אפיון של מאפייני תחבורה תוך סחוס של ספקי פפטיד צ'ציה
Summary
פרוטוקול זה קובע ספיגת שיווי משקל, עומק חדירה וקצב דיפוזיה ללא שיווי משקל עבור נשאי פפטיד cationic בסחוס. אפיון של מאפייני תחבורה הוא קריטי להבטחת תגובה ביולוגית יעילה. שיטות אלה ניתן להחיל על עיצוב נושאות סמים טעונות בצורה אופטימלית עבור מיקוד רקמות טעונות שלילית.
Abstract
מספר רקמות טעונות שלילית בגוף, כמו סחוס, להציג מחסום לאספקת סמים ממוקדת בשל הצפיפות הגבוהה שלהם של aggrecans טעונים שלילית, ולכן, דורשים שיטות פילוח משופרות כדי להגדיל את התגובה הטיפולית שלהם. בגלל סחוס יש צפיפות תשלום קבועה שלילית גבוהה, תרופות ניתן לשנות עם נשאי סמים טעונים חיובית כדי לנצל אינטראקציות אלקטרוסטטיות, המאפשר תחבורה משופרת תוך סחוס סמים. לימוד ההובלה של נושאות סמים הוא, אם כן, חיוני לחיזוי היעילות של תרופות בגימת תגובה ביולוגית. אנו מראים את העיצוב של שלושה ניסויים אשר יכול לכמת את ספיגת שיווי המשקל, עומק החדירה וקצב דיפוזיה ללא שיווי משקל של נשאי פפטיד cationic בהסברי סחוס. ניסויי ספיגת שיווי משקל מספקים מדד של ריכוז הבדידות בתוך הסחוס בהשוואה לאמבטיה שמסביבה, אשר שימושי לחיזוי הפוטנציאל של נשא סמים בשיפור הריכוז הטיפולי של תרופות בסחוס. עומק מחקרי החדירה באמצעות מיקרוסקופית confocal לאפשר ייצוג חזותי של דיפוזיה 1D solute מן האזור שטחי עד עמוק של סחוס, אשר חשוב להעריך אם solutes להגיע מטריצה שלהם ואתרי היעד הסלולרי. מחקרי שיעור דיפוזיה ללא שיווי משקל באמצעות תא הובלה מותאם אישית מאפשר מדידה של חוזק של אינטראקציות מחייבות עם מטריצת הרקמה על ידי אפיון שיעורי דיפוזיה של solutes פלואורסצנטי על פני הרקמה; זה מועיל לעיצוב נשאים של כוח מחייב אופטימלי עם סחוס. יחד, התוצאות שהתקבלו משלושת ניסויי התחבורה מספקות קו מנחה לעיצוב נושאות תרופות טעונות בצורה אופטימלית המנצלות אינטראקציות טעינה חלשות והפיות עבור יישומים לאספקת תרופות. שיטות ניסיוניות אלה ניתן ליישם גם כדי להעריך את ההובלה של תרופות ותרופות סמים התייחדות. יתר על כן, שיטות אלה ניתן להתאים לשימוש מיקוד רקמות טעונות שלילית אחרים כגון מניסקוס, קרנית ואת ההומור זגוגית.
Introduction
משלוח סמים לרקמות טעונות שלילית בגוף נשאר אתגר בשל חוסר היכולת של תרופות לחדור עמוק לתוך הרקמה כדי להגיע לאתרי היעד תאמטריקס 1. חלק מרקמות אלה כוללות אגרקנים צפופים, טעונים בשלילה אשר יוצרים צפיפות תשלום קבועה שלילית גבוהה (FCD)2 בתוך הרקמה ולפעול כמחסום למסירה של רוב מקרומולקולות3,,4. עם זאת, בסיוע של נושאות סמים טעונות חיובית, מחסום רקמות זה טעון שלילית למעשה ניתן להמיר למחסן סמים באמצעות אינטראקציות תשלום אלקטרוסטטי עבור משלוח סמיםממושך 1,,5,,6,7(איור 1).
