Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Induksjon av mikrostreaming ved ikke-sfæriske bobleoscillasjoner i et akustisk levitasjonssystem

Published: May 9, 2021 doi: 10.3791/62044
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2
1Univ Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, Centre Léon Bérard, INSERM, UMR 1032, LabTAU, France, 2Univ Lyon, Ecole Centrale de Lyon, INSA de Lyon, CNRS, LMFA UMR 5509, France

Summary

En rask og pålitelig teknikk foreslås for å kontrollere formsvingningene til en enkelt, fanget akustisk boble som er basert på koalescensteknikk mellom to bobler. De steady-state, symmetristyrte bobleformoscillasjonene tillater analyse av væskestrømmen som genereres i nærheten av boblegrensesnittet.

Abstract

Når de ligger nær biologiske barrierer, kan oscillerende mikrobobler øke cellemembranpermeabiliteten, noe som muliggjør internalisering av legemidler og gener. Eksperimentelle observasjoner tyder på at den midlertidige permeabiliseringen av disse barrierene kan skyldes skjærspenning som utøves på cellevev ved kavitasjonsmikrostreaming. Kavitasjonsmikrostreaming er genereringen av virvelstrømmer som oppstår rundt oscillerende ultralydmikrobobler. For å produsere slike væskestrømmer må bobleoscillasjoner avvike fra rent sfæriske svingninger og inkludere enten translasjonsstabilitet eller formmodus. Eksperimentelle studier av bobleinduserte strømmer og skjærspenning på nærliggende overflater er ofte begrenset i omfang på grunn av vanskeligheten med å fange formdeformasjoner av mikrobobler på en stabil og kontrollerbar måte. Vi beskriver utformingen av et akustisk levitasjonskammer for studier av symmetrikontrollerte ikke-sfæriske svingninger. Slik kontroll utføres ved å bruke en koalescensteknikk mellom to nærliggende bobler i et tilstrekkelig intenst ultralydfelt. Kontrollen av ikke-sfæriske svingninger åpner veien for en kontrollert kavitasjon mikrostreaming av en fri overflate-oscillerende mikroboble. Kameraer med høy bildefrekvens gjør det mulig å undersøke kvasi-samtidig den ikke-sfæriske bobledynamikken ved den akustiske tidsskalaen og væskestrømmen på en lavere tidsskala. Det er vist at et stort utvalg av væskemønstre kan oppnås, og at de er korrelert med det modale innholdet i boblegrensesnittet. Vi demonstrerer at selv høyordensformmodusene kan skape væskemønstre over store avstander hvis grensesnittdynamikken inneholder flere moduser, noe som fremhever potensialet for ikke-sfæriske svingninger for målrettet og lokalisert legemiddellevering.

Introduction

I medisin må et administrert legemiddel trenge gjennom mange hindringer i levesystemet før de når de ønskede målene. Imidlertid blir de fleste medisiner raskt renset bort fra blodstrømmen. Målrettingseffektiviteten er lav, og de kan ikke lett krysse cellemembraner, noe som fører til ineffektiv legemiddellevering. For tiden har bruk av mikrobobler i kombinasjon med ultralyd blitt foreslått som en innovativ metode for ikke-invasiv, presis og målrettet levering av medisiner og gener til patologiske vev og celler1. I denne tilnærmingen kan mikrobobler spille en rolle som bærere der gratis legemidler enten injiseres samtidig med en gassboblesuspensjon eller lastes på overflaten. Mikrobobler kan også fungere som en lokal vektor for å refokusere ultralydenergien for å interagere med cellene. I utgangspunktet, under ultralydeksponering, komprimerer og utvider bobler stabilt, et regime som kalles stabil kavitasjon som genererer væskestrømmer og dermed skjærspenning på nærliggende gjenstander. Mikrobobler kan også svinge ikke-lineært og ekspandere til kollaps, i treghetskavitasjonsregimet, og produsere sjokkbølger som forplanter seg radialt fra kollapsstedet2. Det har vist seg at kavitasjon, enten stabil eller treghet, forbedrer permeabiliseringen av cellemembraner, og forbedrer dermed internaliseringen av legemidler i cellen3.

I terapeutiske anvendelser er det svært viktig å forstå mekanismen for boble-celle-interaksjonen, men det er flere barrierer, både fra vitenskapelige og tekniske sider, som hindrer vår kunnskap i å utvikle seg. For det første er det svært vanskelig å fange dynamikken til celler som respons på bobleinduserte mekaniske stimuli4. På den akustiske tidsskalaen kan førsteordens mikrobobleoscillasjoner føre til aktivering av membrankanaler, noe som letter molekylær passasje over biologiske grensesnitt. Dette skjer gjennom direkte svingning av cellemembranen, også kalt "cellulær massasje"5. Kanalaktivering etter direkte mekanisk belastning ble påvist ved hjelp av patch-clamp-teknikker som målte elektrofysiologiske egenskaper til cellemembraner under og etter ultralydeksponering6. Måling av bobleindusert celledynamikk (som betyr hele feltet for deformasjon av cellemembranen) på den akustiske tidsskalaen, vil også gi innsikt i terskelen for membranområdeutvidelse ΔA / A som kreves for å indusere porene i cellemembranen7. Den andre barrieren er å kontrollere det kollapsende bobleregimet for å unngå mikrobobleindusert cellelyse. Boblekollapser og induserte mikrostråler har blitt identifisert som en mekanisme gjennom hvilken membranperforering skjer 8,9. Når den er permeabilisert, reparerer cellemembranen gjennom kalsiumselvforsegling av lipid-dobbeltlagene og fusjon av intracellulære vesikler9. Forekomsten av boblekollapser kan også forårsake dødelige skader på cellen og indusere unødvendige bivirkninger i de omkringliggende. I sensitive applikasjoner som ultralydmediert blod-hjernebarriereåpning er det generelt akseptert at treghetsboblekollapser bør unngås10.

Derfor er det for tiden lagt stor vekt på utformingen av ultralydutslippssekvenser, kombinert med passiv kavitasjonsovervåking og kontroll, for å sikre stabile svingninger av mikrobobler11. I dette stabile regimet har det blitt antatt at stabilt oscillerende bobler spiller en sterk rolle i utløsningen av membranpermeabilisering ved å fremme romlig målrettet skjærspenning på cellemembranen7. Skjærspenningen skyldes væskestrømmene som oppstår i nærheten av de oscillerende boblene. Disse væskestrømmene kalles kavitasjonsmikrostreaming, og som nevnt ovenfor er de en av flere mulige mekanismer som er ansvarlige for økt opptak av ekstracellulære molekyler. Når det gjelder suspensjon av bobler eller celler som in vitro biologiske transfeksjonsanalyser12, kan permeabilisering ved mikrostreaming være mye mer effektiv enn permeabilisering ved boblekollaps. Dette kan vises ved en enkel geometrisk vurdering. I cellesuspensjoner vil sonoporasjon være effektiv hvis flertallet av de suspenderte cellene blir utsatt for tilstrekkelig store mekaniske effekter (som fører til membranpermeabilisering). Det er kjent at boblekollapser er rettet langs retningen av isotrop symmetribrudd, for eksempel bobleveggaksen13 eller bobleboble- og boblecellelinjen som forbinder deres massesenter14. Den produserte mikrostrålen er derfor et romlig lokalisert fenomen langs et endelig antall linjer som forbinder celle- og boblesentrene. Avhengig av celle- og boblekonsentrasjonen, så vel som boblecelleavstanden, kan denne effekten ikke være den mest effektive for å permeabilisere hele antall suspenderte celler. I motsetning til dette er kavitasjonsmikrostreaming et fenomen som forekommer på en langsom tidsskala, med en stor romlig ekspansjon i forhold til bobleradiusen. Væskestrømmen fordeles også rundt boblen, og kan derfor påvirke et større antall celler, på svært lang avstand. Derfor er forståelse av den genererte kavitasjonsmikrostrømmen rundt en oscillerende boble en forutsetning for å kontrollere og kvantifisere det bobleinduserte skjærspenningen som påføres celler.

