Caracterização das Propriedades de Transporte Intra-Cartilagem dos Transportadores de Peptídeos Cationic

Summary

Este protocolo determina a absorção de equilíbrio, profundidade de penetração e taxa de difusão de não-equilíbrio para portadores de peptídeos cationicos na cartilagem. A caracterização das propriedades de transporte é fundamental para garantir uma resposta biológica eficaz. Esses métodos podem ser aplicados para projetar um portador de drogas com carga ideal para direcionar tecidos carregados negativamente.

Abstract

Vários tecidos carregados negativamente no corpo, como a cartilagem, apresentam uma barreira para o fornecimento de medicamentos direcionados devido à sua alta densidade de aggrecans carregados negativamente e, portanto, requerem métodos de mira melhorados para aumentar sua resposta terapêutica. Como a cartilagem tem uma alta densidade de carga fixa negativa, as drogas podem ser modificadas com portadores de drogas positivamente carregados para tirar proveito das interações eletrostáticas, permitindo um maior transporte de drogas intra-cartilagem. Estudar o transporte de transportadores de drogas é, portanto, crucial para prever a eficácia dos medicamentos na indução de uma resposta biológica. Mostramos o desenho de três experimentos que podem quantificar a absorção de equilíbrio, profundidade de penetração e taxa de difusão não-equilíbrio de portadores de peptídeos cationicos em explantas de cartilagem. Os experimentos de absorção de equilíbrio fornecem uma medida da concentração de soluto dentro da cartilagem em comparação com seu banho circundante, o que é útil para prever o potencial de um portador de drogas no aumento da concentração terapêutica de drogas na cartilagem. Estudos de profundidade de penetração utilizando microscopia confocal permitem a representação visual da difusão soluto 1D da zona superficial para profunda da cartilagem, o que é importante para avaliar se os solutos atingem seus locais de destino matriz e celular. Estudos de taxa de difusão não-equilíbrio utilizando uma câmara de transporte personalizada permitem medir a força das interações de ligação com a matriz tecidual caracterizando as taxas de difusão de solutos fluorescentes rotulados através do tecido; isso é benéfico para projetar portadores de força de ligação ideal com cartilagem. Juntos, os resultados obtidos a partir dos três experimentos de transporte fornecem uma diretriz para projetar portadores de medicamentos com carga ideal que se aproveitam de interações de carga fracas e reversíveis para aplicações de entrega de medicamentos. Estes métodos experimentais também podem ser aplicados para avaliar o transporte de drogas e conjugados portadores de drogas. Além disso, esses métodos podem ser adaptados para uso na segmentação de outros tecidos carregados negativamente, como menisco, córnea e humor vítreo.

Introduction

A entrega de drogas para tecidos carregados negativamente no corpo continua sendo um desafio devido à incapacidade de as drogas penetrarem profundamente no tecido para alcançar os locais-alvo das células e matrizes¹. Vários desses tecidos são compostos por aggrecans densamente embalados e carregados negativamente que criam uma alta densidade de carga fixa negativa (FCD)² dentro do tecido e agem como uma barreira para a entrega da maioria das macromoléculas^3,,4. No entanto, com a ajuda de portadores de medicamentos carregados positivamente, essa barreira tecidual carregada negativamente pode ser convertida em um depósito de drogas através de interações de carga eletrostática para entrega sustentada de medicamentos^1,,5,,6,7(Figura 1).

Figura 1: Entrega intra cartilagem baseada em carga de CPCs. Injeção intra-articular de CPCs no espaço articular do joelho. Interações eletrostáticas entre CPCs carregados positivamente e grupos aggrecanos carregados negativamente permitem penetração rápida e completa de profundidade através da cartilagem. Este número foi modificado de Vedadghavami et al⁴. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Recentemente, os portadores de peptídeos cáticos de curto comprimento (CPCs) foram projetados com o objetivo de criar pequenos domínios cônicos capazes de realizar terapêuticas de tamanho maior para entrega à cartilagem⁴carregada negativamente . Para o fornecimento eficaz de medicamentos à cartilagem para o tratamento de doenças prevalentes^8,,9 e degenerativas como a osteoartrite (OA)¹⁰, é fundamental que as concentrações terapêuticas de drogas penetrem profundamente dentro do tecido, onde a maioria das células de cartilagem (condrócitos)^{residem 11}. Embora existam vários medicamentos potenciais modificados por doenças disponíveis, nenhum deles obteve a aprovação da FDA porque estes são incapazes de atingir efetivamente a cartilagem^12,13. Portanto, a avaliação das propriedades de transporte dos transportadores de drogas é necessária para prever a eficácia dos medicamentos na indução de uma resposta terapêutica. Aqui, projetamos três experimentos separados que podem ser utilizados para avaliar a captação de equilíbrio, profundidade de penetração e taxa de difusão não-equilíbrio dos CPCs⁴.

Para garantir que haja uma concentração suficiente de medicamentos dentro da cartilagem que possa fornecer uma resposta terapêutica ideal, os experimentos de absorção foram projetados para quantificar a concentração de CPC de equilíbrio na cartilagem⁴. Neste desenho, seguindo um equilíbrio entre a cartilagem e seu banho circundante, a quantidade total de soluto dentro da cartilagem (vinculada à matriz ou livre) pode ser determinada usando uma razão de absorção. Essa razão é calculada pela normalização da concentração de solutos dentro da cartilagem ao do banho de equilíbrio. Em princípio, solutos neutros, cuja difusão através da cartilagem não é assistida por interações de carga, teriam uma razão de absorção inferior a 1. Por outro lado, solutos cáticos, cujo transporte é aprimorado através de interações eletrostáticas, mostram uma razão de absorção maior que 1. No entanto, como mostrado com os CPCs, o uso de uma carga positiva ideal pode resultar em taxas de absorção muito maiores (superiores a 300)⁴.

Embora a alta concentração de medicamentos dentro da cartilagem seja importante para alcançar o benefício terapêutico, também é fundamental que as drogas difundam através da espessura total da cartilagem. Portanto, estudos mostrando a profundidade da penetração são necessários para garantir que os medicamentos cheguem fundo dentro da cartilagem para que os locais de matriz e destino celular possam ser alcançados, proporcionando assim uma terapia mais eficaz. Este experimento foi projetado para avaliar a difusão unidirecional de solutos através da cartilagem, simulando a difusão de drogas em cartilagem após injeção intra-articular in vivo. A imagem de fluorescência usando microscopia confocal permite a avaliação da profundidade de penetração na cartilagem. A carga de partículas líquidas desempenha um papel fundamental na moderação de como drogas profundas podem difundir através da matriz. Uma carga líquida ideal baseada em um tecido FCD é necessária para permitir interações de ligação fraca-reversíveis entre partículas cônicas e a matriz tecidual. Isso implica que qualquer interação é fraca o suficiente para que as partículas possam se desassociar da matriz, mas reversível na natureza para que possa se ligar a outro local de ligação de matriz mais profunda dentro do tecido⁴. Por outro lado, a carga líquida positiva excessiva de uma partícula pode ser prejudicial para a difusão, uma vez que a ligação matricial muito forte impede o descolamento de partículas do local de ligação inicial na zona superficial da cartilagem. Isso resultaria em uma resposta biológica insuficiente, pois a maioria dos locais alvos está profundamente dentro do tecido¹¹.

Para quantificar ainda mais a força das interações de ligação, a análise das taxas de difusão de medicamentos através da cartilagem é vantajosa. Estudos de difusão de não equilíbrio permitem a comparação das taxas de difusão em tempo real entre diferentes solutos. À medida que as drogas se difundem através das zonas superficiais, médias e profundas da cartilagem, a presença de interações de ligação pode alterar muito as taxas de difusão. Quando as interações de ligação estão presentes entre as drogas e a matriz da cartilagem, ela é definida como a difusividade efetiva_{(D EFF}). Neste caso, uma vez ocupados todos os locais vinculantes, a taxa de difusão de medicamentos é regida pela difusão de estado estável_(SS). A comparação entre o_EFF D de solute diferente determina a força relativa de ligação dos solutos com a matriz. Para um determinado soluto, se o D_EFF e d_SS estão dentro da mesma ordem de magnitude, implica que há uma ligação mínima presente entre a droga e a matriz durante a difusão. No entanto, se_{o D EFF} for maior que o D_SS,existe uma ligação substancial de partículas à matriz.

Os experimentos projetados individualmente permitem a caracterização do transporte soluto através da cartilagem, no entanto, uma análise holística inclusiva de todos os resultados é necessária para projetar um portador de medicamentos com carga ideal. A natureza fraca e reversível das interações de carga controla a taxa de difusão de partículas e permite uma alta absorção de equilíbrio e rápida penetração de profundidade total através da cartilagem. Através de experimentos de captação de equilíbrio, devemos procurar portadores que apresentem alta absorção como resultado de interações de carga que podem ser verificadas por meio de estudos de taxa de difusão de não equilíbrio. No entanto, essas interações de ligação devem ser fracas e reversíveis na natureza para permitir a penetração da espessura total do soluto através da cartilagem. Um portador de drogas ideal possui uma carga ideal que permite uma ligação forte o suficiente para absorção e altas concentrações de drogas intra-cartilagem, mas não muito forte a ponto de impedir a difusão de espessura total⁴. Os experimentos apresentados auxiliarão nas características de design para os portadores de medicamentos baseados em carga. Esses protocolos foram utilizados para caracterizar o transporte de CPC através da cartilagem^4,porém, estes também podem ser aplicados a uma variedade de medicamentos e portadores de drogas através de cartilagem e outros tecidos carregados negativamente.

Protocol

Foram obtidas aprovações universitárias para a realização dos experimentos com tecidos mortos. As juntas bovinas foram obtidas comercialmente a partir de um matadouro. 1. Extração de explante de cartilagem Utilizando um bisturi (#10 lâmina), corte e remova gordura, músculos, ligamentos, tendões e todos os outros tecidos conjuntivos para expor a cartilagem do sulco femoropatelar das articulações do joelho bovino. Usando socos dérmicos de 3 mm e 6 mm, faça socos…

Representative Results

Após a absorção de equilíbrio de CPCs por cartilagem, a fluorescência do banho diminui quando o soluto é tomado pelo tecido. No entanto, se o valor da fluorescência do banho final permanecer semelhante ao inicial, indica que não há absorção soluto mínima/mínima. Outra confirmação da absorção de soluto é se o tecido mudou visivelmente de cor para a cor do corante fluorescente. A absorção quantitativa de solutos na cartilagem foi determinada utilizando-se a razão de absorção (RU) após os …

Discussion

Os métodos e protocolos descritos aqui são significativos para o campo da entrega de medicamentos direcionados para tecidos carregados negativamente. Devido à alta densidade de aggrecans carregados negativamente presentes nesses tecidos, cria-se uma barreira, impedindo assim que as drogas atinjam seus locais de destino celular que estão no fundo da matriz. Para enfrentar este desafio pendente, os medicamentos podem ser modificados para incorporar portadores de medicamentos carregados positivamente que podem aumentar …

Materials

316 Stainless Steel SAE Washer	McMaster-Carr	91950A044	For number 5 screw size, 0.14" ID, 0.312" OD
96-Well Polystyrene Plate	Fisherbrand	12566620	Black
Acrylic Thick Gauge Sheet	Reynolds Polymer	N/A	For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240062	100x
Bovine Cartilage	Research 87	N/A	2-3 weeks old, femoropatellar groove
Bovine Serum Albumin	Fisher BioReagents	BP671-1
CPC+14	LifeTein	LT1524	Custom designed peptide
CPC+20	LifeTein	LT1525	Custom designed peptide
CPC+8	LifeTein	LT1523	Custom designed peptide
Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark Professional	34155
Dermal Punch	MedBlades	MB5-1	3, 4 and 6 mm
Economy Plain Glass Microscope Slides	Fisherbrand	12550A3
Flat Bottom Cell Culture Plates	Corning Costar	3595	Clear, 96 well
Flexible Wrapping Film	Bemis Parafilm M Laboratory	1337412
Gold Seal Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	6378701	# 1.5, 18×18 mm
Hammer-Driven Hole Punch	McMaster-Carr	3427A15	1/2" Diameter
Hammer-Driven Hole Punch	McMaster-Carr	3427A19	3/4" Diameter
Laser	Chroma Technology	AT480/30m	Spectrophotometer Laser Light
Low-Strength Steel Hex Nut	McMaster-Carr	90480A007	6-32 Thread size
LSM 700 Confocal Microscope	Zeiss	LSM 700
Micro Magnetic Stirring Bars	Bel-Art Spinbar	F37119-0007	7×2 mm
Multipurpose Neoprene Rubber Sheet	McMaster-Carr	1370N12	1/32" Thickness
Non-Fat Dried Bovine Milk	Sigma Aldrich	M7409
Petri Dish	Chemglass Life Sciences	CGN1802145	150 mm diameter
Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-040-CMR	1x
Plate Shaker	VWR	89032-088
Protease Inhibitors	Thermo Scientific	A32953
Razor Blades	Fisherbrand	12640
R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet	Reynolds Polymer	N/A	Black transport chamber inserts
RTV Silicone	Loctite	234323	Epoxy, Non-corrosive, clear
Scalpel	TedPella	549-3	#10, #11 blades
Signal Receiver	Chroma Technology	ET515lp	Spectrophotometer Laser Signal Receiver
Snap-Cap Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	22363204	1.5 mL
Spatula	TedPella	13508
Synergy H1 Microplate Reader	Biotek	H1M
Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw	McMaster-Carr	90128A153	6-32 Thread size, 1" Long