איור 1: תשלום משלוח מבוסס תוך סחוס של CPCs. הזרקה תוך-מפרקים של CPCs לחלל מפרק הברך. אינטראקציות אלקטרוסטטיות בין CPCs טעונים חיובית וקבוצות aggrecan טעונות שלילית לאפשר חדירה מהירה ועומק מלא באמצעות סחוס. נתון זה שונה מ- Vedadghavami et al4. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
לאחרונה, ספקי פפטיד cationic באורך קצר (CPCs) תוכננו במטרה ליצור תחומים cationic קטנים מסוגל לשאת טיפולים גדולים יותר בגודל למסירה סחוסטעון שלילית 4. עבור משלוח תרופות יעיל לסחוס לטיפולנפוץ 8,9 ומחלותניווניות כגון דלקת מפרקים ניוונית (OA)10,זה קריטי כי ריכוזים טיפוליים של תרופות לחדור עמוק בתוך הרקמה, שם רוב תאי הסחוס (chondrocytes)לשקר 11. למרות שיש מספר מחלות פוטנציאליות שינוי תרופות זמינות, אף אחד לא קיבל אישור ה-FDA כי אלה אינם מסוגלים למקד ביעילות את הסחוס12,13. לכן, הערכה של מאפייני התחבורה של נושאות סמים היא הכרחית לחיזוי היעילות של תרופות בגימת תגובה טיפולית. כאן, עיצבנו שלושה ניסויים נפרדים שניתן לנצל להערכת ספיגת שיווי המשקל, עומק החדירה וקצב דיפוזיה ללא שיווי משקל של CPCs4.
כדי להבטיח כי יש ריכוז תרופתי מספיק בתוך הסחוס שיכול לספק תגובה טיפולית אופטימלית, ניסויי ספיגה תוכננו לכמת שיווי משקל CPC ריכוז בסחוס4. בעיצוב זה, בעקבות שיווי משקל בין הסחוס לבין האמבטיה שמסביבו, ניתן לקבוע את הכמות הכוללת של הבדידות בתוך הסחוס (המאוגד למטריצה או בחינם) באמצעות יחס ספיגה. יחס זה מחושב על ידי נרמול הריכוז של solutes בתוך הסחוס לזה של אמבט שיווי המשקל. באופן עקרוני, solutes נייטרלי, אשר דיפוזיה דרך הסחוס אינו נעזר על ידי אינטראקציות תשלום, יהיה יחס ספיגה של פחות מ 1. לעומת זאת, solutes cationic, אשר תחבורה משופרת באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות, להראות יחס ספיגה גדול מ 1. עם זאת, כפי שהראה עם CPCs, שימוש בטען חיובי אופטימלי יכול לגרום ליחס ספיגה גבוה בהרבה (גדול מ- 300)4.
למרות ריכוז גבוה של סמים בתוך הסחוס חשוב להשגת תועלת טיפולית, זה גם קריטי כי תרופות לפזר דרך העובי המלא של הסחוס. לכן, מחקרים המראים את עומק החדירה נדרשים כדי להבטיח כי תרופות להגיע עמוק בתוך הסחוס, כך מטריקס ואתרי היעד הסלולרי ניתן להגיע, ובכך לספק טיפול יעיל יותר. ניסוי זה נועד להעריך את דיפוזיה חד-דרךית של solutes באמצעות סחוס, המדמה דיפוזיה של תרופות לתוך סחוס בעקבות הזרקת תוך-מתוך-פרקים ב vivo. הדמיית פלואורסץ באמצעות מיקרוסקופית confocal מאפשרת הערכה של עומק חדירה לתוך סחוס. טעינת חלקיק נטו ממלאת תפקיד מרכזי במתינות האופן שבו סמים עמוקים יכולים לפזר דרך המטריצה. טעינה נטו אופטימלית המבוססת על FCD רקמה נדרש כדי לאפשר אינטראקציות מחייבות הפיך חלש בין חלקיקים cationic מטריצת רקמות אניון. משמעות הדבר היא כי כל אינטראקציה היא חלשה מספיק, כך חלקיקים יכולים להתנתק מהמטריקס אבל הפיך בטבע, כך שהוא יכול להיקשר לאתר אחר מחייב מטריקס עמוק יותרבתוך הרקמה 4. לעומת זאת, תשלום נטו חיובי מוגזם של חלקיק יכול להיות מזיק כלפי דיפוזיה, כמו איגוד מטריצה חזק מדי מונע ניתוק של חלקיקים מאתר האיגוד הראשוני באזור שטחי של סחוס. כתוצאה מכך תגובה ביולוגית לא מספקת כמו רוב אתרי היעד לשקר עמוק בתוך הרקמה11.