For å gjøre dette består et foreløpig trinn i å kontrollere de sfæriske og ikke-sfæriske svingningene til en ultralyddrevet boble, da de genererte væskestrømmene induseres av bevegelsen til boblegrensesnittet15,16. Spesielt må formsvingninger av mikrobobler utløses og holdes stabile. Videre må orienteringen av bobleformoscillasjonene kontrolleres for å analysere korrelasjonen mellom boblegrensesnittdynamikken og det induserte mikrostreamingmønsteret riktig. Når man oppsummerer eksisterende litteratur, er det åpenbart at detaljerte eksperimentelle resultater av kavitasjonsindusert mikrostreaming bare er tilgjengelige for bobler festet til en overflate. Veggfestede mikrobobler brukes ofte til å vurdere nøyaktig grensesnittdynamikk og celleinteraksjoner på mikrometerskala under et ultrafast mikroskopisystem. Denne konfigurasjonen er terapeutisk relevant når man vurderer vibrerende mikrobobler plassert på cellemembranen17,18,19. Studien av substratfestet boble kan imidlertid gjøre analysen av bobledynamikk mer komplisert, delvis på grunn av den komplekse naturen til kontaktlinjedynamikk20, og utløsningen av asymmetriske formmodi21. I medisinske og biologiske applikasjoner, bobler som ikke er festet til en vegg er ofte funnet i begrensede geometrier som små fartøy. Dette påvirker bobledynamikken og formustabiliteten betydelig. Spesielt forskyver tilstedeværelsen av en nærliggende vegg trykkterskelen for formmodus som utløser lavere trykkverdier avhengig av formmodusnummer og boblestørrelse22. Veggen påvirker også den bobleinduserte mikrostrømmen med muligens høyere intensitet for den produserte strømmen23.

Blant alle mulige scenarier som mikrobobler kan oppleve (fri eller festet, nær en vegg, kollapser eller stabilt oscillerende), foreslår vi å undersøke den ikke-sfæriske dynamikken til en enkelt boble langt fra noen grense. Det eksperimentelle oppsettet er basert på et akustisk levitasjonssystem24 der en stående ultralydbølge brukes til å fange boblen. Dette scenariet er konsistent med medisinske applikasjoner der en samling av suspenderte bobler og celler sameksisterer i et sonotransfeksjonskammer, for eksempel. Så langt som bobler og celler ikke er for nært, antas det at tilstedeværelsen av en celle ikke påvirker boblegrensesnittdynamikken. Når celler følger de sløyfelignende banene til den kavitasjonsinduserte mikrostrømmen, nærmer de seg syklisk og frastøter seg fra bobleplasseringen, og vi kan anta at celletilstedeværelsen verken påvirker strømningsmønsteret eller dets gjennomsnittlige hastighet. I tillegg er ikke-sfærisk dynamikk og indusert mikrostreaming fra enkeltbobler langt fra grense velkjent fra et teoretisk synspunkt. For å koble den bobleinduserte væskestrømmen til boblekonturdynamikken, er det nødvendig å nøyaktig karakterisere boblegrensesnittdynamikken. For å gjøre dette er det å foretrekke å tilpasse den spatiotemporale skalaen i eksperimentelle studier med hensyn til de som brukes i terapeutikk, slik at oppkjøp med vanlige høyhastighetskameraer (under 1 million bilder / sekund) er mulig ved å bruke store bobler eksitert ved lavere frekvenser. Når man vurderer ubelagte bobler, er egenfrekvensen ω n for en gitt modus n relatert til boblestørrelsen som Equation 125. Dette radius-egenfrekvensforholdet er litt modifisert når man vurderer avskallede bobler26, men størrelsesordenen til egenfrekvensen ωn forblir den samme. Dermed er undersøkelse av bobler med likevektsradier ~ 50μm i et 30 kHz ultralydfelt lik å studere belagte bobler av radier ~ 3μm i et 1.7 MHz-felt, som foreslått av Dollet et al.27. Lignende formmodusnumre og dermed mikrostreamingmønstre forventes derfor.

For å utløse ikke-sfæriske svingninger i boblegrensesnittet, er det nødvendig å overskride en viss trykkterskel som er radiusavhengig, som vist i figur 1. Eksisterende eksperimentelle teknikker er avhengige av økningen av det akustiske trykket for å utløse overflatemoduser (illustrert ved bane (1) i figur 1), enten ved trinnvis trykkøkning28 eller ved modulert amplitudeeksitasjon som er ansvarlig for periodisk utbrudd og utryddelse av overflatemodus29. De viktigste ulempene med disse teknikkene er (i) en tilfeldig orientering av symmetriaksen til overflatesvingningene som ikke kan kontrolleres for å være i avbildningsplanet, (ii) en kort levetid for bobleformsvingningene som gjør analysen av de induserte væskestrømmene vanskelig ved større tidsskalaer, og (iii) den hyppige utløsningen av ustabile formmoduser. Vi foreslår en alternativ teknikk for å krysse trykkterskelen ved et konstant akustisk trykk i radius/trykkkartet, som illustrert ved banen (2) i figur 1. For å gjøre det, er det nødvendig å øke boblestørrelsen slik at den vil være i ustabilitetssonen. En slik økning utføres ved en boblekoalescensteknikk. Koalescensen av to, i utgangspunktet sfærisk oscillerende, mikrobobler utnyttes for å skape en enkelt deformert boble. Hvis det akustiske trykket og boblestørrelsen til den koalescerte boblen er i ustabilitetssonen, utløses overflatemoduser. Vi viste også at koalesensteknikken induserer stabile formsvingninger i et steady-state-regime, samt en kontrollert symmetriakse definert av rettlinjet bevegelse av de to nærliggende boblene. Fordi en stabil formsvingning sikres over minutter, er analysen av bobleindusert væskestrøm mulig ved å så væskemediet med fluorescerende mikropartikler, opplyst av et tynt laserark. Registrering av bevegelsen av de faste mikropartiklene i nærheten av boblegrensesnittet gjør det mulig å identifisere mønsteret av den induserte væskestrømmen30. Det overordnede prinsippet for utløsing av bobleformsvingninger, som fører til en tidsstabil væskestrøm, er illustrert i figur 2.

