ניתוח ומפרט של הפצות גודל גרנול עמילן

Summary

מוצג להלן הליך עבור קביעות הניתנות לשחזור ותקפות סטטיסטית של התפלגות גודל גרגירי עמילן, ולציון התפלגות גודל לוגנורמי של גרגירים שנקבעו באמצעות טופס כפול שני פרמטרים. זה ישים לכל ניתוחי גודל גרגירים של דגימות עמילן בקנה מידה גרם למחקר מדעי הצמח והמזון.

Abstract

עמילן מכל מקורות הצמח מורכבים מגורמים במגוון גדלים וצורות בעלי תדרי התרחשות שונים, כלומר, מציגים גודל והתפלגות צורות. נתוני גודל גרגירי עמילן שנקבעו באמצעות מספר סוגים של טכניקות שינוי גודל חלקיקים הם לעתים קרובות בעייתיים בשל רבייה לקויה או חוסר מובהקות סטטיסטית הנובעת מכמה שגיאות שיטתיות בלתי עבירות, כולל רגישות לצורות גרגירים ומגבלות של גדלים מדגם גרגירים. התווינו הליך עבור קביעות ניתנות לשחזור ותקף סטטיסטית של התפלגות גודל גרגירי עמילן באמצעות טכניקת אזור חישה חשמלית, ולציון התפלגות גודל לוגנורמי גרגר נחוש באמצעות טופס כפול שני פרמטרים מאומץ עם דיוק משופר ומזווה. זה ישים לכל ניתוחי גודל גרגירים של דגימות עמילן בקנה מידה גרם, ולכן, יכול להקל על מחקרים על איך גדלי גרנול עמילן מעוצבים על ידי מנגנון ביוסינתזה עמילן ומנגנונים; וכיצד הם משפיעים על תכונות ופונקציונליות של עמילנים לשימושי מזון ותעשייה. תוצאות מייצגות מוצגות מניתוחים משוכפלים של התפלגות גודל גרגירים של דגימות עמילן sweetpotato באמצעות ההליך המתואר. כמו כן דנו בכמה היבטים טכניים מרכזיים של ההליך, במיוחד, המפרט המכפיל של הפצות גודל לוגנורמי גרגר וכמה אמצעים טכניים להתגבר על חסימת צמצם תכופה על ידי אגרגטים גרגירים.

Introduction

גרגירי עמילן הם המבנה הפיזי שבו שני פולימרים הומוגלוקניים מילואים עיקריים בפוטוסינתזה של צמחים ורקמות אחסון, אמילוז ליניארי או מסועף בדלילות והאמילופקטין בעל ההסתעפות, ארוזים בצורה מסודרת יחד עם כמה מרכיבים משניים, כולל שומנים וחלבונים. גרגירי עמילן ממיני צמחים שונים מציגים צורות תלת מימדיות (תלת מימדיות) רבות (הנסקרות ב-^{ref. 1,2}), כולל כדורים, אליפסואידים, פוליהדרונים, טסיות הדם, קוביות, cuboids, ו tubules לא סדיר. אפילו אלה מאותה רקמה או רקמות שונות של אותו מיני צמחים יכולים להיות קבוצה של צורות עם תדרי התרחשות משתנים. במילים אחרות, גרגירי עמילן ממין צמחים עשויים להיות בעלי התפלגות צורה סטטיסטית אופיינית, ולא צורה ספציפית. צורות הגרגר הלא אחידות והלא כדוריות מקשות על מדידה והגדרה של גדלי גרגירים עמילניים. בנוסף, גרגירי עמילן מאותן רקמות של מיני צמחים הם במגוון גדלים עם פרופורציות שונות, כלומר, מציגים התפלגות גודל אופיינית. התפלגות גודל זה מסבכת עוד יותר את הניתוח והתיאור של גדלי גרגירי עמילן.

גדלי גרגירי עמילן נותחו באמצעות מספר קטגוריות של טכניקות שינוי גודל חלקיקים (שנסקרו ב-^{ref. 3}), כולל מיקרוסקופיה, משקעים / שברי זרימת שדה סטריים (Sd / StFFF), עקיפת לייזר ואזור חישה חשמלית (ESZ). עם זאת, טכניקות אלה אינן מתאימות באותה מידה לקביעת גדלי גרגירי עמילן בנוכחות צורת גרגירים והתפלגות גודל. מיקרוסקופיה, כולל מיקרוסקופ אלקטרונים אור, confocal וסריקה, מצוין למחקרים של מורפולוגיה^4,5,6,7, מבנה^8,9 ופיתוח^10,11 של גרגירי עמילן, אבל בקושי מתאים להגדרת חלוקות הגודל שלהם בשל כמה חסרונות אינהרנטיים. מדידות ישירות של תמונות גרגירים מיקרוסקופיות או ניתוח תמונה בסיוע תוכנה של נתוני מיקרוסקופיה אופטיים (IAOM), אשר שימשו לקביעת גדלי גרגירים של עמילנים ממספר מינים, כולל תירס¹², חיטה^13,14, תפוח אדמה¹⁵ ושעורה¹⁶, יכול למדוד רק 1D (בדרך כלל אורך מקסימלי) או 2D (שטח פנים) גדלים של מספרים מוגבלים מאוד (עשרות עד כמה אלפים) של תמונות גרנול עמילן. גדלי דגימת הגרגרים הקטנים המוגבלים מטבעם על ידי הטכניקות יכולים לעתים רחוקות להיות מייצגים סטטיסטית, בהתחשב במספרי הגרגרים העצומים ליחידת משקל של עמילן (~ 120 x 10⁶ לגרם, בהנחה שכל 10 כדורי מיקרומטר בצפיפות של 1.5 גרם לסמ”ק), ולכן, עלולים להוביל לשחזור לקוי של התוצאות. טכניקת Sd/StFFF עשויה להיות במהירות גבוהה וברזולוציה גבוהה, ושברי גודל צרים של גרגירי עמילן¹⁷, אך לעתים רחוקות נעשה בה שימוש כנראה משום שדיוקה עלול להיפגע קשות מנזקים, צורות שונות וצפיפות של גרגירי עמילן. טכניקת עקיפת הלייזר היא הנפוצה ביותר, והוחלה על ניתוחי גודל גרגירים עמילניים עבור כל מיני היבולים העיקריים^3,14,16. למרות הטכניקה יש יתרונות רבים, זה למעשה לא מתאים קביעות של גדלי גרגירים עמילן בנוכחות התפלגות צורת גרגירים. רוב מכשירי עקיפת הלייזר בו-זמנית מסתמכים על תיאוריית פיזור האור של מי¹⁸ עבור חלקיקים כדוריים אחידים ותורת Mie¹⁸ ששונתה עבור צורות אחרות של אחידות. הטכניקה היא, אם כן, מטבעה רגישה מאוד לצורות חלקיקים, ולא לגמרי מתאימה אפילו לצורות מסוימות של אחידות¹⁹, שלא לדבר על גרגירי עמילן שיש להם קבוצה של צורות בפרופורציות שונות. טכניקת ESZ מודדת את הפרעת השדה החשמלי ביחס לנפח החלקיק העובר דרך פתח. הוא מספק גדלי נפח גרנול, כמו גם את פרטי הפצת מספר ונפח, וכו ‘, ברזולוציות גבוהות. מאז טכניקת ESZ אינה תלויה בכל תכונות אופטיות של חלקיקים כולל צבע, צורה, הרכב או אינדקס שבירה, והתוצאות הן מאוד לשחזור, הוא מתאים במיוחד לקביעת התפלגות גודל של גרגירי עמילן שיש קבוצה של צורות.

גדלי גרגירים עמילן הוגדרו גם באמצעות פרמטרים רבים. לעתים קרובות הם תוארו באופן פשטני על ידי קטרים ממוצעים, אשר במקרים מסוימים היו האמצעי האריתמטי של האורכים המקסימליים הנמדדים מיקרוסקופית של תמונות דו-ממדיות^12,20, או ממוצעים של קטרים מקבילים של כדור³. במקרים אחרים, התפלגויות גודל הגרגר צוינו באמצעות טווחי גודל^21,22, נפח ממוצע ההתפלגות או קוטר ממוצע (שווה ערך לכדור, משוקלל לפי מספר, נפח או שטח פנים) בהנחה של התפלגות רגילה^{14,23,24,25,26}. מתארים אלה של גדלי גרגירי עמילן מניתוחים שונים הם בעלי אופי שונה בהרבה, ואינם דומים לחלוטין. זה יכול להיות מטעה מאוד אם אלה “גדלים” של גרגירי עמילן ממינים שונים או אפילו את אותן רקמות של אותו מין הושוו ישירות. יתר על כן, הפרמטר כפולה (או צורה) של התפלגויות נורמליות להניח, כלומר, סטיית התקן σ (או סטיית תקן גרפית σ_g)מדידת רוחב ההתפלגות (כלומר, התפשטות הגדלים), התעלמו ברוב המחקרים.

כדי לפתור את הבעיות הקריטיות הנ”ל הניצבות בפני ניתוחי גודל גרגירי עמילן, התווינו הליך עבור קביעות ניתנות לשחזור ותקף סטטיסטית של התפלגות גודל גרגירים של דגימות עמילן באמצעות טכניקת ESZ, ולציון נכון של התפלגות הגודל הלוגנורמי של גרגיר הגרגרים שנקבעו באמצעות טופס כפול שני פרמטרים^{מאומץ 27} עם דיוק ושיוויון משופרים. לצורך אימות והדגמה, ביצענו ניתוחי גודל גרנול משכפלים של דגימות עמילן sweetpotato באמצעות ההליך, וציינו את הפרש הלוגינורמלי נפח אחוז שווה ערך כדור קוטר התפלגות באמצעות האמצעים הגיאומטריים הגרפיים שלהם סטיות תקן כפולות s* בצורת ^x/ (להכפיל ולחלק) s* .

Protocol

1. הכנת דגימות עמילן הכינו שתי (או שלוש) דגימות עמילן משוכפלות בקנה מידה של גרם מרקמות צוברות עמילן של מיני צמחים שונים בעקבות ההליכים שנקבעו (למשל, תפוחי אדמה15, בטטפוטו28, גרגרי חיטה13,29, וגרעיני תירס30, וכו ‘). בי…

Representative Results

כדי לאמת את ההליך, ולהפגין שחזור של התפלגות גודל הגרגר שנקבע, ביצענו ניתוחי גודל משוכפלים של דגימות עמילן sweetpotato. הכנו דגימות עמילן משוכפלות (S1 ו- S2) מממתקים שגודלו בשדה של קו רבייה SC1149-19 בגיל התפתחותי דומה באמצעות הליך שתואר קודם לכן28. מכל תמצית עמילן, שני aliquots 0.5 גרם (a ו- b) נדגמו,…

Discussion

ההליך המתואר פתר כמה בעיות קריטיות במספר שיטות קיימות לניתוחי גודל גרגירי עמילן, כולל שינוי גודל לא הולם של גרגרי תלת-ממד או דו-ממדיים, עיוות מדידות שינוי גודל עקב צורות גרגירים לא אחידות, יכולת רבייה ירודה ותוקף סטטיסטי מפוקפק עקב גדלים מוגבלים של דגימת גרגירים, מפרט לא מדויק או לא תקין (ב?…

Materials

Analytical beaker	Beckman Coulter Life Sciences	A35595	Smart-Technology (ST) beaker
Aperture tube, 100 µm	Beckman Coulter Life Sciences	A36394	For the MS4E, , 1000 µm
Disposable transfer pipettor,	Fisher Scientific (Fishersci.com)	13-711-9AM	Other disposable transfer pipettors with similar orifice can also be used.
Fisherbrand Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50 ml	Fisher Scientific (Fishersci.com)	05-539-13	Any other similar types of tubes can be used.
Glass beakers, 150 to 250 ml	Fisher Scientific (Fishersci.com)	02-540K	These beakers are used to contain methanol for washing the aperture tube and stirer between runs.
LiCl	Fisher Chemical	L121-100
Methanol	Fisher Chemical	A412-500	Buy in bulk as the analysis uses a large quantity of methanol.
Mettler Toledo ML-T Precision Balances	Mettler Toledo	30243412	Any other precision balance with a readablity 0.01 g to 1 mg will work.
Multisizer 4e Coulter Counter	Beckman Coulter Life Sciences	B23005	The old model, Multisizer 3 can also be used with slight adjustment of parameters. The 4e model comes with a 100 μm aperture tube. Other aperture tubes of different diameter can be purchased separately from the company.
Ultrasonic processor UP50H	Hielscher Ultrasound Technology	UP50H	Other laborator sonicator having a low-power (<50 Watt) output can be also used. Both MS1 and MS2 sonotrodes for the particular sonicator can be used to disperse starch granules in 5 ml methanol. Always use the lowest setting first, 20% amplitude and 0.1 or 0.2 cycle, and raise the setting if aggregates persist in suspension.