כדי לכמת עוד יותר את הכוח של אינטראקציות מחייבות, ניתוח של שיעורי דיפוזיה סמים באמצעות סחוס הוא יתרון. מחקרי דיפוזיה ללא שיווי משקל מאפשרים השוואה של שיעורי דיפוזיה בזמן אמת בין solutes שונים. כמו סמים מפוזרים דרך שטחי, אמצע ועמוק אזורים של סחוס, הנוכחות של אינטראקציות מחייבות יכול לשנות מאוד את שיעורי דיפוזיה. כאשר קיימות אינטראקציות מחייבות בין תרופות למטריצת הסחוס, היא מוגדרת כדיספוסיביות יעילה (DEFF). במקרה זה, לאחר שכל האתרים המחייבים נכבשו, שיעור דיפוזיה של תרופות נשלט על ידי דיפוזיה מצב יציב (DSS). השוואה בין DEFF של solute שונה קובעת את עוצמת האיגוד היחסי של solutes עם המטריצה. עבור solute נתון, אם DEFF ו- DSS הם באותו סדר גודל, זה מרמז כי יש כריכה מינימלית נוכח בין התרופה למטריצה במהלך דיפוזיה. עם זאת, אם DEFF גדול מ- DSS, קיים איגוד משמעותי של חלקיקים למטריקס.
הניסויים שתוכננו מאפשרים בנפרד אפיון של הובלה סולט באמצעות הסחוס, עם זאת, ניתוח הוליסטי הכולל את כל התוצאות נדרש לעיצוב נשא סמים טעון בצורה אופטימלית. האופי החלש וההפיך של אינטראקציות טעינה שולט בקצב דיפוזיה חלקיקים ומאפשר ספיגת שיווי משקל גבוהה וחדירה מהירה לעומק מלא באמצעות סחוס. באמצעות ניסויי ספיגת שיווי משקל, עלינו לחפש נשאים שמופעי ספיגה גבוהה כתוצאה מאינטראקציות טעינה שניתן לאמת באמצעות מחקרים ללא שיווי משקל קצב דיפוזיה. עם זאת, אינטראקציות מחייבות אלה צריכות להיות חלשות הפיכות בטבע כדי לאפשר חדירה בעובי מלא של הבדידות באמצעות סחוס. מוביל סמים אידיאלי יהיה בעל תשלום אופטימלי המאפשר חזק מספיק מחייב לספיגה וריכוזי סמים תוך סחוס גבוה, אבל לא חזק מדי כדי לסתר דיפוזיהבעובי מלא 4. הניסויים שהוצגו יסייעו במאפייני העיצוב של רקמה מבוססת תשלום המתמקדת בנשאי סמים. פרוטוקולים אלה שימשו לאפיון הובלת CPC באמצעות סחוס4,עם זאת, אלה יכולים להיות מיושמים גם על מגוון רחב של תרופות ונשאים סמים באמצעות סחוס ורקמות טעונות שלילית אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטות והפרוטוקולים המתוארים כאן משמעותיים לתחום של אספקת סמים ממוקדת לרקמות טעונות באופן שלילי. בשל הצפיפות הגבוהה של aggrecans טעונים שלילית נוכח ברקמות אלה, נוצר מחסום, ובכך למנוע תרופות מלהגיע לאתרי היעד הסלולרי שלהם אשר נמצאים עמוק בתוך המטריצה. כדי להתמודד עם האתגר הבולט הזה, ניתן לשנות…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי משרד ההגנה של ארצות הברית באמצעות תוכניות מחקר רפואי בהכוונון הקונגרס (CDMRP) תחת חוזה W81XWH-17-1-0085, והמכון הלאומי לבריאות R03 EB025903-1. AV מומן על ידי המכללה להנדסה דיקן מלגות באוניברסיטת נורת’איסטרן.