I den følgende protokollen skisserer vi trinnene som kreves for å skape stabile bobleformoscillasjoner via koalesensteknikken og beskriver målingene av væskestrøm. Dette inkluderer utformingen av det akustiske levitasjonssystemet, den akustiske kalibreringen, boblekjernedannelsen og koalesensteknikken, måling av boblegrensesnittdynamikk og omgivende væskestrøm og bildebehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Design av det akustiske levitasjonskammeret

  1. Design en optisk gjennomsiktig (PMMA-lignende) kubikktank (8 cm kant og 2,8 mm tykkelse per ansikt) med geometrimodulen til en multifysikksimuleringsprogramvare (materialfortegnelse).
  2. Sett inn en sylindrisk overflate (Ø = 35 mm) sentrert i bunnen av tanken, for å modellere ultralydtransduseren.
  3. Sett grensebetingelsene til nulltrykk på hver vegg med en normal forskyvning av amplitude 1 μm på transduseroverflaten.
  4. Bruk en frekvensdomenemodul til å simulere frekvensresponsfunksjonen (FRF) til tanken i frekvensområdet [10 - 40] kHz, på de tre vilkårlige stedene loc1 = (0,01375, 0,01375, 0,04125), loc2 = (0, 0, 0,0088) og loc3 = (0,021725, 0,023375, 0,00935).
  5. Tilpass tankstørrelsen slik at en av de akustiske modusene i hulrommet tilsvarer transduserens nominelle frekvens (her 31,2 kHz). FRF inneholder derfor én resonanstopp nær denne frekvensen, som illustrert i figur 3.
  6. Plott trykkfeltet inne i tanken, som vist i figur 4. Den valgte resonansmodusen må inneholde minst en trykkantinode i beholderens indre, som den akustiske boblen vil bli fanget på.
  7. Når du designer tanken, designer du et bevegelig toppflate med et styrespor på hver kant for å lukke tankflatene tett. Bor et lite hull på oversiden for å fylle tanken med væskemediet.
  8. Plasser vanntanken på toppen av en hjemmelaget ramme som inneholder ultralydtransduseren (Langevin-type, 31,2 kHz nominell frekvens). Bruk ekkografisk gel til å koble transduseren til tankens bunnvegg.
  9. Plasser tanken og rammesystemet på toppen av et treveis forskyvningsbord med mikrometriske skruer.
  10. Fyll tanken med mikrofiltrert, demineralisert og vann (ikke avgasset, volum ~ 500 ml, oksygenmetning på omtrent 8 mg · L-1).
    MERK: Bruk av ikke avgasset vann i stedet for avgasset gjør det mulig å opprettholde stabile bobler i løpet av forsøkene. Bruk av avgasset vann vil akselerere boblekrymping på grunn av gassdiffusjon, selv om det oppveies litt av utbedret (ultralydmediert) diffusjon.

2. Boblegenerering og akustisk kalibrering

  1. Forbered det eksperimentelle oppsettet som brukes til laserindusert boblekjernedannelse, akustisk eksitasjon og høyhastighetsopptak (figur 5a, b, c). Det eksperimentelle oppsettet består av (A) det akustiske levitasjonssystemet, (B) laserstrømforsyningen og (C) laserhodet, (D) en sfærisk konkav linse, (E) en plano-konkav linse og en asfærisk linse, (F) høyhastighetskameraet, (G) den kontinuerlige lysemitterende dioden. Senere, for målinger av væskestrømmer (figur 5d) (H) vil en kontinuerlig bølgelaserkilde, (I) en sylindrisk plano-konkav linse etterfulgt av en sylindrisk plano-konkav linse satt inn bak den første linsen og orientert på den ortogonale aksen bli lagt til.
  2. Koble ultralydtransduseren til en funksjonsgenerator. Sett eksitasjonssignalet som: sinusformet bølgeform, kontinuerlig bølge, frekvens 31,2 kHz. Amplituden er den eneste variable parameteren.
  3. Plasser objektivet (D) i en avstand på ca. 6 cm foran laserhodet (C).
  4. Plasser objektivet (E) i en avstand på ca. 12 cm foran objektivet (D).
  5. Plasser vanntanken (A) slik at et fokuspunkt for laseren er plassert inne i vanntanken, noe som fører til gnistgenerering for hver laserpuls (5 -10 mJ). Lasergnisten skal være plassert ca. 3 cm under den målrettede trykkantinoden.
    MERK: Uten ultralyd (US) vil laserkjernet boble stige til toppflaten på grunn av oppdrift.
  6. Slå på ultralydtransduseren. Øk den påførte spenningen til boblen ikke lenger stiger vertikalt, men avvikes mot trykkantinoden og, for tilstrekkelig høyt trykk, fanget.
  7. Still inn bakgrunnsbelysningen (kontinuerlig lysemitterende diode) og høyhastighetskameraet for å observere den fangede boblen.
    MERK: Når du kjerner en ny boble med en lasergnist, er det lett å fange banen til boblen som nærmer seg fangststedet.
  8. Flytt plasseringen av lasergnisten i vanntanken slik at boblebanen forblir inne i kameraets fokalplan.
  9. Fang en boble og fang opp dens radiale svingninger med følgende parametere: rammestørrelse 128 x 128 piksler, oppkjøpshastighet 180 kHz. Et eksempel på radiale svingninger med stor amplitude over to akustiske perioder er gitt i figur 6. Typiske gassbobler varierer fra 30 til 80 μm.
  10. Registrer boblens radiale svingninger i løpet av 3 til 30 millisekunder for å fange hundrevis til tusenvis av boblesvingninger. Gjenta dette opptaket for å øke påførte spenninger på transduseren. Typiske påførte spenninger ligger i området 0 - 8 V.
    MERK: Når du endrer den påførte spenningen, beveger likevektsplasseringen til den fangede boblen litt vertikalt. For å følge svingningene uten å flytte bakgrunnsbelyst belysning og kamera, plasser systemet (svinger og vanntank) på et bevegelig bord i tre retninger med mikrometrisk nøyaktighet.
  11. Slå på ultralydtransduseren og ta ett bilde av bakgrunnen for etteranalyse.
  12. Etterbehandle videoserien ved å følge denne fremgangsmåten:
    1. Kjør den kjørbare filen VoltagePressure.exe. Grensesnittet vist i figur 7 skal åpnes.
      MERK: Skriptet er tilgjengelig som et tilleggsdokument.
    2. Angi de fysiske og eksperimentelle parametrene i venstre kolonne (figur 7A).
    3. Angi verdiene for påført spenning for serien av opptak nederst til høyre (figur 7B).
    4. I panelet Bobleradiusanalyse klikker du på Last inn parametere (figur 7C) og velger mappen som inneholder alle filene i videoserien din, og deretter bakgrunnsbildet (obligatorisk).
    5. Valget er tillatt mellom å analysere alle videoene samtidig, ved å klikke på Auto, eller en etter en ved å klikke på Trinn for trinn.
    6. For hver videofil plottes utviklingen av bobleradiusen over en akustisk periode, og en numerisk tilpasning legges over. Den røde kurven tilsvarer en linearisert Rayleigh-Plesset-modellering. Likevektsbobleradiusen vises (figur 7D).
    7. I henhold til numerisk montering vises det påførte trykket for denne spenningen i grafpanelet for trykk (spenning) (figur 7E). Verdien av det påførte trykket vises også i tabellen nederst til høyre (figur 7B). Typiske påførte trykk tilsvarende 0 - 8 V spenningsdynamikk er 0 - 25 kPa.
    8. Når alle videoene er behandlet, klikker du på Lineær regresjonsknapp for å utføre en lineær tilpasning av trykk / spenningskurven. Dataene (spennings- og trykkverdier) lagres i en .txt fil som ligger i gjeldende katalog. Hellingen av passformen er gitt.

3. Koalescens teknikk

  1. Slå på ultralydtransduseren. Sett den påførte spenningen høyt nok slik at det tilsvarende akustiske trykket kan føre til utløsning av overflatestabilitet, i henhold til det numeriske trykk/radiusdiagrammet for ustabilitetssoner, som vist i figur 8.
  2. Kjerne en boble, som deretter vil migrere til overlappingsstedet. Hvis den fangede boblen bare viser sfæriske svingninger, går du videre til neste trinn. Hvis ikke-sfæriske svingninger vises:
    1. Slå av ultralydseffekten for å la boblen stige til toppoverflaten.
    2. Endre laserenergien (ved å finjustere over noen få mJ) eller reduser svingerspenningen.
    3. Slå på ultralydstrømmen.
    4. Kjerne en ny boble.
    5. Gjenta denne prosedyren til boblestørrelsen fører til rent sfæriske svingninger.
  3. Når en fanget boble bare viser sfæriske svingninger, genererer du en ny lasergnist. Når den nye boblen når overlappingsstedet, oppstår koalescens.
  4. Hvis den koalescerte boblen bare viser sfæriske svingninger, generer en ny boble. Flere koalescenser kan være nødvendig for å nå bobleradiusen der ikke-sfæriske deformasjoner oppstår. Et eksempel på boblekoalescens som fører til ikke-sfæriske svingninger er vist i figur 9.
  5. Når den koalescerte boblen viser ikke-sfæriske svingninger, registrerer du bobleoscillasjonene i en varighet på omtrent 3 til 30 millisekunder.
  6. Identifiser modusen antall figursvingninger ved å referere til figur 10.

