210020 For dechorionating embryos
Calcium chloride Millipore-Sigma C1016500G Component of G buffer
Cell strainer, 70 μm Falcon 352350 For collecting dechorionated embryos
Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan Zeiss 0000001994956 For imaging intranuclear actin rods
Desiccant Drierite 24001 For desiccating embryos
Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom Zeiss 4350649000000 For arranging embryos on agar wedge
Dissecting needle, 5 in Fisher Scientific 08965A For arranging embryos on agar wedge
Dithiothreitol (DTT) Fisher Scientific BP1725 Component of G buffer
Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in 3M 021200010323 For making embryo glue
Embryo collection cage Genessee Scientific 59100 For housing adult flies and collecting embryos
Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 Electron Microscopy Sciences 72701D For arranging embryos on agar wedge
Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm World Precision Instruments, Inc. TW1004 For microneedles
Halocarbon oil 27 Millipore-Sigma H8773100ML For hydration of embryos
Heated stage incubator Zeiss 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 For confocal imaging
Lab Tissue Wipers, KimWipes Kimberly-Clark 34155 Lab tissue wipers
Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished Zeiss Discontinued Injection microscope
Methyl-4-hydroxybenzoate Millipore-Sigma H36471KG Component of apple juice plates
Microinjector, FemtoJet4x Eppendorf 5253000025 Microinjector
Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL Eppendorf 5242956003 For loading microneedles
Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) Custom For performing microinjections
Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown Sutter Instruments P97 For pulling capillary tubes to make microneedles
Microscope cover glass 24×50-1.5 Fisher Scientific 12544E For mounting embryos
Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm Fisher Scientific 22037081 For mounting embryos for injection
n-Heptane Fisher Scientific H3601 Component of embryo glue
Objective, 10x Zeiss Discontinued 10x objective for injection microscope
Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS Zeiss 4217679971711 40x water objective for confocal
Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) Zeiss 4208529871000 25x mixed immersion objective for confocal
Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA Zeiss 4207829900799 63x oil objective for confocal
Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 Daler-Rowney 038372016954 For transferring embryos
Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white Kimberly-Clark 884266344845 For blotting cell strainer
Pasteur pipette, 5 3/4 in Fisher Scientific 1367820A For covering embryos with oil
Petri dish, glass, 100 x 20 mm Corning 3160102 For humid incubation chamber
Petri dish, plastic, 60 x 15 mm VWR 25384092 For apple juice plates
Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL Eppendorf 2231000604 For loading the microneedle
Pipette tip, xTIP4 250 μL Biotix 63300006 For adding embryo glue to coverslip
Razor blade VWR 55411050 For cutting agar wedge, tape, pipette tips
Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4×10 μg) Cytoskeleton, Inc. APHR-A G-actin^Red
Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps Fisher Scientific 033377 For making embryo glue
Screw top jar, 16 oz Nalgene 000194414195 For desiccating embryos
Stage micrometer Electron Microscopy Sciences 602104PG For calibrating volume of G-actin injection
Sucrose Millipore-Sigma 840971KG Component of apple juice plates
Trizma base Millipore-Sigma T15031KG Component of G buffer
Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz Lesaffre Yeast Corporation 117929157002 Component of yeast paste
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Keywords: Intranuclear Actin RodsLive Heat Stressed Drosophila EmbryosMicroinjectionActin Stress ResponseActin Rod AssemblyMutant ScreenStress ConditionsEmbryo HandlingEmbryo PositioningEmbryo MountingG-actin RedApple Juice AgarDechorionationEmbryo TransferEmbryo AlignmentEmbryo GlueCoverslip Mounting
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Citer Cet Article
Biel, N., Figard, L., Sokac, A. M. Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (159), e61297, doi:10.3791/61297 (2020).
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