Materials
| 316 Stainless Steel SAE Washer | McMaster-Carr | 91950A044 | For number 5 screw size, 0.14" ID, 0.312" OD |
| 96-Well Polystyrene Plate | Fisherbrand | 12566620 | Black |
| Acrylic Thick Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | 100x |
| Bovine Cartilage | Research 87 | N/A | 2-3 weeks old, femoropatellar groove |
| Bovine Serum Albumin | Fisher BioReagents | BP671-1 | |
| CPC+14 | LifeTein | LT1524 | Custom designed peptide |
| CPC+20 | LifeTein | LT1525 | Custom designed peptide |
| CPC+8 | LifeTein | LT1523 | Custom designed peptide |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Dermal Punch | MedBlades | MB5-1 | 3, 4 and 6 mm |
| Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisherbrand | 12550A3 | |
| Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning Costar | 3595 | Clear, 96 well |
| Flexible Wrapping Film | Bemis Parafilm M Laboratory | 1337412 | |
| Gold Seal Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 6378701 | # 1.5, 18×18 mm |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A15 | 1/2" Diameter |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A19 | 3/4" Diameter |
| Laser | Chroma Technology | AT480/30m | Spectrophotometer Laser Light |
| Low-Strength Steel Hex Nut | McMaster-Carr | 90480A007 | 6-32 Thread size |
| LSM 700 Confocal Microscope | Zeiss | LSM 700 | |
| Micro Magnetic Stirring Bars | Bel-Art Spinbar | F37119-0007 | 7×2 mm |
| Multipurpose Neoprene Rubber Sheet | McMaster-Carr | 1370N12 | 1/32" Thickness |
| Non-Fat Dried Bovine Milk | Sigma Aldrich | M7409 | |
| Petri Dish | Chemglass Life Sciences | CGN1802145 | 150 mm diameter |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CMR | 1x |
| Plate Shaker | VWR | 89032-088 | |
| Protease Inhibitors | Thermo Scientific | A32953 | |
| Razor Blades | Fisherbrand | 12640 | |
| R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | Black transport chamber inserts |
| RTV Silicone | Loctite | 234323 | Epoxy, Non-corrosive, clear |
| Scalpel | TedPella | 549-3 | #10, #11 blades |
| Signal Receiver | Chroma Technology | ET515lp | Spectrophotometer Laser Signal Receiver |
| Snap-Cap Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22363204 | 1.5 mL |
| Spatula | TedPella | 13508 | |
| Synergy H1 Microplate Reader | Biotek | H1M | |
| Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw | McMaster-Carr | 90128A153 | 6-32 Thread size, 1" Long |
References
- Bajpayee, A. G., Grodzinsky, A. J. Cartilage-targeting drug delivery: can electrostatic interactions help. Nature Reviews Rheumatology. 13 (3), 183-193 (2017).
- Maroudas, A. Transport of solutes through cartilage: permeability to large molecules. Journal of Anatomy. 122, 335-347 (1976).
- Bajpayee, A. G., Wong, C. R., Bawendi, M. G., Frank, E. H., Grodzinsky, A. J. Avidin as a model for charge driven transport into cartilage and drug delivery for treating early stage post-traumatic osteoarthritis. Biomaterials. 35 (1), 538-549 (2014).
- Vedadghavami, A., et al. Cartilage penetrating cationic peptide carriers for applications in drug delivery to avascular negatively charged tissues. Acta Biomaterialia. 93, 258-269 (2019).
- Mehta, S., Akhtar, S., Porter, R. M., Önnerfjord, P., Bajpayee, A. G. Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) is more effective in suppressing cytokine-induced catabolism in cartilage-synovium co-culture than in cartilage monoculture. Arthritis Research & Therapy. 21 (1), 238 (2019).