4. Målinger av væskestrøm

  1. Ved måling av mikrostrømming av kavitasjon må fluorescerende sporstoffpartikler tilsettes vannet før boblekjernedannelse. I denne studien brukes 0,71 μm partikler (Table of Materials). De er tilstrekkelig små til å være akustisk gjennomsiktige (ikke påvirket av den akustiske strålingskraften) og til å følge strømmen nøyaktig, så vel som tilstrekkelig store til å spre laserlys. Bruk tre dråper til vanntankens volum, tilsvarende ca. 2,104 partikler/mm3.
  2. Før du tar målinger, må du angi følgende parametere for å fange både bobledynamikken (rask tidsskala) og (lav tidsskala) væskestrøm:
    1. Opprett en partisjonering av kameraopptaksdisken.
    2. Alternativt kan du definere opptaksparametrene som:
      1. Bildefrekvens 180 kHz, bildestørrelse 128 x 128 piksler og eksponeringstid 1 μs for ett opptak av dynamikken i boblegrensesnittet
      2. Bildefrekvens 600 Hz, bildestørrelse 1024 x 768 piksler og eksponeringstid 1 ms for ett opptak av bevegelsen til fargesporere.
  3. Bruk en kontinuerlig laser.
  4. Lag et tynt laserark ved suksessivt å la laserstrålen passere gjennom sylindrisk plano-konkav linse og sylindrisk plano-konveks linse orientert på en ortogonal akse. En strålebredde på ca. 160 μm kan oppnås.
  5. Sett opp laserarket slik at det tilsvarer avbildningsplanet:
    1. Sett laseren på en bevegelig enhet slik at laserarket kan flyttes parallelt med bildeplanet.
    2. Juster posisjonen slik at de opplyste partiklene er synlige av kameraet.
    3. Nukleer og fang en boble.
    4. Juster laserarkets posisjon ytterligere, slik at en skygge blir synlig bak boblen. Boblen er nå inne i laserarket, som vist i figur 11.
  6. Indusere boblekoalescens til en stabilt oscillerende formmodus er tydelig.
  7. Gjør flere opptak som veksler frem og tilbake mellom bobledynamikk og mikrostreaming.
    MERK: Slå av kontinuerlig laser når du ikke trenger den. Oppvarming kan skape uønskede konvektive strømmer. Slå også av den lysemitterende dioden når du utfører målingene av strømmestrømmen.

5. Bildebehandling for å visualisere kavitasjon microstreaming mønstre

  1. Installer visualiseringsprogramvaren ImageJ for bildebehandling og analyse i Java. Installer også pluginet CINE File Reader for å åpne høyhastighetskamerafilene.
  2. Klikk på Fil | Import | CineFile og velg videoen *.cine inneholder fangst av partikkelen bevegelse.
  3. Velg Bruk virtuell stabel i det nye vinduet, videoen er nå lastet inn.
  4. For å observere partikkelbevegelsen uten å vise streamingmønsteret, klikk på Image | Justere | Lysstyrke/kontrast | Automatisk. Den mørke bakgrunnen er nå erstattet av et automatisk optimalisert bilde.
  5. For å vise det resulterende mønsteret, klikk på Bilde | Stabler | Z Projiser og velg alternativet Maksimal intensitet for bildeprojeksjonen. Det vises et utdatabilde med bildepunkter som inneholder maksimumsverdien over alle bildene i stakken. Juster om nødvendig bildekontrasten som beskrevet i trinn 5.4.
    MERK: Et streamingmønster som de som er vist i figur 12b og figur 12d er oppnådd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En komplett sekvens av boblekoalescens som fører til tidsstabile, symmetrikontrollerte ikke-sfæriske svingninger er presentert i figur 9. Den nærliggende fasen av to sfærisk oscillerende bobler slutter når den tynne væskefilmen mellom de to boblene brister. Det er verdt å merke seg at boblegrensesnittene i det siste stadiet før koalescensen avviker fra sfærisitet. Begge boblene forlenges på en ellipsoidal form langs banen til den rettlinjede bevegelsen av tilnærming. Etter øyeblikk av koalescens forblir en enkelt boble og utviser ikke-sfæriske svingninger med en kompleks form i noen få akustiske perioder. Dette tilsvarer det forbigående regimet av svingninger, etter eksitering av et dynamisk system. Etter et dusin til hundre akustiske perioder stabiliserer formsvingningene seg på en steady-state svingning, her vist for en modus 4, som kan utledes fra tolkningen av figur 10. Denne modusen kan vedvare i tusenvis av akustiske perioder, i flere millisekunder til noen få minutter. Dette tillater kvasi-samtidige målinger av bobleinduserte væskestrømmer.

Når en boble er fanget og viser jevne svingninger, fanges bevegelsen av fluorescerende sporstoffer i bobleområdet, som vist i figur 11. For det første er fraværet av partikkelbevegelse for en boble som viser rent sfæriske svingninger konsistent med flere kavitasjonsmikrostreamingmodeller31 som viser at ingen vortisitet induseres av rene radiale svingninger. Når formsvingninger oppstår, produseres væskebevegelse i nærheten av boblegrensesnittet, som vist i figur 12. Den alternative registreringen av dynamikken til boblegrensesnittet på den akustiske tidsskalaen (figur 12a, c) og av bevegelsen av partikler på en lavere tidsskala (figur 12b, d) gjør det mulig å korrelere mikrostreamingmønsteret til et gitt formmodusnummer. Figur 12a presenterer en øyeblikksbildeserie av bobledynamikken for en boble med gjennomsnittlig radius R0 = 70,5 μm, drevet ved det akustiske trykket Pa = 12,8 kPa, som hovedsakelig svinger på en modus 3. Det tilhørende mikrostreamingmønsteret, i figur 12b, består av seks lober. Bevaringen av symmetriaksen mellom formmodussvingninger og mikrostreamingmønsteret er tydelig synlig. Figur 12c presenterer en øyeblikksbildeserie av bobledynamikken for en boble med gjennomsnittlig radius R0 = 55,7 μm, drevet ved det akustiske trykket Pa = 23,6 kPa, som hovedsakelig svinger på en modus 4. Det tilhørende mikrostreamingmønsteret i figur 12d består av åtte små fliker av størrelsen på boblediameteren. Nok en gang er bevaringen av symmetriaksen mellom formmodussvingninger og mikrostreamingmønsteret tydelig synlig. Disse resultatene ser ut til å bekrefte at jo høyere rekkefølge formmodusene er, desto mindre er mikrostreamingmønsteret og jo mer begrenset er de i boblenærheten.

