Caracterización de las propiedades de transporte intracartílago de los portadores de péptidos catiónicos
Summary
Este protocolo determina la absorción de equilibrio, la profundidad de penetración y la tasa de difusión sin equilibrio para los portadores de péptidos catiónicos en el cartílago. La caracterización de las propiedades de transporte es fundamental para garantizar una respuesta biológica eficaz. Estos métodos se pueden aplicar para diseñar un portador de medicamentos con carga óptima para apuntar a los tejidos cargados negativamente.
Abstract
Varios tejidos cargados negativamente en el cuerpo, como el cartílago, presentan una barrera a la administración de fármacos dirigidos debido a su alta densidad de aggrecanos cargados negativamente y, por lo tanto, requieren métodos de focalización mejorados para aumentar su respuesta terapéutica. Debido a que el cartílago tiene una alta densidad de carga fija negativa, los medicamentos se pueden modificar con portadores de medicamentos cargados positivamente para aprovechar las interacciones electrostáticas, lo que permite un mejor transporte de fármacos dentro del cartílago. Por lo tanto, estudiar el transporte de los portadores de fármacos es crucial para predecir la eficacia de los fármacos para inducir una respuesta biológica. Mostramos el diseño de tres experimentos que pueden cuantificar la absorción de equilibrio, la profundidad de penetración y la tasa de difusión sin equilibrio de los portadores de péptidos catiónicos en explantes de cartílago. Los experimentos de absorción de equilibrio proporcionan una medida de la concentración de soluto dentro del cartílago en comparación con su baño circundante, que es útil para predecir el potencial de un portador de fármacos en la mejora de la concentración terapéutica de fármacos en el cartílago. Los estudios de profundidad de penetración mediante microscopía confocal permiten la representación visual de la difusión del soluto 1D desde la zona superficial hasta la profunda del cartílago, lo que es importante para evaluar si los solutos alcanzan sus sitios de matriz y diana celular. Los estudios de tasa de difusión sin equilibrio que utilizan una cámara de transporte diseñada a medida permiten medir la fuerza de las interacciones de unión con la matriz tisular mediante la caracterización de las tasas de difusión de los solutos etiquetados fluorescentemente a través del tejido; esto es beneficioso para diseñar portadores de resistencia óptima de unión con cartílago. Juntos, los resultados obtenidos de los tres experimentos de transporte proporcionan una guía para diseñar portadores de medicamentos con carga óptima que aprovechan las interacciones de carga débiles y reversibles para aplicaciones de administración de medicamentos. Estos métodos experimentales también se pueden aplicar para evaluar el transporte de fármacos y conjugadores portadores de fármacos. Además, estos métodos se pueden adaptar para su uso en la orientación a otros tejidos cargados negativamente como el menisco, la córnea y el humor vítreo.
Introduction
La administración de drogas a los tejidos cargados negativamente en el cuerpo sigue siendo un desafío debido a la incapacidad de los fármacos para penetrar profundamente en el tejido para llegar a los sitios diana celular y matriz1. Varios de estos tejidos comprenden aggrecanos densamente embalados y cargados negativamente que crean una alta densidad de carga fija negativa (FCD)2 dentro del tejido y actúan como una barrera para la entrega de la mayoría de las macromoléculas3,4. Sin embargo, con la ayuda de portadores de medicamentos cargados positivamente, esta barrera tisular cargada negativamente puede convertirse en un depósito de fármacos a través de interacciones de carga electrostática para la administración sostenida de fármacos1,5,6,7(Figura 1).
Figura 1: Entrega intracartílago basada en carga de CPC. Inyección intraarticular de CPC en el espacio de la articulación de la rodilla. Las interacciones electrostáticas entre los CPC cargados positivamente y los grupos agregcanos cargados negativamente permiten una penetración rápida y completa de la profundidad a través del cartílago. Esta cifra ha sido modificada de Vedadghavami et al4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Recientemente, los portadores de péptidos catiónicos de corta duración (CPC) fueron diseñados con el objetivo de crear pequeños dominios catiónicos capaces de transportar terapias de mayor tamaño para el suministro al cartílago cargado negativamente4. Para la entrega eficaz de fármacos al cartílago para el tratamiento de8,9 y enfermedades degenerativas como la osteoartritis (OA)10, es fundamental que las concentraciones terapéuticas de fármacos penetren profundamente dentro del tejido, donde la mayoría de las células del cartílago (condrocitos) se encuentran11. Aunque hay varios medicamentos modificadores de enfermedades potenciales disponibles, ninguno ha obtenido la aprobación de la FDA porque estos son incapaces de apuntar eficazmente al cartílago12,,13. Por lo tanto, la evaluación de las propiedades de transporte de los portadores de medicamentos es necesaria para predecir la eficacia de los fármacos en la inducción de una respuesta terapéutica. Aquí, hemos diseñado tres experimentos separados que se pueden utilizar para evaluar la absorción de equilibrio, la profundidad de penetración y la tasa de difusión sin equilibrio de los CPC4.