- Vedadghavami, A., Zhang, C., Bajpayee, A. G. Overcoming negatively charged tissue barriers: Drug delivery using cationic peptides and proteins. Nano Today. 34, 100898 (2020).
- Young, C. C., Vedadghavami, A., Bajpayee, A. G. Bioelectricity for Drug Delivery: The Promise of Cationic Therapeutics. Bioelectricity. , (2020).
- Felson, D. T. Osteoarthritis of the knee. New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).
- Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. Osteoarthritis – An untreatable disease. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).
- Martel-Pelletier, J. Pathophysiology of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 7 (4), 371-373 (1999).
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: Structure, composition, and function. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Chevalier, X., et al. Intraarticular injection of anakinra in osteoarthritis of the knee: A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled study. Arthritis Care and Research. 61 (3), 344-352 (2009).
- Cohen, S. B., et al. A randomized, double-blind study of AMG 108 (a fully human monoclonal antibody to IL-1R1) in patients with osteoarthritis of the knee. Arthritis Research and Therapy. 13 (4), 125 (2011).
- Evans, C. H., Kraus, V. B., Setton, L. A. Progress in intra-articular therapy. Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 11-22 (2014).
- He, T., et al. Multi-arm Avidin nano-construct for intra-cartilage delivery of small molecule drugs. Journal of Controlled Release. 318, 109-123 (2020).
- Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. A rabbit model demonstrates the influence of cartilage thickness on intra-articular drug delivery and retention within cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 33 (5), 660-667 (2015).
- Bajpayee, A. G., Quadir, M. A., Hammond, P. T., Grodzinsky, A. J. Charge based intra-cartilage delivery of single dose dexamethasone using Avidin nano-carriers suppresses cytokine-induced catabolism long term. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (1), 71-81 (2016).
- Zhang, C., et al. Avidin-biotin technology to synthesize multi-arm nano-construct for drug delivery. MethodsX. , 100882 (2020).
- Wagner, E. K., et al. Avidin grafted dextran nanostructure enables a month-long intra-discal retention. Scientific Reports. 10.1, 1-14 (2020).
- Troeberg, L., Nagase, H. Proteases involved in cartilage matrix degradation in osteoarthritis. Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1824 (1), 133-145 (2012).
- Kirk, T. B., Wilson, A. S., Stachowiak, G. The effects of dehydration on the surface morphology of articular cartilage. Journal of Orthopaedic Rheumatology. 6 (2-3), 75-80 (1993).
- Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. Solute transport across a contact interface in deformable porous media. Journal of Biomechanics. 45 (6), 1023-1027 (2012).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model. Journal of Biomechanics. 49 (9), 1510-1517 (2016).
- Arbabi, V., Pouran, B., Zadpoor, A. A., Weinans, H. An experimental and finite element protocol to investigate the transport of neutral and charged solutes across articular cartilage. Journal of Visualized Experiments. 2017 (122), (2017).
- Sampson, S. L., Sylvia, M., Fields, A. J. Effects of dynamic loading on solute transport through the human cartilage endplate. Journal of Biomechanics. 83, 273-279 (2019).
- Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. Electrostatic interactions enable rapid penetration, enhanced uptake and retention of intra-articular injected avidin in rat knee joints. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 32 (8), 1044-1051 (2014).
- Bajpayee, A. G., et al. Sustained intra-cartilage delivery of low dose dexamethasone using a cationic carrier for treatment of post traumatic osteoarthritis. European Cells & Materials. 34, 341-364 (2017).
- Malda, J., et al. Of Mice, Men and Elephants: The Relation between Articular Cartilage Thickness and Body Mass. PLoS One. 8 (2), 57683 (2013).
- Frisbie, D. D., Cross, M. W., McIlwraith, C. W. A comparative study of articular cartilage thickness in the stifle of animal species used in human pre-clinical studies compared to articular cartilage thickness in the human knee. Veterinary and Comparative Orthopaedics and Traumatology. 19 (3), 142-146 (2006).