Denne antagelsen om et smalere strømmemønster for høyere ordens moduser er ikke like åpenbar og avhenger av det modale innholdet i boblegrensesnittdynamikken. Faktisk må vi huske at bobleindusert væskestrøm skyldes samspillet mellom to formmodi som svinger med samme frekvens, eller selvinteraksjonen til en modus med seg selv31. En boble som hovedsakelig svinger på en gitt formmodus, for eksempel la oss vurdere en modus 3, kan også opphisse andre ikke-sfæriske svingninger gjennom ikke-lineær kobling mellom modi29. Hvis dynamikken i boblegrensesnittet inneholder tilleggsmoduser, for eksempel den andre og fjerde (for eksempel), kan mikrostreamingstrømmen endres betydelig på grunn av flere interaksjoner mellom moduser som vil generere spesifikke mønstre. Dette er illustrert i figur 13 for to bobler som hovedsakelig svinger på en modus 3, som induserer to forskjellige mikrostreamingmønstre. I figur 13a,b,c, presenterer en boble av likevektsradius R0 = 70,1 μm, drevet ved det akustiske trykket Pa = 12,4 kPa, svingende på en modus 3, et lappemønster. Analyse av grensesnittdynamikken (figur 13b) viser at de dominerende modusene er den radiale (oscillerende ved kjørefrekvensen f 0), den translasjonelle (modus med nummer 1, svingende ved halvparten av kjørefrekvensen f 0), den tredje (oscillerende ved f 0/2) og en relativt liten fjerde og sjette modus (begge svinger ved f 0). Det kan antas at hovedbidraget til mikrostreamingstrømmen er samspillet mellom radiell modus og modus 4 og 6, noe som fører til et lobe-type mønster31. I figur 13d,e,f presenterer en boble av likevektsradius R0 = 68,6 μm, drevet ved akustisk trykk Pa = 13,3 kPa, oscillerende på modus 3, et krysstypemønster, med strømningsforlengelse av store avstander. Analysen av grensesnittdynamikken (figur 13d) avslører at de dominerende modusene er den radiale, den translasjonelle (modus med nummer 1), den tredje og den sjette. I henhold til den høye amplituden til modus 3 kan det antas at hovedbidraget til mikrostreamingstrømmen er selvinteraksjonen til modus 3, noe som fører til et krysstypemønster32.

Figure 1
Figur 1. Illustrasjon av metoden for å utløse figursvingninger. Trykk/radius-kartet inneholder en ustabilitetssone per modus av en gitt grad. Trykkterskelen for å nå denne sonen kan krysses ved å (1) øke det påførte akustiske trykket som driver en gassboble med fast radius, til formmoduser vises, eller (2) øke boblestørrelsen ved et konstant påført akustisk trykk. Slike økninger i boblevolumet skjer sakte når korrigert diffusjon oppstår, mens boblekoalescens fester prosessen betydelig. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. Illustrasjon av boblekoalesensteknikken. Tilnærmingsfasen (A) består av laserkjernende to bobler som møter hverandre på samme fangststed i beholderen. Når de møtes, oppstår koalescens: brudd på den tynne væskefilmen mellom bobler (B) fører til generering av en enkelt, opprinnelig deformert, boble. Denne deformerte boblen drives av det monokromatiske ultralydfeltet og viser ved første forbigående svingninger (C), før den går inn i steady-state-regimet. I steady-state-regimet (D) viser den koalescerte boblen tidsstabile, symmetrikontrollerte formsvingninger. Ved å så mediet med fluorescerende nanopartikler, fanges den bobleinduserte væskestrømmen (E). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. Frekvensresponsfunksjon av trykkfeltet i levitasjonssystemet. Amplituden til det akustiske trykket vises som en funksjon av frekvensen, for tre steder inne i tanken som tilsvarer følgende (x,y,z) koordinater: (1) blå, (2,05,2,05,6) cm, (2) rød, (0,0,1,28) cm og (3) svart, (3,23,3,48,1,36) cm, hvor opprinnelsen til koordinatsystemet er tatt i midten av kubikktankens bunnflate. I nærheten av 31,5 kHz er en resonansmodus tydelig synlig. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4. Fordeling av det akustiske trykket i levitasjonskammeret. (A) Tredimensjonal representasjon av trykkfeltet i den kubiske vanntanken for den valgte resonansmodusen. Denne modusen oppstår ved frekvensen 31, 2 kHz som svarer til frekvensen av ultralydkilden. (B) Fordeling av det akustiske trykket i tankens diagonale plan. (C) Fordeling av det akustiske trykket i et horisontalt (høyde z = konstant) plan. Høyden er valgt slik at den tilsvarer plasseringen av trykkantinoden i tankens øvre del. Amplitudene til fargestangen oppnås ved å pålegge en normal forskyvning på 1 μm på transduseroverflaten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5. Fotografier og skjemaer av det eksperimentelle oppsettet. Den består av (A) det akustiske levitasjonssystemet, (B-C) den pulserende laserforsterkeren og laserhodet, (D-E) fokusobjektivsettet, (F) høyhastighetskameraet, (G) den lysemitterende dioden, (H) den kontinuerlige bølgelaseren og (I) formingslinsesettet. (a) En side og (b) en toppvisning av det eksperimentelle oppsettet. (c) Illustrasjon av materialene som kreves for å fange boblesvingningene. Merk at kontinuerlig laser (H) slås av under denne prosessen. (d) Illustrasjon av materialene som kreves for å fange væskestrømmene. Merk at den pulserende laseren (C) for boblekjernedannelse er slått av, mens den kontinuerlige laseren (H) for å generere et laserark som belyser mikropartikkelsporerne er på. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6. Snapshot-serie av en ultralyddrevet boble som viser store amplitude sfæriske svingninger. Boblelikevektsradiusen er ~60 μm, og det drivende akustiske trykket er ~15 kPa. Tidsintervallet mellom to påfølgende bilder er 5,6 μs. Hele serien tilsvarer to akustiske perioder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7. Grensesnittpanel for det kjørbare skriptet PVR_Interface.exe. Skriptet starter et grafisk brukergrensesnitt som inneholder (A) et panel for innstilling av de fysiske parametrene, (B) en tabell for innstilling av den påførte elektriske spenningen på transduserne, (C) muligheten for å laste hele settet med innspilte videoer som er etterbehandlet og gir likevektsbobleradiusen (D) og det påførte akustiske trykket (B), plottet av forholdet mellom trykk og spenning (E). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8. Trykk/radiusdiagram over ustabilitetssoner. Hvert fargede område tilsvarer en ustabilitetssone for en gitt formmodus: (blått område) modus 2, (grønt område) modus 3 og (rødt område) modus 4. Det hvite området tilsvarer tilfellet der mikrobobler bare utviser sfæriske svingninger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9. Øyeblikksbildeserie av en boblekoalescens som fører til formsvingninger. Etter den nærliggende fasen av to bobler, brytes den tynne filmen mellom dem og koalescens oppstår. En enkelt boble drives nå av ultralydfeltet, først i et forbigående svingningsregime. Etter noen akustiske perioder etableres steady-state-regimet på en aksisymmetrisk formmodus, her modus 4. Tidsintervallet mellom to påfølgende fotografier er 30 μs. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 10
Figur 10. De fem første aksisymmetriske formmodusene, inkludert radialmodus. Sidevisning av konturen til boblegrensesnittet vist på to ytterpunkter av svingningsamplituden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 11
Figur 11. Fluorescerende sporstoffpartikler rundt sfærisk oscillerende mikrobobler. Begge bildene tilsvarer en superposisjon på 100 øyeblikksbilder som dekker 0,25s. (a) Ingen bevegelse av sporstoffpartiklene kan observeres hvis formsvingninger ikke er tilstede. (b) En parasitt middelstrøm synlig i hele synsfeltet kan oppstå, for eksempel på grunn av oppvarming av lasearket. Denne strømmen er imidlertid ikke knyttet til boblebevegelsen. På begge bildene er skyggen indusert av laserarket bak boblen tydelig synlig. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 12
Figur 12. Kvasi-samtidig registrering av bobledynamikken og den induserte mikrostreamingen. Venstre kolonne: Øyeblikksbildeserie av en boble som viser formmodussvingninger i rekkefølge 3 (a) og indusert mikrostreaming (b). Høyre kolonne: Øyeblikksbildeserie av en boble som viser formmodussvingninger i rekkefølge 4 (c) og indusert mikrostreaming (d). For alle figurer tilsvarer den røde stiplede linjen symmetriaksen til både bobleformsvingninger og væskestrømmer, bestemt av den rettlinjede bevegelsen til de to boblene som nærmer seg før koalesens. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 13
Figur 13. Eksempel på to strømmemønstre indusert av en boble som hovedsakelig svinger på en modus 3. (a,d) Illustrasjon og snaphot av boblegrensesnittet, (b,e) modusdekomponeringen av boblegrensesnittet og (c,f) det tilknyttede streamingmønsteret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den presenterte prosedyren består av å bruke boblekoalescens for å utløse steady-state, symmetrikontrollerte bobleformoscillasjoner, slik at studiet av den langsiktige væskestrømmen indusert av disse svingningene. Hovedutfordringen i teknikken er kontrollen av ikke-sfæriske svingninger for at en boble blir fanget, langt fra noen grenser.