Para garantizar que haya una concentración de fármaco suficiente dentro del cartílago que pueda proporcionar una respuesta terapéutica óptima, se diseñaron experimentos de absorción para cuantificar la concentración de CPC de equilibrio en el cartílago4. En este diseño, después de un equilibrio entre el cartílago y su baño circundante, la cantidad total de soluto dentro del cartílago (ya sea unida a la matriz o libre) se puede determinar utilizando una relación de absorción. Esta relación se calcula normalizando la concentración de solutos dentro del cartílago a la del baño de equilibrio. En principio, los solutos neutros, cuya difusión a través del cartílago no está asistida por interacciones de carga, tendrían una relación de absorción inferior a 1. Por el contrario, los solutos catiónicos, cuyo transporte se mejora a través de interacciones electrostáticas, muestran una relación de absorción superior a 1. Sin embargo, como se muestra con los CPC, el uso de una carga positiva óptima puede dar lugar a ratios de absorción mucho más altos (superiores a 300)4.
Aunque la alta concentración de drogas dentro del cartílago es importante para lograr beneficios terapéuticos, también es fundamental que los fármacos se difundan a través de todo el espesor del cartílago. Por lo tanto, se requieren estudios que muestren la profundidad de penetración para asegurar que los fármacos lleguen a lo profundo del cartílago para que se pueda alcanzar la matriz y los sitios celulares de destino, proporcionando así una terapia más eficaz. Este experimento fue diseñado para evaluar la difusión unidireccional de los solutos a través del cartílago, simulando la difusión de fármacos en cartílago después de la inyección intraarticular in vivo. Las imágenes de fluorescencia mediante microscopía confocal permiten evaluar la profundidad de penetración en el cartílago. La carga neta de partículas desempeña un papel clave en la moderación de cómo los fármacos profundos pueden difundirse a través de la matriz. Se requiere una carga neta óptima basada en una FCD tisular para permitir interacciones de unión débil-reversibles entre las partículas catiónicas y la matriz de tejido aniónico. Esto implica que cualquier interacción es lo suficientemente débil para que las partículas puedan desvincularse de la matriz pero de naturaleza reversible para que pueda unirse a otro sitio de unión de matriz más profundo dentro del tejido4. Por el contrario, la carga neta positiva excesiva de una partícula puede ser perjudicial para la difusión, ya que la unión de matriz demasiado fuerte evita el desprendimiento de partículas del sitio de unión inicial en la zona superficial del cartílago. Esto resultaría en una respuesta biológica insuficiente, ya que la mayoría de los sitios objetivo se encuentran en lo profundo del tejido11.
Para cuantificar aún más la fuerza de las interacciones de unión, el análisis de las tasas de difusión de fármacos a través del cartílago es ventajoso. Los estudios de difusión sin equilibrio permiten comparar las tasas de difusión en tiempo real entre diferentes solutos. A medida que los fármacos se difunden a través de las zonas superficiales, medias y profundas del cartílago, la presencia de interacciones vinculantes puede alterar en gran medida las tasas de difusión. Cuando las interacciones de unión están presentes entre los fármacos y la matriz del cartílago, se define como la difusividad efectiva(D EFF). En este caso, una vez que todos los sitios de enlace han sido ocupados, la tasa de difusión de los medicamentos se rige por la difusión de estado estacionario (DSS). La comparación entre elEFF D de diferente soluto determina la fuerza de unión relativa de los solutos con la matriz. Para un soluto dado, si el DEFF y DSS están dentro del mismo orden de magnitud, implica que hay una unión mínima presente entre el fármaco y la matriz durante la difusión. Sin embargo, si DEFF es mayor que DSS,existe una unión sustancial de partículas a la matriz.
Los experimentos diseñados individualmente permiten la caracterización del transporte de soluto a través del cartílago, sin embargo, se requiere un análisis holístico que incluya todos los resultados para diseñar un portador de fármacos con carga óptima. La naturaleza débil y reversible de las interacciones de carga controla la tasa de difusión de partículas y permite una absorción de alto equilibrio y una rápida penetración de profundidad completa a través del cartílago. A través de experimentos de absorción de equilibrio, debemos buscar portadores que muestren una alta absorción como resultado de interacciones de carga que se pueden verificar mediante estudios de tasa de difusión sin equilibrio. Sin embargo, estas interacciones de unión deben ser débiles y reversibles en la naturaleza para permitir la penetración de espesor completo del soluto a través del cartílago. Un portador de fármacos ideal poseería una carga óptima que permite una unión lo suficientemente fuerte para la absorción y altas concentraciones de fármacos intracartílagos, pero no demasiado fuerte como para impedir la difusión de espesor completo4. Los experimentos presentados ayudarán en las características de diseño de los tejidos basados en la carga dirigidos a los portadores de fármacos. Estos protocolos se utilizaron para caracterizar el transporte de CPC a través del cartílago4,sin embargo, estos también se pueden aplicar a una variedad de fármacos y portadores de fármacos a través del cartílago y otros tejidos cargados negativamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos y protocolos descritos aquí son significativos para el campo de la administración de fármacos dirigidos a los tejidos cargados negativamente. Debido a la alta densidad de aggrecanos cargados negativamente presentes en estos tejidos, se crea una barrera, evitando así que los fármacos lleguen a sus sitios de destino celular que se encuentran profundamente dentro de la matriz. Para hacer frente a este desafío excepcional, los medicamentos pueden ser modificados para incorporar portadores de medicamentos c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Departamento de Defensa de los Estados Unidos a través de los Programas de Investigación Médica Dirigidos por el Congreso (CDMRP) bajo el contrato W81XWH-17-1-0085, y el Instituto Nacional de Salud R03 EB025903-1. AV fue financiado por la Beca del Decano de la Facultad de Ingeniería en la Universidad Northeastern.
Materials
| 316 Stainless Steel SAE Washer | McMaster-Carr | 91950A044 | For number 5 screw size, 0.14" ID, 0.312" OD |
| 96-Well Polystyrene Plate | Fisherbrand | 12566620 | Black |
| Acrylic Thick Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | 100x |
| Bovine Cartilage | Research 87 | N/A | 2-3 weeks old, femoropatellar groove |
| Bovine Serum Albumin | Fisher BioReagents | BP671-1 | |
| CPC+14 | LifeTein | LT1524 | Custom designed peptide |
| CPC+20 | LifeTein | LT1525 | Custom designed peptide |
| CPC+8 | LifeTein | LT1523 | Custom designed peptide |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Dermal Punch | MedBlades | MB5-1 | 3, 4 and 6 mm |
| Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisherbrand | 12550A3 | |
| Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning Costar | 3595 | Clear, 96 well |
| Flexible Wrapping Film | Bemis Parafilm M Laboratory | 1337412 | |
| Gold Seal Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 6378701 | # 1.5, 18×18 mm |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A15 | 1/2" Diameter |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A19 | 3/4" Diameter |
| Laser | Chroma Technology | AT480/30m | Spectrophotometer Laser Light |
| Low-Strength Steel Hex Nut | McMaster-Carr | 90480A007 | 6-32 Thread size |
| LSM 700 Confocal Microscope | Zeiss | LSM 700 | |
| Micro Magnetic Stirring Bars | Bel-Art Spinbar | F37119-0007 | 7×2 mm |
| Multipurpose Neoprene Rubber Sheet | McMaster-Carr | 1370N12 | 1/32" Thickness |
| Non-Fat Dried Bovine Milk | Sigma Aldrich | M7409 | |
| Petri Dish | Chemglass Life Sciences | CGN1802145 | 150 mm diameter |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CMR | 1x |
| Plate Shaker | VWR | 89032-088 | |
| Protease Inhibitors | Thermo Scientific | A32953 | |
| Razor Blades | Fisherbrand | 12640 | |
| R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | Black transport chamber inserts |
| RTV Silicone | Loctite | 234323 | Epoxy, Non-corrosive, clear |
| Scalpel | TedPella | 549-3 | #10, #11 blades |
| Signal Receiver | Chroma Technology | ET515lp | Spectrophotometer Laser Signal Receiver |
| Snap-Cap Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22363204 | 1.5 mL |
| Spatula | TedPella | 13508 | |
| Synergy H1 Microplate Reader | Biotek | H1M | |
| Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw | McMaster-Carr | 90128A153 | 6-32 Thread size, 1" Long |
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