Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Published: May 15, 2020

doi:

Natalie Biel², Lauren Figard, Anna Marie Sokac^2,3

¹Integrative Molecular and Biomedical Sciences,Baylor College of Medicine, ²Department of Cell and Molecular Biology, School of Molecular and Cellular Biology,University of Illinois at Urbana-Champaign, ³Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology,Baylor College of Medicine

Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist es, Rhodamine-konjugiertes Kugelaktin in Drosophila-Embryonen zu injizieren und die intranukleare Aktinstabsmontage nach Hitzestress abzubilden.

Abstract

Der Zweck dieses Protokolls ist es, intranukleare Aktinstäbe zu visualisieren, die sich in lebenden Drosophila melanogaster Embryonen nach Hitzestress zusammensetzen. Actin-Stäbe sind ein Kennzeichen einer konservierten, induktiven Actin Stress Response (ASR), die menschliche Pathologien begleitet, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen. Zuvor haben wir gezeigt, dass die ASR zu Morphogenese-Ausfällen und einer verminderten Lebensfähigkeit der sich entwickelnden Embryonen beiträgt. Dieses Protokoll ermöglicht die kontinuierliche Untersuchung der Mechanismen, die der Aktinstabbaugruppe und der ASR in einem Modellsystem zugrunde liegen, das sehr bildgebend, genetisch und biochemie geeignet ist. Embryonen werden gesammelt und auf einem Deckslip montiert, um sie für die Injektion vorzubereiten. Rhodamine-konjugiertes Kugelaktin (G-Actin^Red) wird verdünnt und in eine Mikronadel geladen. Eine einzige Injektion erfolgt in das Zentrum jedes Embryos. Nach der Injektion werden Embryonen bei erhöhter Temperatur inkubiert und intranukleare Aktinstäbe werden dann durch konfokale Mikroskopie visualisiert. Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleichung (FRAP) Experimente können an den Aktinstäben durchgeführt werden; und andere aktinreiche Strukturen im Zytoplasma können ebenfalls abgebildet werden. Wir stellen fest, dass G-Actin^Red wie endogenes G-Actin polymerisiert und allein nicht die normale Embryoentwicklung beeinträchtigt. Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass während der Injektion Vorsicht geboten ist, um eine schwere Verletzung des Embryos zu vermeiden. Jedoch, mit der Praxis, Injektion von G-Actin^Rot de Drosophila Embryonen ist eine schnelle und zuverlässige Möglichkeit, Aktin-Stäbe zu visualisieren und kann leicht mit Fliegen jeder Art oder mit der Einführung von anderen zellulären Spannungen verwendet werden, einschließlich Hypoxie und oxidativen Stress.

Introduction

Dieses Protokoll beschreibt, wie Man G-Actin^Red injizieren, um die Montage von intranuklearen Aktinstäben in wärmebelasteten Embryonen zu visualisieren, die sich einer induzierbaren Actin-Stressreaktion (ASR)¹unterziehen. Wir entwickelten dieses Protokoll, um Studien der ASR zu unterstützen, die bei Embryonen zu gestörter Morphogenese und verminderter Lebensfähigkeit führt, und bei erwachsenen menschlichen Zelltypen ist mit Pathologien wie Nierenversagen², Muskelmyopathien³und Alzheimer und Huntington⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸verbunden. Dieser ASR wird durch zahlreiche zelluläre Spannungen induziert, einschließlich Hitzeschock⁹^,¹⁰^,¹¹, oxidativer Stress⁴^,⁶, reduzierte ATP-Synthese¹², und abnormale Huntingtin oder β-Amyloid-Oligomerisierung⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁹^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶. Ein Markenzeichen der ASR ist die Montage von abnormen Aktinstäben im Zytoplasma oder Kern der betroffenen Zellen, die durch stressinduzierte Hyperaktivierung eines Aktin-interagierenden Proteins, Cofilin¹^,⁵^,⁶^,¹⁰angetrieben wird. Leider bestehen nach wie vor wesentliche Wissenslücken in Bezug auf die ASR. Beispielsweise ist die Funktion der Aktinstäbe nicht bekannt. Wir verstehen nicht, warum Sichstäbe im Zytoplasma einiger Zelltypen bilden, aber der Kern anderer. Es ist auch nicht klar, ob die ASR für Zellen oder Embryonen, die sich stressfähig befinden, schützend oder maladaptiv ist. Schließlich kennen wir immer noch nicht die detaillierten Mechanismen, die der Cofilin-Hyperaktivierung oder Aktinstab-Montage zugrunde liegen. Somit bietet dieses Protokoll einen schnellen und vielseitigen Test zur Untersuchung des ASR, indem es die Aktinstabbildung und -dynamik im hochgradig beziehbaren Versuchssystem des lebenden Fruchtfliegenembryons visualisiert.

Das Protokoll zur Mikroinjektion von G-Actin^Red in lebende Drosophila-Embryonen wurde ursprünglich entwickelt, um die Dynamik normaler zytoplasmatischer Aktinstrukturen¹⁷ während gewebebildender Ereignisse zu untersuchen. In diesen Studien fanden wir heraus, dass die G-Actin-Rot-Injektion die frühen Entwicklungsprozesse im Embryo, einschließlich Zytokinese oder Gastrulation¹⁷^, ¹⁸, nicht beeinträchtigte. Wir modifizierten dann das Protokoll, passten die Embryo-Handhabung und G-Actin^Red Injektion an, um die Bildgebung von Aktinstäben in wärmebelasteten Embryonen zu ermöglichen, die sich dem ASR¹unterziehen. Andere Methoden neben G-Actin^Rote Injektion kann verwendet werden, um Actin in Embryonen zu visualisieren. Diese Methoden basieren auf der Exdinsiz fluoreszierender Proteine (FPs), die mit Actin oder Domänen von Actin-bindenden Proteinen wie Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP und Moesin-GFP (rezensiert in¹⁹) markiert sind. Die Verwendung dieser FP-Sonden erfordert jedoch Vorsicht, da sie einige Aktinstrukturen stabilisieren oder stören können, nicht alle Aktinstrukturen²⁰gleich kennzeichnen und im Falle von Actin-GFP stark überexprimiert werden – problematisch für die Analyse der Stabmontage, die nicht nur stressabhängig, sondern auch aktinkonzentrationsabhängig^{ist 1}. Somit ist G-Actin^Red die bevorzugte Sonde für Stabstudien an Fliegenembryonen, und die große Größe des Embryos ermöglicht seine einfache Injektion.

Der Arbeitsablauf dieses Protokolls ähnelt anderen etablierten Mikroinjektionstechniken, die zur Injektion von Proteinen, Nukleinsäuren, Medikamenten und fluoreszierenden Indikatoren in Drosophila-Embryonen ²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷verwendet wurden. Nach der Mikroinjektion von G-Actin^Red sind Embryonen jedoch leichtem Hitzestress ausgesetzt, um die ASR- und intranukleare Aktinstab-Montage zu induzieren. Für Labore mit Zugang zu Fliegen und einem Injektionssystem sollte diese Methode für bestimmte Studienlinien in Bezug auf die ASR leicht umsetzbar und anpassungsfähig sein, einschließlich ihrer Induktion durch unterschiedliche Spannungen oder Modulation in unterschiedlichen genetischen Hintergründen.

Protocol

1. Bereiten Sie Embryo-Sammelbecher und Apfelsaft-Agar-Platten vor Fünf Tage vor dem Injektionsexperiment28 konstruieren oder mindestens zwei kleine Embryo-Entnahmebecher beschaffen. Machen Sie frische 60 mm Apfelsaft Agar Teller mit kleinen Sammelbechern28verwendet werden. Platten in Plastikboxen lagern, die mit feuchten Papiertüchern bei 4 °C bedeckt sind.HINWEIS: Kleine Embryo-Entnahmebecher, die mit Fliegenzahlen bestückt sind, wie in Schritt 1.3 besch…

Representative Results

In Abbildung 1ist ein schematischer Arbeitsablauf für die Handhabung von Embryonen dargestellt, und in Tabelle 1ist ein Zeitplan für ein typisches Experiment dargestellt. Eine Schätzung für ein gutes experimentelles Ergebnis ist, dass auf 10 injizierte Embryonen mindestens die Hälfte der betrachteten Embryonen im richtigen Entwicklungsstadium sein wird, unbeschädigt, und eine robuste ASR mit Hitzespannung bei 32 °C aufweisen. Diese ASR wird durch die Montage von intr…

Discussion

Die Bedeutung dieser Methode ist, dass sie das etablierte Protokoll der Mikroinjektion in Drosophila-Embryonen ²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷ nutzt, um neue Forschungen in Bezug auf die ASR und die begleitende Aktinstabmontage zu ermöglichen. Ein großer Vorteil der Injektion von G-Actin<sup…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren würdigen die Arbeit von Liuliu Zheng und Zenghui Xue, die diese Technik im Sokac-Labor mitvorangetrieben haben, sowie Hasan Seede, der bei der Analyse mitgeholfen hat. Die Arbeit für diese Studie wird durch ein Stipendium des NIH (R01 GM115111) finanziert.

Materials

Adenosine triphosphate (ATP)	Millipore-Sigma	A23835G	Component of G buffer
Apple juice, Mott's, 64 fl oz	Mott's	014800000344	Component of apple juice plates
Bacto Agar	BD	214010	Component of apple juice plates
Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite	KIK International	059647210020	For dechorionating embryos
Calcium chloride	Millipore-Sigma	C1016500G	Component of G buffer
Cell strainer, 70 μm	Falcon	352350	For collecting dechorionated embryos
Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan	Zeiss	0000001994956	For imaging intranuclear actin rods
Desiccant	Drierite	24001	For desiccating embryos
Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom	Zeiss	4350649000000	For arranging embryos on agar wedge
Dissecting needle, 5 in	Fisher Scientific	08965A	For arranging embryos on agar wedge
Dithiothreitol (DTT)	Fisher Scientific	BP1725	Component of G buffer
Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in	3M	021200010323	For making embryo glue
Embryo collection cage	Genessee Scientific	59100	For housing adult flies and collecting embryos
Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5	Electron Microscopy Sciences	72701D	For arranging embryos on agar wedge
Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm	World Precision Instruments, Inc.	TW1004	For microneedles
Halocarbon oil 27	Millipore-Sigma	H8773100ML	For hydration of embryos
Heated stage incubator	Zeiss	4118579020000, 4118609020000, 4118609010000	For confocal imaging
Lab Tissue Wipers, KimWipes	Kimberly-Clark	34155	Lab tissue wipers
Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished	Zeiss	Discontinued	Injection microscope
Methyl-4-hydroxybenzoate	Millipore-Sigma	H36471KG	Component of apple juice plates
Microinjector, FemtoJet4x	Eppendorf	5253000025	Microinjector
Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL	Eppendorf	5242956003	For loading microneedles
Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment	Bernard Instruments, Inc (Houston, TX)	Custom	For performing microinjections
Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown	Sutter Instruments	P97	For pulling capillary tubes to make microneedles
Microscope cover glass 24×50-1.5	Fisher Scientific	12544E	For mounting embryos
Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm	Fisher Scientific	22037081	For mounting embryos for injection
n-Heptane	Fisher Scientific	H3601	Component of embryo glue
Objective, 10x	Zeiss	Discontinued	10x objective for injection microscope
Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS	Zeiss	4217679971711	40x water objective for confocal
Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm)	Zeiss	4208529871000	25x mixed immersion objective for confocal
Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA	Zeiss	4207829900799	63x oil objective for confocal
Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2	Daler-Rowney	038372016954	For transferring embryos
Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white	Kimberly-Clark	884266344845	For blotting cell strainer
Pasteur pipette, 5 3/4 in	Fisher Scientific	1367820A	For covering embryos with oil
Petri dish, glass, 100 x 20 mm	Corning	3160102	For humid incubation chamber
Petri dish, plastic, 60 x 15 mm	VWR	25384092	For apple juice plates
Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL	Eppendorf	2231000604	For loading the microneedle
Pipette tip, xTIP4 250 μL	Biotix	63300006	For adding embryo glue to coverslip
Razor blade	VWR	55411050	For cutting agar wedge, tape, pipette tips
Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4×10 μg)	Cytoskeleton, Inc.	APHR-A	G-actin^Red
Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps	Fisher Scientific	033377	For making embryo glue
Screw top jar, 16 oz	Nalgene	000194414195	For desiccating embryos
Stage micrometer	Electron Microscopy Sciences	602104PG	For calibrating volume of G-actin injection
Sucrose	Millipore-Sigma	840971KG	Component of apple juice plates
Trizma base	Millipore-Sigma	T15031KG	Component of G buffer
Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz	Lesaffre Yeast Corporation	117929157002	Component of yeast paste

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Citer Cet Article

Biel, N., Figard, L., Sokac, A. M. Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (159), e61297, doi:10.3791/61297 (2020).