De fleste av de eksisterende teknikkene som ble foreslått i litteraturen, fokuserte på substratfestede bobler 7,16, da fraværet av bevegelse av boblesenteret gjør fangsten av grensesnittet på den akustiske tidsskalaen (opptil hundrevis av kHz) enklere. Selv om overskridelse av trykkterskelen som er nødvendig for å utløse formmoduser, er en enkel oppgave i dette tilfellet, er kontrollen av formsvingninger komplisert på grunn av symmetribruddet indusert av substratet. En veggfestet boble kommer i kontakt med underlaget med en bestemt kontaktvinkel, noe som fører til utløsning av asymmetriske overflatemoduser21. I tillegg til kompleksiteten ved å tolke de tredimensjonale, asymmetriske modusene med bare en enkelt kameravisning, oppstår brå overgang til et kaotisk overflateoscillasjonsregime33. Derfor består hovedutfordringen i å fange formsvingninger av en enkelt, fanget boble langt fra noen grenser for å oppnå aksisymmetriske ikke-sfæriske svingninger. Slike forhold gjør det mulig å sammenligne eksperimenter og det store utvalget av analytiske studier som er tilgjengelige i litteraturen. Den viktigste eksperimentelle vanskeligheten ligger i posisjonsstabiliteten til mikroboblen. For å overvinne dette problemet har optisk pinsett blitt brukt til å kontrollere boblefangst34, og amplitudemodulerte ultralydfelt brukes til å fange og drive boblesvingninger29. I begge tilfeller fanges en enkelt boble og ikke-sfæriske moduser utløses. Også når det gjelder det amplitudemodulerte kjørefeltet, eksisterer formmodusene bare i en liten periode da de periodisk starter og forsvinner. I tillegg er orienteringen av bobleformoscillasjoner ikke kontrollert og fører til en forspenning i analysen av grensesnittbevegelsen.

Alternativet vi foreslår er bruk av en pulserende laser for å kjerne en enkelt boble, senere fanget ved en trykkantinode av et resonanslevitasjonskammer. Ved å kjerne suksessive bobler over tid, beveger hver nukleerte boble seg mot fangststedet som allerede er okkupert av en annen boble. Koalescens oppstår og induserer et opprinnelig deformert boblegrensesnitt. Hvis drivtrykket er tilstrekkelig sterkt, opprettholdes formsvingningene. Laser-nukleering har blitt foretrukket fremfor andre nukleeringsteknikker, for eksempel elektrolyse, da det tillater rask og pålitelig boblegenerering. Som illustrert i figur 9, er symmetriaksen for formsvingninger gitt ved boblens akse før koalescens. Dette hovedresultatet krever imidlertid relativt lang tid for å stille inn det eksperimentelle oppsettet, da det kreves at boblene holder seg inne i kameraets fokalplan under tilnærmingsfasen av koalesens (for å orientere symmetriaksen i dette planet). For å gjøre dette gjøres små endringer i boblekjerneasjonsstedet for å optimalisere banen langs hvilken boblene beveger seg og møter hverandre. Endringen til boble-nukleasjonssted krever fin modifikasjon av tankplasseringen i forhold til laserbanen, og utføres med et treretningstrinn med mikrometrisk nøyaktighet. I tillegg utføres finjustering av laserenergien for å optimalisere den nukleerte boblestørrelsen. Bobler som er for store vil umiddelbart generere formmoduser med høyt modusnummer og nærme seg den volumetriske bobleresonansen. Dette fører til høy posisjonell ustabilitet i boblesenteret. Bobler som er for små, krever et stort antall koalesensprosesser før de når riktig størrelse for å utløse formmodi.

Den største fordelen med den foreslåtte teknikken er etableringen av et stabilt regime for symmetrikontrollerte formsvingninger. Siden grensesnittbevegelsen opprettholdes i relativt lang tid (fra sekunder til minutter), er det mulig å fange den bobleinduserte væskestrømmen ved å bytte eksperimentelt oppsett til sporing av fluorescerende nanopartikler sådd inn i væskemediet. Det er verdt å merke seg at ingen eksperimentelle studier av mikrostreaming indusert av en boble i en uendelig væske eksisterer så langt i litteraturen. Selv når kavitasjonsmikrostreaming undersøkes for substratfestet boble, er analysen begrenset til kvalitative observasjoner uten å vurdere koblingen til bobledynamikken16. Måling av partikkelbevegelse utføres i et tynt laserark levert av en kontinuerlig bølgelaser. Fordi det er nødvendig å utføre kvasi-samtidig (i) lasernukleering med pulserende laser, (ii) partikkelsporing med et laserark og (iii) opptak av høyhastighetskameraet, må spesiell oppmerksomhet rettes mot potensiell hindring av materialer rundt vanntanken. Dette fører til et kompakt oppsett med mange begrensninger på enhetens disposisjon, som vist i figur 5. Når du fanger et mikrostreamingmønster indusert av en formoscillerende boble, er det nødvendig å alternativt spore boblegrensesnittdynamikken, som nevnt i trinn 4.2. Å bytte mellom alternative sekvenser av bobledynamikk og fluidstrømningsvisualisering gjør det mulig å knytte mikrostreamingmønsteret til en gitt formsvingning på en sikker måte. Denne alternative prosedyren er obligatorisk da (i) formsvingninger kan slå seg av, (ii) boblestabiliteten brått kan øke og føre til posisjonell ustabilitet i boblen, (iii) boblen kan fragmenteres når store deformasjoner oppstår. Selv om disse hendelsene er sjeldne, er det viktig å verifisere at bobledynamikken forblir den samme ved å registrere den både før og etter filming av mikrostreamingmønsteret. (På denne måten kan det sikres at boblebevegelsen og mønsteret virkelig er korrelert).

Er det bevist at en boble som svinger hovedsakelig på et gitt modusnummer fører til et bestemt mikrostreamingmønster, som vist i figur 12. Mønsteret er unikt og avhenger av det modale innholdet i grensesnittbevegelsen. Som illustrert i figur 13, kan det samme dominerende modustallet indusere stor- eller småavstandsvirvler avhengig av antall, amplitude og fase av sekundærmodusene som er eksitert.

Disse observasjonene kan ha praktisk bruk i medisinske applikasjoner som målrettet og lokalisert ultralydmediert legemiddellevering, for eksempel. Bobler er kjent for å fungere som vektorer for permeabilisering av tette kryss mellom celler, og til og med selve cellemembranen, noe som fører til sonoporasjon1. Ved stabilt oscillerende mikrobobler kan dette fenomenet induseres av skjærspenning eller skjærspenningsgradienter35 indusert av boblesvingninger, gjennom generering av mikrostreamingstrømmer. Vi husker at microstreaming er et ikke-lineært, andreordens fenomen. Til å begynne med er det ikke enkelt å skalere de observerte streamingmønstrene til det som er oppnådd for terapeutiske, skallede mikrobobler med mindre størrelser (~ 3 μm radius). Vi har allerede vist i innledningen hvordan ikke-sfærisk dynamikk av frie eller belagte bobler av en størrelsesorden størrelsesforskjell kan skaleres: egenfrekvensen ω n av en gitt modus n er relatert til boblestørrelsen som Equation 125. I Dollet et al.27 har formmodi i rekkefølge 4 blitt fanget for belagte mikrometriske bobler eksitert ved 1.7 MHz, på samme måte som det observerte formmodusnummeret i vårt eksperiment. Det påførte trykket er også sterkt forskjellig, da trykk opp til 200kPa kreves for å utløse formmoduser på ultralydkontrastmiddelmikrobobler27. I det foreslåtte oppsettet overstiger det maksimale påførte trykket ikke 25 kPa. Den sterke forskjellen i påført trykk skyldes utløsing av overflateustabiliteter, da formmoduser vises over en viss trykkterskel. For de eksperimentelle forholdene ved 1.7 MHz gitt i Dollet et al. 27, har det vist seg at trykkterskelen som fører til formstabilitet er rundt 150 kPa for en modus 436. For en kjørefrekvens på 30 kHz kreves det bare en 10 kPa kjørefeltamplitude for å utløse ustabilitet i formen på en ~50 μm boble. Når den er utløst, utvikler formstabiliteten seg etter noen akustiske sykluser, og demonstrerer en platåmetning av modusamplituden. Amplitudemetning ble observert for både frie bobler 24,29 og belagte bobler27. Det indikerer muligheten for å nå steady-state form oscillasjoner for frie eller belagte bobler, med formsvingninger så store som 25 til 50% av radial modus amplitude27,37. Ved hjelp av vår eksperimentelle tilnærming når vi ekstreme formdeformasjoner i konfigurasjonen,Equation 2 (hvor enn er formmodusamplituden), som illustrert i figur 13.

For å oppsummere, tillater det foreslåtte eksperimentelle oppsettet skalering av hovedtrekkene til ikke-sfæriske svingninger av mikrobobler, selv for størrelser som varierer med nesten en størrelsesorden. Når det gjelder mikrostreamingstrømmen, kan skaleringen av strømningshastigheten undersøke for bobler som viser både laterale og radiale svingninger7, eller en ikke-sfærisk modus som er selvvekselvirkende32. I begge tilfeller skalaen for strømningshastigheter som v ~ ωR0 a i a j, hvor i, j betegner de vurderte modusamplitudene normalisert av bobleradiusen. For lignende verdier av den ikke-sfæriske ekspansjonsparameteren ai, oppnås identiske strømningshastigheter når ωR0 ~ Konstant. Sammenligning av våre eksperimentelle forhold til den som brukes til terapeutiske skallede mikrobobler27, er teoretiske spådommer om strømningshastigheter bare forskjellig fra en faktor 2.5. Målinger av strømningshastigheter ved partikkelsporingshastighet førte til estimeringer av hastighetsstørrelsen på 1 mm/s i det her presenterte oppsettet. Denne verdien ligner den som oppnås ved undersøkelse av mikrostreaming indusert av ultralydkontrastmidler19. Når det gjelder den romlige organiseringen av strømningsmønsteret, er vinkelfordelingen av strømningsvirvlene rundt boblegrensesnittet uavhengig av bobleradiusen31. Bare den radiale utvidelsen av streamingfeltet påvirkes av boblestørrelsesendringen. Denne radiale ekspansjonen skaleres som Equation 3, hvor er en koeffisient knyttet til det undersøkte modusnummeret. Det er klart at den generelle formen på strømningsmønsteret er bevart, da den radiale ekspansjonen styres av bobleradiusen R0. Imidlertid, som illustrert i figur 13, kan streamingmønsteret variere betydelig selv når man vurderer det samme formmodusnummeret. Figur 13 fremhever den enorme effekten av boblegrensesnittdynamikken på strømningsmønsteret, og spesielt på den romlige endringshastigheten i hastighetsfeltet. Den romlige fordelingen av skjærspenning, eller skjærspenningsgradient, er angitt som en passende indikator for sonoporasjonseffektivitet35. I vårt foreslåtte eksperimentelle oppsett kan bare skjærspenningen i bulkvæsken vurderes på dette stadiet. Ytterligere utvidelse av veggskjærspenningen vil kreve tillegg av en nærliggende overflate nær boblen. Det er forutsigbart at en overflate i bobleområdet vil forstyrre boblens posisjonsstabilitet ved å modifisere det stående bølgefeltet lokalt. Å sikre boblestabilitet i nær avstand fra en vegg er fortsatt en utfordring som delvis kan løses ved å legge til et sekundært ultralydfelt dedikert til boblefangst med en bølgelengde identisk med boble-veggavstanden. Et slikt dobbeltfrekvens akustisk levitasjonskammer var allerede designet for å undersøke boblepardynamikk og interaksjonskrefter38. Dessverre gjør den store størrelsesforskjellen mellom boblene som er undersøkt her og biologiske celler (typisk radius ~ 10μm) direkte bruk av dette eksperimentelle oppsettet umulig for biologiske undersøkelser. Vi forventer imidlertid at våre eksperimentelle resultater i kombinasjon med den nyeste teoretiske utviklingen på bobleindusert mikrostreaming vil bidra til å forbedre slik modellering, samt gi tillit til den teoretiske prediksjonen av bobleindusert skjærspenning eller skjærspenningsgradienter i nærheten av en cellemembran.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av LabEx CeLyA ved Universitetet i Lyon (ANR-10-LABX-0060 / ANR-11-IDEX-0007).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aspherical lens Thorlabs AL4050 Lens of focus 40 mm
Continuous wave laser source CNI MLL6FN DPSS laser of wavelength 532nm, energy 400 mW
Cylindrical plano-concave lens Thorlabs LJ1277L1-A lens of focus -25?4mm
Cylindrical plano-concave lens Thorlabs LK1900L1 lens of focus 250 mm
Fluorescent particles Duke Scientific R700 Red polymer fluorescent microspheres
Function generator Agilent HP33120 Generator of function feeding the ultrasound transducer
High-speed camera Vision Research Phantom v12.0 High-speed recording up to 1 Mfps
Liquid medium Carlo Erba Water for analysis Demineralized, undegassed water
Multiphysics software Comsol None Softwate for simulating the acoustic field of the levitation chamber
Nd:Yag pulsed laser New Wave Research Solo III-15 5 ns pulse duration, λ=532 nm, 3.5 mm beam diameter, up to 50 mJ
Plano-concave lens Thorlabs N-BK7 lens of focus 125 mm
Spherical concave lens Thorlabs N-SF11 Bi-concave lens of focus -25mm
Ultrasound transducer SinapTec Custom-made Nominal frequency 31kHz, active area 35mm diameter
Visualization software NIH ImageJ Software for image processing and analysis in Java
XY Linear stage Newport M-406 Displacement stage with micrometric screw
Z-axis linear stage Edmund Optics 62-299 Vertical displacement stage with micrometric screw

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roovers, S., et al. The role of ultrasound-driven microbubble dynamics in drug delivery: from microbubble fundamentals to clinical translation. Langmuir. 35 (31), 10173-10191 (2019).
  2. Liu, H. L., Fan, C. H., Ting, C. Y., Yeh, C. K. Combining microbubbles and ultrasound for drug delivery to brain tumors: current progress and overview. Theranostics. 4 (4), 432-444 (2014).
  3. Lammertink, B. H. A., et al. Sonochemotherapy: from bench to bedside. Frontiers in Pharmacology. 6, 138 (2015).
  4. Lajoinie, G., et al. In vitro methods to study bubble-cell interactions: fundamentals and therapeutic applications. Biomicrofluidics. 10, 011501 (2016).
  5. Van Wamel, A., Bouakaz, A., Versluis, M., de Jong, N. Micromanipulation of endothelial cells: ultrasound-microbubble-cell interaction. Ultrasound in Medicine and Biology. 30, 1255-1258 (2004).
  6. Tran, T. A., Roger, S., Le Guennec, J. Y., Tranquart, F., Bouakaz, A. Effect of ultrasound-activated microbubbles on the cell electrophysiological properties. Ultrasound in Medicine and Biology. 33, 158-163 (2007).
  7. Marmottant, P., Hilgenfeldt, S. Controlled vesicle deformation and lysis by single oscillating bubbles. Nature. 423 (6936), 153-156 (2003).
  8. Prentice, P. A., Cuschieri, K., Dholakia, K., Prausnitz, M., Campbell, P. Membrane disruption by optically controlled microbubble cavitation. Nature Physics. 1, 107-110 (2005).
  9. Kudo, N., Okada, K., Yamamoto, K. Sonoporation by single-shot pulsed ultrasound with microbubbles adjacent to cells. Biophysical Journal. 96, 4866-4876 (2009).
  10. Novell, A., et al. A new safety index based on intrapulse monitoring of ultra-harmonic cavitation during ultrasound-induced blood-brain barrier opening procedures. Scientific Reports. 10, 10088 (2020).
  11. Cornu, C., et al. Ultrafast monitoring and control of subharmonic emissions of an unseeded bubble cloud during pulsed sonication. Ultrasonics Sonochemistry. 42, 697-703 (2018).
  12. Reslan, L., Mestas, J. L., Herveau, S., Béra, J. C., Dumontet, C. Transfection of cells in suspension by ultrasound cavitation. Journal of Controlled Release. 142 (2), 251-258 (2010).
  13. Reuter, F., Gonzalez-Avila, S. R., Mettin, R., Ohl, C. D. Flow fields and vortex dynamics of bubbles collapsing near a solid boundary. Physical Review Fluids. 2, 064202 (2017).
  14. Chew, L. W., Klaseboer, E., Ohl, S. W., Khoo, B. C. Interaction of two differently sized oscillating bubbles in a free field. Physical Review E. 84, 066307 (2011).
  15. Doinikov, A. A., Bouakaz, A. Acoustic microstreaming around a gas bubble. The Journal of the Acoustical Society of America. 127 (2), 703-709 (2010).
  16. Tho, P., Manasseh, R., Ooi, A. Cavitation microstreaming patterns in single and multiple bubble systems. Journal of Fluid Mechanics. 576, 191-233 (2007).
  17. Van Wamel, A., et al. Vibrating microbubbles poking individual cells: Drug transfer into cells via sonoporation. Journal of Controlled Release. 112, 149-155 (2006).
  18. Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. PNAS. 113 (36), 9983-9988 (2016).
  19. Pereno, V., et al. Layered acoustofluidic resonators for the simultaneous optical and acoustic characterization of cavitation dynamics, microstreaming, and biological effects. Biomicrofluidics. 12, 034109 (2018).
  20. Shklyaev, S., Straube, A. V. Linear oscillations of a compressible hemispherical bubble on a solid substrate. Physics of Fluids. 20, 052102 (2008).
  21. Fauconnier, M., Bera, J. C., Inserra, C. Nonspherical modes non-degeneracy of a tethered bubble. Physical Review E. 102, 033108 (2020).
  22. Xi, X., Cegla, F., Mettin, R., Holsteyns, F., Lippert, A. Study of non-spherical bubble oscillations near a surface in a weak acoustic standing wave field. The Journal of the Acoustical Society of America. 135, 1731 (2014).
  23. Doinikov, A. A., Bouakaz, A. Effect of a distant rigid wall on microstreaming generated by an acoustically driven gas bubble. Journal of Fluid Mechanics. 742, 425-445 (2014).
  24. Cleve, S., Guédra, M., Inserra, C., Mauger, C., Blanc-Benon, P. Surface modes with controlled axisymmetry triggered by bubble coalescence in a high-amplitude acoustic field. Physical Review E. 98, 033115 (2018).
  25. Lamb, H. Hydrodynamics. 6th ed. , University Press. Cambridge. (1932).
  26. Liu, Y., Wang, Q. Stability and natural frequency of nonspherical mode of an encapsulated microbubble in a viscous liquid. Physics of Fluids. 28, 062102 (2016).
  27. Dollet, B., et al. Nonspherical oscillations of ultrasound contrast agent microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (9), 1465-1473 (2008).
  28. Versluis, M., et al. Microbubble shape oscillations excited through ultrasonic parametric driving. Physical Review E. 82, 026321 (2010).
  29. Guédra, M., Cleve, S., Mauger, C., Blanc-Benon, P., Inserra, C. Dynamics of nonspherical microbubble oscillations above instability threshold. Physical Review E. 96, 063104 (2017).
  30. Cleve, S., Guédra, M., Mauger, C., Inserra, C., Blanc-Benon, P. Microstreaming induced by acoustically trapped, non-spherically oscillating microbubbles. Journal of Fluid Mechanics. 875, 597-621 (2019).
  31. Doinikov, A. A., Cleve, S., Regnault, G., Mauger, C., Inserra, C. Acoustic microstreaming produced by nonspherical oscillations of a gas bubble. I. Case of modes 0 and m. Physical Review E. 100, 033104 (2019).
  32. Inserra, C., Regnault, G., Cleve, S., Mauger, C., Doinikov, A. A. Acoustic microstreaming produced by nonspherical oscillations of a gas bubble. III. Case of self-interacting modes n-n. Physical Review E. 101, 013111 (2020).
  33. Prabowo, F., Ohl, C. D. Surface oscillations and jetting from surface attached acoustic driven bubbles. Ultrasonics Sonochemistry. 18 (1), 431-435 (2011).
  34. Garbin, V., et al. Changes in microbubble dynamics near a boundary revealed by combined; optical micromanipulation and high-speed imaging. Applied Physics Letters. 90, 114103 (2007).
  35. Collis, J., et al. Cavitation microstreaming and stress fields created by microbubbles. Ultrasonics. 50, 273-279 (2010).
  36. Loughran, J., Eckersley, R. J., Tang, M. X. Modeling non-spherical oscillations and stability of acoustically driven shelled microbubbles. The Journal of the Acoustical Society of America. 131 (6), 4349-4357 (2012).
  37. Vos, H. J., Dollet, B., Bosch, J. G., Versluis, M., de Jong, N. Nonspherical vibrations of microbubbles in contact with a wall - a pilot study at low mechanical index. Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (4), 685-688 (2008).
  38. Regnault, G., Mauger, C., Blanc-Benon, P., Inserra, C. Secondary radiation force between two closely spaced acoustic bubbles. Physical Review E. 102, 031101 (2020).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 171 Kavitasjon mikroboble form svingninger microstreaming høyhastighets bildebehandling boble koalescens
Induksjon av mikrostreaming ved ikke-sfæriske bobleoscillasjoner i et akustisk levitasjonssystem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Inserra, C., Regnault, G., Cleve,… More

Inserra, C., Regnault, G., Cleve, S., Mauger, C., Blanc-Benon, P. Induction of Microstreaming by Nonspherical Bubble Oscillations in an Acoustic Levitation System. J. Vis. Exp. (171), e62044, doi:10.3791/62044 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter