Summary
Krystallografisk fragmentscreening ved Helmholtz-Zentrum Berlin utføres ved hjelp av en arbeidsflyt med dedikerte sammensatte biblioteker, krystallhåndteringsverktøy, raske datainnsamlingsanlegg og i stor grad automatisert dataanalyse. Den presenterte protokollen har til hensikt å maksimere produksjonen av slike eksperimenter for å gi lovende utgangspunkt for nedstrøms strukturbasert liganddesign.
Abstract
Fragmentscreening er en teknikk som bidrar til å identifisere lovende utgangspunkt for liganddesign. Gitt at krystaller av målproteinet er tilgjengelige og viser reprodusert røntgendiffraksjonsegenskaper med høy oppløsning, er krystallografi blant de mest foretrukne metodene for fragmentscreening på grunn av følsomheten. I tillegg er det den eneste metoden som gir detaljert 3D-informasjon om fragmentets bindingsmodus, noe som er viktig for etterfølgende rasjonell sammensatt evolusjon. Rutinemessig bruk av metoden avhenger av tilgjengeligheten av egnede fragmentbiblioteker, dedikerte midler til å håndtere et stort antall prøver, toppmoderne synkrotronbjelker for raske diffraksjonsmålinger og i stor grad automatiserte løsninger for analyse av resultatene.
Her presenteres den komplette praktiske arbeidsflyten og de inkluderte verktøyene for hvordan man utfører krystallografisk fragmentscreening (CFS) ved Helmholtz-Zentrum Berlin (HZB). Før denne arbeidsflyten er krystall-soaking forhold samt datainnsamlingsstrategier optimalisert for reproduserbare krystallografiske eksperimenter. Deretter, vanligvis i en en til to-dagers prosedyre, brukes et 96-medlem CFS-fokusert bibliotek som leveres som tørkede ferdige plater for å suge 192 krystaller, som deretter blinker avkjøles individuelt. De siste diffraksjonsforsøkene kan utføres innen en dag på de robotmonteringsstøttede strålelinjene BL14.1 og BL14.2 ved BESSY II elektronlagringsring som drives av HZB i Berlin-Adlershof (Tyskland). Behandling av krystallografiske data, raffinering av proteinstrukturene og treffidentifikasjon er rask og i stor grad automatisert ved hjelp av spesialiserte programvarerørledninger på dedikerte servere, noe som krever lite brukerinndata.
Bruk av CFS-arbeidsflyten på HZB muliggjør rutinemessige screeningeksperimenter. Det øker sjansene for vellykket identifisering av fragmenttreff som utgangspunkt for å utvikle mer potente bindemidler, nyttig for farmakologiske eller biokjemiske applikasjoner.
Introduction
Det første skrittet i narkotikautviklingen er screening av forbindelser mot et mål av interesse. Tradisjonelt brukes store sammensatte biblioteker i rekkefølgen 100.000-1.000.000 oppføringer i biokjemiske analyser med høy gjennomstrømning i farmasøytisk industri. Denne strategien ble supplert med fragmentbasert legemiddeldesign (FBDD), en nyere metode som tok en kraftig økning de siste 20 årene og ble en mainstream-strategi for å generere ledende kandidater av høy kvalitet på grunn av flere iboende fordeler ved metoden1. Begrepet "fragment" refererer til et lite organisk molekyl som vanligvis inneholder mindre enn 20 ikke-hydrogen eller tunge atomer (HAer). Dermed er et fragment betydelig mindre enn de stoff- eller blylignende molekylene (vanligvis mindre enn 30 HAer) utforsket i konvensjonell høygjennomstrømningsscreening. Fragmenter er svakaffinitetspermer. Men sammenlignet med større molekyler er fragmenter mer allsidige, siden selv en liten samling av dem bedre kan representere det respektive kjemiske rommet av molekyler av samme størrelse2. Også utviklende fragmentscreening treff i blymolekyler er betydelig mer effektiv enn å optimalisere allerede størremolekyler 2,3,4,5. Det betyr at i påvente av tilstrekkelig følsomhet for deteksjonen, kan screening av fragmenter brukes effektivt og gir startpunkter av høy kvalitet for videre sammensatt evolusjon. Flere biofysiske metoder kan brukes til fragmentscreening, den mest populære er kjernemagnetisk resonans, røntgenkrystallografi, overflateplasmonresonans og termiske skiftanalyser. Disse metodene brukes enten parallelt eller på en sekvensiell måte, med sikte på å øke tilliten til treffene og redusere antall falske positiver eller falske negativer. En nylig gjennomført komparativ studie6 antydet imidlertid at sekvensiell screening kaskader skal unngås på grunn av den lave overlappingen mellom de forskjellige metodene.
Røntgenkrystallografi er en veletablert metode for strukturbestemmelse i atomdetaljer, men har nylig også blitt utviklet som et verktøy for screeningformål7,8. Ettersom proteinkrystaller tåler høye fragmentkonsentrasjoner (f.eks. 100 mM), kan krystallografisk fragmentscreening (CFS) konkurrere med andre biofysiske metoder for screening av fragmenter eller til og med overgå dem som en første-trinns screeningmetode6,9. En viktig forutsetning for CFS er imidlertid et validert krystalliseringssystem av målproteinet som reproduserer krystaller med diffraksjonsegenskaper til betydelig høy oppløsning, vanligvis bedre enn 2 Å.
En eksklusiv fordel med CFS sammenlignet med alle andre fragmentscreeningsmetoder er levering av detaljert 3D-informasjon om bindingsmodusen til de identifiserte fragmentene. Denne strukturelle informasjonen er helt avgjørende for den rasjonelle optimaliseringen av fragmenttreffene til bindemidler med høyere affinitet. Etablerte utarbeidelsesstrategier vokser, slår sammen og kobler fragmenttreff5. Dermed er relativt høy ligandeffektivitet gitt fra starten, og innføring av unødvendige eller romlige ikke egnede grupper kan unngås, og dermed redusere kjemiske syntesekostnader. Alt i alt har CFS uovertruffen fordeler som en startstrategi for legemiddeldesign.
Gitt at et bestemt biologisk mål oppfyller de høye kravene til CFS angående krystallkvalitet, er det noen hovedfaktorer som maksimerer sjansene for et vellykket resultat av slike screeningkampanjer. Det avhenger av kvaliteten på fragmentbiblioteket som brukes, på en effektiv arbeidsflyt for å utføre forsøkene før diffraksjonseksperimentet, på synkrotronstrålelinjer med tilstrekkelig automatisering og datainnsamlingshastighet, samt på måter og midler for i stor grad automatisert databehandling og analyse. Her presenteres hele arbeidsflyten fra krystall-soaking-eksperimentene til treffidentifikasjonen, i måten den er vellykket etablert på de makromolekylære krystallografistrålene ved BESSY II (Figur 1). Anlegget er åpent for faglige og industrielle brukere for samarbeid. I tillegg kan akademiske brukere av EU-land utenfor Tyskland enkelt søke om finansiering via iNEXT Discovery-prosjektet.
Det er uunnværlige forutsetninger for å kunne starte en CFS-kampanje og gjennomføre protokollen som er skissert i dette arbeidet: veldiffracting krystaller av målproteinet er tilgjengelige som kan reproduseres i store mengder, som er stabile ved omgivelsestemperatur, og som ble dyrket ved hjelp av en krystalliseringscocktail uten svært flyktige ingredienser. En annen forutsetning er egnetheten til krystallgitteret for eksperimentet. I et passende gitter må de interessante stedene til målproteinet eksponeres mot løsningsmiddelkanalene og dermed tilgjengelig. Et annet foregående trinn som er valgfritt, men likevel sterkt anbefalt for å sikre suksess i arbeidsflyten til CFS-kampanjen, er optimaliseringen av sugebetingelsen for eksperimentet. Vital benchmark-statistikk her er diffraksjonskraften til krystallen og de relevante datakvalitetsindikatorene, som bestemmes under dataskaleringsprosedyren. Typiske faktorer for å optimalisere er DMSO-toleranse, bufferkonsentrasjon og kryobeskyttelse. Selv om det ikke er en streng forutsetning som nærmere beskrevet nedenfor, kan DMSO som et ko-løsningsmiddel bidra til å øke fragmentløseligheten. Typiske tester bør omfatte bløtlegging av 0, 3, 6 eller 10 % (v/v) DMSO over natten. En økning av bufferkonsentrasjonen til 200 eller 300 mM bidrar til å forhindre tap av diffraksjonskvalitet på grunn av sporadiske pH-skiftende effekter som oppstår fra de høye fragmentkonsentrasjonene som skal brukes. Til slutt er det avgjørende å finne ut om og hvilket ekstra kryoprektant som kreves, og om det allerede kan inkluderes i soaking-tilstanden. I mange tilfeller er det imidlertid ikke nødvendig med et ekstra kryobeskyttende middel, fordi DMSO selv kan fungere som en kryo-beskytter. I så fall vil dette spare ett håndteringstrinn i det endelige eksperimentet. De fleste krystaller trenger mindre kryo-beskyttelse hvis blitskjølt på passende størrelse løkker, minimere eller unngå omkringliggende moderluten så mye som mulig. Men i sjeldne tilfeller er et lag av moderluten faktisk nødvendig for å forhindre skade på krystallen ved blitskjøling.
Antall treff oppnådd i en CFS-kampanje er ikke bare avhengig av legemiddelbarheten til målproteinet og egnetheten til krystallgitteret (se ovenfor), men det er også avhengig av kvaliteten på biblioteket. Bibliotekkvaliteten består av to aspekter: valg av forbindelser til biblioteket og konfekt av forbindelsene, (dvs. i hvilken fysisk form de presenteres for eksperimentet). For sammensatt utvalg kan ulike strategier brukes. De fleste bibliotekdesign inkluderer maksimering av det kjemiske mangfoldet av fragmentene. Et strategisk fokus kan være å inkludere fragmentenes kjemiske evne til oppfølgingsdesign, som for eksempel er brukt i Diamond-SGC-iNEXT-biblioteket10. Nok et strategisk fokus for bibliotekdesign kan være å maksimere representasjonen av kommersielt tilgjengelig kjemisk rom for fragmenter ved form- og farmakoforbasert klynge, som det har blitt eksemplifisert av F2X-bibliotekene utviklet ved HZB11. Mer spesifikt er F2X-Universal Library med 1103 medlemmer og representativt 96-sammensatt delsett for innledende CFS-kampanjer, som kalles F2X-Entry Screen, utviklet og F2X-Entry Screen er validert med hell11. F2X-Entry Screen er det primære valget for CFS-kampanjer på HZB. Deretter kan større kampanjer deretter utføres ved hjelp av F2X-Universal Library eller det 1056-medlemmers EU-OPENSCREEN fragmentbiblioteket12 som også tilbys på HZB. For tiden er disse bibliotekene tilgjengelige for brukere av de makromolekylære krystallografistrålene til BESSY II-synkrotronen i Berlin gratis på grunnlag av en samarbeidskontrakt. Dette gjelder også brukere via iNEXT Discovery-forslag. Videre er F2X-Entry Screen tilgjengelig for alle interesserte forskere på grunnlag av en materiell overføringsavtale.
Når det gjelder den fysiske presentasjonen av et bibliotek, blir to tilnærminger ofte vedtatt: fragmentene brukes enten som DMSO-lagerløsninger, eller fragmentene tørkes og immobiliseres på ferdige plater. Ved HZB presenteres både F2X-Entry Screen og de ikke-flyktige forbindelsene til F2X-Universal Library som tørkede forbindelser i en 3-linse 96-brønns MRC lavprofils krystalliseringsplate. Presentasjonen av fragmentene immobilisert i krystalliseringsplater har to viktige fordeler: For det første tillater det transport av screeningplatene til brukerens hjemmelaboratorium. Derfor kan soaking- og krystallhåndteringstrinnene i arbeidsflyten som presenteres her (trinn 1-3) utføres hvor som helst. For det andre kan DMSO-fri løsning benyttes. DMSO-sensitive mål kan dermed screenes enkelt, i stor grad beholde forventede trefffrekvenser11. Imidlertid øker DMSO fragmentløselighet, derfor er det verdt å sjekke DMSO-toleransen til et krystallsystem du velger på forhånd som beskrevet ovenfor.
Protokollen som er skissert nedenfor, vil beskrive et typisk eksperiment med en 96-sammensatt skjerm som F2X-Entry Screen. For det må ca 250 krystaller tilberedes i tide for å brukes ferskt. Det er sterkt tilrådelig å forberede soaks for alle 96 forbindelser i duplikat. Det anbefales, men valgfritt, å forberede ytterligere mock-soaks som senere vil hjelpe med dataanalyse ved hjelp av pan-data tetthet analyse (PanDDA) tilnærming for hit identifikasjon13. Mock-soaks er definert som soaking eksperimenter på proteinkrystaller ved hjelp av samme soaking løsning som fragmentet suger for samme inkubasjonstid, men ingen fragmenter er til stede. Hvis bløtleggingsløsningen er lik krystalliseringstilstanden, kan krystallene høstes direkte fra krystalliseringsplaten.
Avhengig av egenskapene til den robotiserte prøveveksleren, kan det hende at forskjellige puckformater må brukes. For øyeblikket må prøver for den HZB-opererte strålelinjen BL14.1 tilberedes i Unipuck-format, prøver for den HZB-opererte strålelinjen BL14.2 må tilberedes i SPINE puckformat. I denne protokollen antas forberedelse i Unipuck-format.
Protocol
1.Soaking krystaller
- Ta screeningplaten (her, en F2X-Entry Screen plate, figur 2) fra -20 °C fryseren og legg den på benken/bordet i ca. 30 minutter for å forvarme den til romtemperatur, og unngå dermed kondensfuktighet.
- Ordne arbeidsplassen med to tett ordnede mikroskoper og alle nødvendige verktøy (Figur 3A). Materialene er oppført i Materiallisten.
- Velg 3-4 løkker av riktig størrelse for overføring av krystallene som skal gjennomvåt og plasser dem nær mikroskopene.
- Fyll glassflekkplatens hulrom med avionisert eller destillert vann.
- Forbered 5 ml soaking løsning.
- Skjær opp posen på screeningplaten forvarmet til romtemperatur.
- Fjern lokket og folien fra screeningplaten, samtidig som platen holdes plassert på benken/bordet.
- Dekanter 5 ml soaking løsning i reagensbeholderen.
- Fyll hvert av de 96 reservoarene med 40 μL sugeløsning ved hjelp av 12-kanals pipetten.
- Plasser EasyAccess Frame på toppen av screeningplaten og fest den med de medfølgende klemmene ved å skyve dem på venstre og høyre side av enheten.
MERK: EasyAccess Frame er en spesiell enhet for håndtering av flere krystaller, som ble utviklet ved HZB14. Det gir enkel tilgang til hver brønn ved å skifte bevegelige fliser samtidig som de andre brønnene beskyttes mot fordampning. - Plasser screeningplaten (inkl. EasyAccess Frame) under det første mikroskopet og krystalliseringsplaten, inkludert krystallene som skal gjennomvåt under det andre mikroskopet.
- Skyv godt A1 på screeningplaten ved å flytte den respektive akrylglassflisen på EasyAccess Frame enten med en finger eller det medfølgende pennverktøyet.
- Tilsett 0,4 μL soaking løsning fra reservoaret til fragmentet som inneholder godt (øvre venstre linse) ved hjelp av en frisk pipettespiss. Kontroller gjennom mikroskopet at dråpen dekker det tørkede fragmentet, slik at det kan oppløses.
MERK: Alternativt kan dette trinnet utføres ved hjelp av en pipetteringsrobot før monteringen av EasyAccess Frame. På denne måten kan soaking dråper av alle brønner plasseres i en automatisk prosedyre. Forfatterne anbefaler imidlertid å legge til sugeløsningen rett før sugetrinnet som beskrevet for å sikre at fragmentet løses sakte og i nærvær av krystallen. Dette unngår at krystallen opplever et plutselig sjokk ved overføring til en dråpe med høy fragmentkonsentrasjon. - Under det andre mikroskopet, kutt opp tetningsfolien til krystalliseringsplaten ved en av brønnene som inneholder målkrystallene.
- Overfør to krystaller ved hjelp av en passende størrelse sløyfe montert på krystallstaven til brønn A1 på screeningplaten under det første mikroskopet.
- Vask løkken i den tilberedte glassflekkplaten og tørk den ved å berøre vevet forsiktig. Gjør dette etter hver overføring for å unngå krysskontaminering med fragment som inneholder sugeløsninger.
- Bruk mikroskopet til å kontrollere at krystallene er riktig plassert.
- Gå videre til neste brønn (f.eks.
- Gjenta trinn 1.13-1.18 med alle 96 brønnene på screeningplaten til hvert sugedråpe inneholder to krystaller.
- Fjern screeningplaten (inkl. EasyAccess Frame) fra under mikroskopet og plasser den på benken/bordet.
- Fjern EasyAccess Frame fra screeningplaten.
- Forsegle screeningplaten med tetningsfolie og legg den i henholdsvis krystalliseringsinkubatoren eller skapet, hvor krystallene ble dyrket.
- Inkuber for optimalisert bløtleggingstid. Over natten er vanligvis praktisk.
- (valgfritt) Tilberedning av ca. 40 apo-krystaller (dvs. spotte soaking)
- Ta en MRC 3-linse 96-brønns lavprofils krystalliseringsplate og fyll to kolonner med 40 μL sugeløsning per brønn ved hjelp av 12-kanals pipetten.
- Plasser EasyAccess Frame på toppen av krystalliseringsplaten og fest den med de medfølgende klemmene ved å skyve dem på venstre og høyre side av enheten.
- Skyv opp akrylglassflisen på brønn A1.
- Plasser 0,4 μL sugeløsning i hver av de to venstre linsene på brønnen.
- Overfør 2-3 krystaller til hver dråpe. Etter hver overføring, vask løkken i den forberedte glassflekkplaten og tørk ved å berøre vevet forsiktig.
- Gå til neste brønn (f.eks.
- Gjenta trinn 1.24.4-1.24.6 til ca. 40 krystaller er klare for inkubasjon.
- Fjern krystalliseringsplaten (inkl. EasyAccess Frame) fra under mikroskopet på benken/bordet og fjern EasyAccess Frame.
- Forsegle krystalliseringsplaten med tetningsfolie og legg den i den nevnte krystalliseringsinkubatoren eller skapet.
- Inkuber for samme tid som screeningplaten.
2.Høsting av krystaller
- Ta ut inkuberingsplaten(e) fra henholdsvis inkubatoren eller skapet.
- Ordne arbeidsplassen med ett mikroskop og alle nødvendige verktøy (Figur 3B). Materialene er oppført i materialtabellen.
- Forbered en Unipuck skum dewar med 3 Unipuck lokk (dvs. prøvekapslinger) og fyll den med flytende nitrogen (LN2).
MERK: Vær oppmerksom på de nødvendige sikkerhetsforanstaltningene for arbeid med LN2 (dvs. bruk vernebriller og bruk egnet verneutstyr). Det er best å få fersk LN2 flere ganger i løpet av økten for å unngå vannkondensasjon i LN 2-lagringskannen. Gjennom hele følgende prosedyre, sørg for at LN2-nivået i skumdewar alltid når den øvre kanten av dewar. Sørg også for at LN2 er isfri; LN2 (f.eks. én gang hvert 45. minutt), eller senest hvis isen begynner å samle seg. Fyll deretter den andre skumdewaren og overfør Unipucks til den. Tøm den isete skumdewaren og fjern gjenværende is og fuktighet med blåsetørkeren. - Fjern folien fra screeningplaten og plasser EasyAccess Frame på toppen.
- Skyv åpen brønn A1.
- Høst to krystaller fra dråpen og blitskjøl dem i LN2 (en etter en) ved å stupe med en rask vertikal bevegelse inn i LN2 og deretter sette inn prøven i riktig puckposisjon. Ta relevante notater på eksempelsporingsarket.
- Kryobeskyttelsestrinn (om nødvendig for målkrystallene). I så fall utfører du dette trinnet i stedet for 2.6.
- Plasser 0,4 μL bløtleggingsløsning, inkludert kryobeskyttelse på brønnens nedre venstre linse.
- Trekk løkken med en krystall montert fra fallet i øvre venstre linse sakte gjennom løsningen i nedre venstre linse mens du holder krystallen i løkken, og deretter blits-kjølig i LN2. Høst to krystaller på denne måten.
MERK: I trinn 2.6 og 2.7 må du sørge for at tiden krystallen er i sløyfen og utsatt for luft holdes svært kort. Dykkingen (dvs. den vertikale dråpen av prøven i den LN2-fylte dewar) skal utføres så raskt som mulig. Dette sikrer høy prøvekvalitet og forebygging av isringer i dataene. Spor prøvene (dvs. merk at hvis krystaller har skader osv.) for å prioritere enten duplikat for følgende røntgenmålinger, bruk malen for det. Selv om krystaller har sprekker, "hår" eller andre feil på grunn av bløtleggingen, kan de fortsatt brukes og bør alltid høstes. I tilfelle krystaller brøt seg inn i flere stykker, bør to av de største / flotteste brikkene høstes. Figur 5 viser noen eksempler på hvordan slike krystaller kan se ut. Alle de viste krystallene ga fortsatt nyttige datasett i den respektive kampanjen11, og understreket at det er verdt å høste krystaller etter soaking behandling, selv om betydelige morfologiske endringer skjedde.
- Gå til neste brønn og gjenta trinn 2,5 - 2,6./2,7 til alle tre puckene er fylt.
- Tilsett Unipuck-basene på toppen av lokkene etter at du har forhåndskjølt dem i LN2.
- Oppbevar Unipucks i lagringsstativer i en transportdewar eller lagringsdewar.
- Gjenta de foregående trinnene til alle brønnene på screeningplaten er behandlet.
- (valgfritt) Hvis mock-gjennomvåte krystaller ble forberedt, høst dem på en lignende måte som beskrevet på forhånd.
MERK: Hvis to krystaller for hver av de 96 forholdene på screeningplaten kan bli blitskjølt, vil det være plass til 32 mock-gjennomvåte apo-krystaller, for å fylle opp de 14 Unipucks. - Oppbevar unipucks i LN2 til målingen.
3.Datainnsamling
- Overfør Unipucks til beamline BL14.1. Hvis SPINE pucks har blitt brukt i trinn 2, overfør dem til beamline BL14.2.
- Utfør standardmålinger på bjelkelinjen ved hjelp av de spesifikke anbefalingene gitt nedenfor. Detaljer om anlegget og eksperimentkontrollprogrammet MXCuBE2 har blitt presentert tidligere15,16. Figur 4 viser interiøret i de eksperimentelle hutches av beamlines BL14.1 og BL14.2 samt et eksempel skjermbilde av MXCuBE2 kontrollprogramvare på beamline BL14.1.
- Hvis du vil maksimere tidseffektiviteten og gjennomstrømningen, hopper du over samlingen av testbilder. Prøve-til-detektor-avstanden vil bli festet til en verdi som passer for krystallsystemets øvre oppløsningsgrense som er bestemt i tidligere eksperimenter. Hvis datainnsamlingsstrategien ikke ble optimalisert på forhånd, samler du inn 1800 bilder på 0,2 grader hver med en eksponeringstid på 0,1 s per bilde.
- Ideelt sett kan du teste datainnsamlingsstrategien i tidligere eksperimenter ved hjelp av mock-soaked apo-krystaller. For høyere symmetriromgrupper vil 1200 bilder eller til og med 900 bilder (dvs. henholdsvis 240° eller 180°) allerede gi komplette datasett med god statistikk, uavhengig av startvinkelen for datainnsamling.
MERK: Høyere redundans og finere kutting kan gi overlegen datakvalitet17. Å bruke denne "nok, men ikke mer" strategien som foreslås her, er imidlertid en utmerket avveining mellom kvalitet, datainnsamlingstid, samt beregningskrav for analyse senere. På den beskrevne måten er 200 datainnsamlinger på 24 timer godt mulig ved bjelkelinjene BL14.1 og BL14.2. Likevel bør prøver prioriteres. - Samle først inn diffraksjonsdatasett for ett utvalg per fragmenttilstand, basert på prioriteringen i trinn 2.6./2.7 (dvs. samle inn dataene for det høyere prioriterte duplikatet).
- For disse eksperimentene i 3.2.3 der datainnsamlingen mislyktes, gikk diffraksjon tapt eller alvorlige isringer oppstod, samle inn data for den andre dupliserte prøven av den respektive fragmenttilstanden.
- Samle inn diffraksjonsdatasett av apokrystaller (hvis de fremstilles i henhold til trinn 1.24 og 2.12).
- Samle inn diffraksjonsdatasett for de gjenværende duplikatene av hver fragmentbetingelse.
- I MXCuBE2-programmet sammenligner du datasettidentifikatorene for en CFS-kampanje med følgende mønster:
- -[ABCDEFGH][01][0123456789][ab] (f.eks. MyProtein-F2XEntry-B05a, der "B05" står for brønnen (dvs. fragmentbetingelsen på skjermen) og følgende "a" for den første duplikaten.)
4.Data behandling
- For dataanalyse av CFS-kampanjen, bruk FragMAXapp, en nettbasert løsning for å kontrollere en multipleksanalyse for behandling av automatisk raffinement og PanDDA-treffevaluering av CFS-data18 (Lima et al. FragMAXapp, upubliserte data). I FragMAXapp-versjonen som distribueres ved HZB, er følgende programmer/datasamlebånd tilgjengelige: XDSAPP19, Xia2-DIALS og Xia2-XDS20, fspipeline7, DIMPLE21, Phenix LigFit22, PanDDA13,23. Bruk en godt raffinert inngangsmodell av målproteinet som inngang for automatisk raffinement; ellers utføre omhyggelig raffinement av en høyoppløselig mock-gjennomvåt krystall som ble samlet inn under kampanjen.
MERK: Et nøkkelelement for treffidentifikasjon er PanDDA. Detaljer er forklart i de respektive publikasjonene13,23. Kort fortalt beregner PanDDA automatisk elektrontetthetskart over et sett med datasett i en CFS-kampanje. Disse antas deretter som uforpliktende fragmentforhold og i gjennomsnitt for å generere den såkalte bakketilstandsmodellen. Jordingstilstandsmodellen brukes deretter til å utlede lokale avvik mellom hvert elektrontetthetskart og bakketilstandskartet, ved hjelp av voxel-tilknyttede Z-score. Deretter, for områder med høy Z-score, opprettes et såkalt PanDDA-kart ved finjustert subtraksjon av bakketilstandstetthet fra det respektive kartet. Dette forbedrer i stor grad synligheten av fragmentbindingshendelser. - Bruk en totrinnsmetode for å maksimere resultatet av PanDDA. For det første, å utføre en PanDDA-kjøring (pandda.analyse) med standardinnstillinger. Selv om mock-gjennomvåte krystaller er samlet inn, vil identiteten deres ikke bli inkludert som en parameter (som likevel er mulig) for å muliggjøre en objektiv generasjon av bakketilstandsmodellen av PanDDA fra alle tilgjengelige data. Etterpå evalueres utgangsdataene av brukeren via en såkalt PanDDA-inspeksjon i Coot24. Her bør treff med relativt høy tillit bemerkes, og konkluderer det første trinnet.
- For det andre, kjør pandda.analyse-trinnet på nytt unntatt de foreløpige treffene (bestemt i det første trinnet) fra bakketilstandsmodellen via kommandolinjealternativet --exclude_from_characterisation ="
". Ytterligere detaljer er beskrevet på PanDDA-hjelpesidene (https://pandda.bitbucket.io/). På denne måten vil datasett som er klare treff og dermed skjule jordtilstandsmodellen hvis den inkluderes, ignorert. Dette fører til en forbedret bakketilstandsmodell og dermed til forbedrede resultater generelt. Til slutt utføres en grundig PanDDA-inspeksjon for å fullføre treffidentifikasjonen.
MERK: FragMAXapp inkluderer også et utdataalternativ for å lagre de modellerte bundne tilstandene eller klargjøre data for PDB-innsending, for ytterligere detaljer, se FragMAX-nettsider (https://fragmax.github.io/).
Representative Results
Som en del av de tidligere rapporterte valideringskampanjene til F2X-Entry Screen11,ble tre kampanjer utført på BioMAX-strålelinjen ved MAX IV, og en kampanje ble utført ved beamline BL14.1 ved HZB. I den sistnevnte kampanjen ble et bestemt sett med F2X-Entry Screen-forhold ved hjelp av en soaking-tilstand som ikke inneholdt DMSO, screenet mot proteinproteinkomplekset gjær Aar2 og det RNaseH-lignende domenet til gjær Prp8 (AR). Det valgte settet med betingelser består av treffene som ble funnet i en tidligere kampanje på F2X-Entry Screen mot AR i en soaking-tilstand som inneholder DMSO11, (dvs. i kampanjen utført på HZB ble disse treffene vist på nytt i fravær av DMSO). Figur 7 viser en oversikt over treffene som er oppnådd etter å ha analysert dataene med FragMAXapp-kombinasjonen av XDSAPP for behandling, fspipeline for automatisk raffinement og påfølgende trefffunn ved hjelp av PanDDA.
Figur 1: Skjematisk representasjon av arbeidsflyten til et krystallografisk fragmentscreeningseksperiment (CFS) med fokus på det spesielle miljøet ved Helmholtz-Zentrum Berlin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Formulering og pakking av F2X-Entry Screen. Den 96-sammensatte skjermen er tilgjengelig på en 3-linse 96-brønns MRC lavprofilplate, forseglet med folie og vakuumpakket. De 96 forbindelsene på skjermen tørkes fra DMSO-løsninger i to av de tre linsene til hver brønn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fotografering av CFS-arbeidsbenken i HZB-forberedelseslaboratoriet. Samlinger av nødvendige verktøy for A) soaking og for B) krystallhøsting vises. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Sluttstasjoner for datainnsamling og kontrollprogramvare. A) Fotografi av eksperimentell hutch av HZB-MX bjelkelinjer BL14.1 (venstre) og BL14.2 (høyre)15. B) Skjermbilde av MXCuBE2-eksperimentkontrollgrensesnittet16 som brukes ved BL14.1 for innsamling av diffraksjonsdata. På BL14.2 brukes et veldig likt grensesnitt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Fotografiske øyeblikksbilder av noen krystallinske prøver i kryogent miljø før datainnsamling. Dette illustrerer variasjonen av morfologier av krystallene etter å ha utført fragmentet soaking og krystall høsting. Fotografiene ble tatt på BioMAX-strålelinjen (MAX IV synchrotron, Lund, Sverige) for AR-prøver samlet der som en del av F2X-Entry Screen-valideringen11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Skjermbilde av FragMaxApp18 installert på HZB for praktisk dataanalyse. Flere detaljer i Lima et al., FragMAXapp, upubliserte data. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Oversikt over resultatene av CFS-kampanjen F2X-Entry vs. AR (uten DMSO). AR-proteinkomplekset vises i tegneserievisning, med Aar2 farget i grått og RNaseH-lignende domene av Prp8 farget i blått. Fragmenttreffene i kampanjen er farget i elementfarger (C - gul, O - rød, N - blå, S - oransje, Cl - lys cyan). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Utfyllende informasjon. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
For en vellykket CFS-kampanje er det viktig å følge de beskrevne forutsetningene (se Introduksjon). Et pålitelig krystalliseringssystem er nødvendig for den reproduserbare veksten av mange godt diffracting krystaller, og en godt raffinert struktur er nødvendig som input apo modell for automatisert raffinement. Det er også viktig å sjekke at målstedet på proteinet (aktivt sted eller grensesnittområde) er tilgjengelig for fragmenter i krystallgitteret. Det er avgjørende å optimalisere soakingforholdene på forhånd for å sikre at bløtleggingen ikke forverrer krystallkvaliteten betydelig. Forsømmelse av disse aspektene vil sannsynligvis føre til et suboptimalt eksperiment, som vil være til begrenset bruk og vil i verste fall kreve en gjentakelse av hele eksperimentet.
Protokollen beskrevet ovenfor skisserer prosedyrene som følges under en standard CFS-kampanje. Hvis alle forutsetninger er oppfylt, bør minst 90% av alle gjennomvåte krystaller vise diffraksjon til høy oppløsning i et diffraksjonseksperiment. Hvis dette ikke er tilfelle, kan sugetidene forkortes til noen timer eller til og med minutter. På grunn av den gode løseligheten til de fleste fragmentene, bør dette være nok til å oppnå anstendige beleggsverdier. En typisk CFS-kampanje vil også resultere i en trefffrekvens på omtrent 10% eller høyere. For F2X-Entry Screen-valideringskampanjene11 og pågående brukerkampanjer med samme bibliotek er det observert enda høyere trefffrekvenser (20% og over, data ikke vist).
En generell advarsel om krystallografisk fragmentscreening er tilstedeværelsen av krystallografiske kontaktsider. Disse kan enten okkludere a priori kjente aktive nettsteder (som skal kontrolleres før screening, se ovenfor), eller disse kontaktsidene gir også ofte lommer og hot spots der fragmenter kan binde seg. Slike fragmenttreff vil være gjenstander av krystalliseringsgitteret og vil sannsynligvis ikke binde seg til proteinet i løsningen. Disse hendelsene har en tendens til å forekomme oftere i soaking eksperimenter enn i co-krystallisering eksperimenter (sannsynligvis på grunn av høyere fragmentkonsentrasjoner ansatt i soaking eksperimenter). Men ifølge tidligere erfaring utgjør de generelt bare en mindre del av treffene som er oppnådd. I valideringskampanjen F2X-Entry Screen ved hjelp av endothiapepsin (EP) og det spleiseosomale proteinproteinkomplekset Prp8RNaseH og Aar2 (AR) skjedde for eksempel de fleste treffene på lovende steder11. For EP var 27 av de 37 observerte bindingshendelsene plassert på det aktive stedet (dvs. peptidklemmen til denne protease). De 10 fjernbindingshendelsene består av to løsningsmiddelutsatte bindingshendelser og åtte krystallkontaktbindingshendelser (tilsvarende fem unike treff). Ekskludert disse krystallkontakttreffene vil fortsatt gjenspeile en samlet hastighet på 24% unike treff for EP-kampanjen. Det er også viktig å legge merke til at bindingshendelser som er fjernt på et kjent aktivt sted (unntatt krystallkontaktpermer) også kan være interessante (f.eks. avsløre nye hot spots eller allosteriske steder av proteinet). For AR-kampanjen (i samme publikasjon), av de 23 observerte bindingshendelsene, var syv plassert ved krystallkontakter, en var plassert ved direkte grensesnitt av de to proteinene, syv var plassert på kjente proteinproteininteraksjonssteder med andre bindende partnere i den større biologiske konteksten (derav forskjellige monteringsstadier av skjøteosomet), åtte bindende hendelser avslørte to hot spots på AR av ennå ukjent funksjon og en er på en løsningsmiddeloverflate av Prp8Rnas . Derfor, unntatt hendelsene ved krystallkontakter og Prp8RnaseH singleton, er antall potensielt nyttige bindingshendelser 15 (tilsvarende 14 unike treff) og dermed en trefffrekvens på 15,6%. Disse treffene kan være utgangspunkt for design av proteinproteininteraksjonsmodulatorer eller for verktøyforbindelser som tar sikte på å utforske de to oppdagede Aar2-hot spots. Samlet, også i tråd med gjennomførte brukerkampanjer, må ofte bare en mindre del av treffene i krystallografisk fragmentscreening ses bort fra som artefakter. Dette vil imidlertid også i stor grad være målavhengig.
Hvis trefffrekvensen er betydelig lavere, kan dette indikere et av følgende problemer relatert til målproteinet. For eksempel, i en CFS-kampanje mot en viral cysteinprotease ble det observert en trefffrekvens på bare 3% (data ikke vist). Det viste seg at proteinet som ble brukt sannsynligvis ble kjemisk modifisert på sitt aktive sted. I et slikt tilfelle kan et annet proteinpreparat løse problemet. Hvis krystaller er svært DMSO-intolerante, kan F2X-Entry Screen også brukes uten DMSO, selv om resultatene kan variere til en viss grad. De fleste treffene oppnådd i nærvær av DMSO vil også dukke opp i sitt fravær. Det vil også være noen treff som ikke kan observeres i fravær av DMSO, selv om de kan observeres i nærvær. Og til slutt vil det være noen som bare dukker opp i fravær av DMSO.
De alvorligste vanskelighetene oppstår hvis proteinet gjennomgår en indusert passformbevegelse på stoffbinding. Mest sannsynlig vil krystallgitteret ikke tolerere proteinbevegelsen, og krystallene vil gå i oppløsning. I et slikt tilfelle er det eneste valget å ty til co-krystallisering av proteinet og fragmentene. Dette kan imidlertid føre til nye krystallformer. Derfor vil mye av automatiseringen av hele prosessen ikke fungere effektivt lenger. Heldigvis, i de fleste CFS-kampanjer utført på HZB så langt, har denne typen problemer ikke blitt oppstått. Det kan være at den svake bindingen av et fragment ikke gir nok energi til å indusere en proteinbevegelse, spesielt hvis den krystalliserte konformasjonen stabiliseres av krystallpakkekrefter.
En annen alvorlig begrensning av metoden som forfatterne har møtt så langt er når krystalliseringscocktailen (og dermed sugeløsningen) inneholder flyktige forbindelser. Da blir det nesten umulig å utføre all krystallhåndtering på en meningsfull måte.
Ulike proteiner kan inneholde medikamenterbare steder i større eller mindre grad. For eksempel formidles proteinproteininteraksjoner vanligvis av utvidede flate overflater som er vanskeligere å målrette mot. Fragmentbindingshastigheten vil derfor sannsynligvis avhenge av strukturen til proteinets molekylære overflate. I et ekstremt tilfelle kan det hende at et protein ikke inneholder egnede overflate hot spots som fungerer som målsteder for fragmentbinding. Til tross for et omhyggelig utført eksperiment, vil det derfor ikke komme fragmenttreff fra visningen. Forfatterne har imidlertid så langt ikke opplevd en slik situasjon.
I prinsippet, ved hjelp av protokollen som er skissert ovenfor, kan krystall soaking og høsting en del av en CFS-kampanje utføres i ethvert laboratorium som er utstyrt for krystallhåndtering. Dette skiller metodikken ved HZB fra andre CFS-anlegg og kan i noen tilfeller være en fordel. For eksempel, hvis krystallene ikke lett kan produseres på nytt på et annet sted, eller hvis reisen til eksperimentene er begrenset (f.eks. i en verdensomspennende pandemisituasjon), er brukere på HZB derfor utstyrt med hele utstyret (pucks, verktøy, EasyAccess Frame, prøveholdere, etc.) som et bærbart sett.
Kravene til et stort antall prøveholdere og kryogen lagringskapasitet er imidlertid fortsatt mer praktisk oppfylt på dedikerte CFS-anlegg. Videre er behovet for innsamling av mange diffraksjonsdatasett sterkt talsmenn for lokalisering av disse anleggene nær bjelkelinjer som er rettet mot en høy prøvegjennomstrømning. Eksempler på dette er bjelkelinjene I04-1 ved Diamond Light Source og det tilknyttede XChem-anlegget i UK8,25, MASSIF-strålelinjene ved ESRF i Frankrike26 eller FragMAX-anlegget ved BioMAX-strålelinjen ved MAX IV i Sverige18.
I fremtiden kan man se for seg å designe CFS-eksperimenter uten behov for krystallhåndtering helt. Første fremskritt i denne retningen er rapportert. For eksempel, ved akustisk væskeoverføring som tillater blanding av både de krystallholdige løsningene og fragmentløsningene direkte på maske-type prøveholdere27. En annen tilnærming ble brukt til XFEL-basert ligandscreening. I et prinsippbeviseksperiment ble det utarbeidet en krystallslam i batch, og bløtlegging og diffraksjonsdatainnsamling ble utført på en silisiumfast målbrikke28. Imidlertid er disse tilnærmingene fortsatt under utvikling og langt fra å være gjeldende for et bredt spekter av proteinmål eller mulig for CFS-anlegg som rutine.
Med protokollen i dette arbeidet har detaljerte instruksjoner for vellykket utførelse av CFS-kampanjer rett frem på HZB (og andre steder) blitt skissert og generell veiledning og nyttige praktiske tips for å forberede og gjennomføre slike eksperimenter med høyere sjanser for suksess er gitt. Til syvende og sist bidrar bedre odds og suksessrater i CFS-screening i stor grad til å effektivt gi utgangspunkt for nedstrømsutvikling av verktøyforbindelser eller narkotikakandidater.
Disclosures
En patentsøknad angående EasyAccess Frame er innlevert av Helmholtz-Zentrum Berlin med det tyske patent- og varemerkekontoret med registreringsnummer DE 10 2018 111 478.8. I tillegg er det innlevert en internasjonal patentsøknad via PCT-ruten, ved hjelp av prioriteten til det tyske patentet.
Acknowledgments
Vi takker de mange brukergruppene som har utført CFS-kampanjer på HZB. Deres tilbakemeldinger førte til den trinnvise forbedringen av arbeidsflyten vår. Vi vil takke legemiddeldesigngruppen ved University of Marburg og FragMAX-gruppen ved MAX IV, da de nære samarbeidene var grunnlaget for flere utviklingssprang for forbedret CFS. Vi er takknemlige for støtten fra det tyske føderale utdannings- og vitenskapsdepartementet (BMBF), via prosjektene Frag2Xtal og Frag4Lead (tallene 05K13M1 og 05K16M1). Vi er også takknemlige for støtten via iNEXT-Discovery, prosjektnummer 871037, finansiert av Horisont 2020-programmet til EU-kommisjonen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µL pipet | Eppendorf | EP3123000012 | |
| 12 channel pipet, 100 µL | Eppendorf | EP4861000791 | |
| Blow dryer | TH-Geyer | 9.106 788 | |
| Crystal containing crystallization plates | Contains crystals to be soaked | ||
| Crystallization incubator | Providing constant temperature for crystallization experiment, at HZB: 20°C | ||
| Dual Thickness MicroLoops (LD) of different aperture sizes | MiTeGen | various, e.g. M5-L18SP-75LD |
250 loops in the appropiate size needed for the protocol, can be provided by HZB |
| EasyAccess Frame | HZB | The EasyAccess Frame is a special device for handling multiple crystals, which was developed at the HZB (Barthel et al., 2021). | |
| F2X-Entry Screen plate | HZB | Developed F2X-Entry Screen (Wollenhaupt et al., 2020) | |
| Glas spot plate | VWR | MARI1406506 | |
| Liquid nitrogen | At least a filled up 5 L can | ||
| Liquid nitrogen storage can | n.a. | n.a. | |
| Magentic crystal wand | MiTeGen | M-R-1013198 | |
| Microscopes | Leica | n.a. | |
| MRC 3-lens 96-well low profile crystallization plate | SwissCI | 3W96TLP-UVP | For mock-soaked crystals (optional) |
| Reagent reservoir | Carl Roth | EKT6.1 | 25 ml volume |
| Sample tracking template | https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking. xlsx |
||
| Scalpel | B. Braun | BA825SU | |
| Sealing foil for microtiter plates | GreinerBioOne | 676070 | |
| Shelved puck shipping canes (for Unipucks) | MiTeGen | M-CP-111-065 | 2 canes made of aluminum; can be provided by the HZB |
| Soaking solution | At least 5 ml are needed | ||
| Soaking solution including cryo-protectant, 150µL | Only needed if soaking solution is not cryo-protectant already | ||
| Tissues | Roth (Kimberly Clark Professional) | AA64.1 | |
| Transport dewar (Whartington dry shipper) | MiTeGen | TW-CX100 | 2 Travel dewars for storage of the 2 unipuck canes, alternatively a storage dewar of type VHC35 or similar could be used. |
| Unipuck foam dewars with lid | MiTeGen | M-CP-111-022 | two foam dewars especially suited for unipuck handling described in the protocol if SPINE pucks are used, different foam dewars might have to be applied. |
| Unipuck starter set | MiTeGen | M-CP-UPSK001 | Can be provided by the HZB |
| Unipucks | MiTeGen | M-CP-111-021 | 14 unipucks; can be provided by the HZB |
References
- Erlanson, D. A., Fesik, S. W., Hubbard, R. E., Jahnke, W., Jhoti, H. Twenty years on: the impact of fragments on drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 605-619 (2016).
- Hall, R. J., Mortenson, P. N., Murray, C. W. Efficient exploration of chemical space by fragment-based screening. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 116 (2-3), 82-91 (2014).
- Erlanson, D. A. Introduction to fragment-based drug discovery. Topics in Current Chemistry. 317, 1-32 (2012).
- Scott, D. E., Coyne, A. G., Hudson, S. A., Abell, C. Fragment-based approaches in drug discovery and chemical biology. Biochemistry. 51 (25), 4990-5003 (2012).
- Lamoree, B., Hubbard, R. E. Current perspectives in fragment-based lead discovery (FBLD). Essays in Biochemistry. 61 (5), 453-464 (2017).
- Schiebel, J., et al. Six Biophysical Screening Methods Miss a Large Proportion of Crystallographically Discovered Fragment Hits: A Case Study. ACS Chemical Biology. 11 (6), 1693-1701 (2016).
- Schiebel, J., et al. High-Throughput Crystallography: Reliable and Efficient Identification of Fragment Hits. Structure. 24 (8), 1398-1409 (2016).
- Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein-ligand structure determination. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (3), 267-278 (2017).
- Radeva, N., et al. Active Site Mapping of an Aspartic Protease by Multiple Fragment Crystal Structures: Versatile Warheads to Address a Catalytic Dyad. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (21), 9743-9759 (2016).
- Cox, O. B. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7 (3), 2322-2330 (2016).
- Wollenhaupt, J., et al. F2X-Universal and F2X-Entry: Structurally Diverse Compound Libraries for Crystallographic Fragment Screening. Structure. 28 (6), 694-706 (2020).
- EU OPENSCREEN fragment library. , Available from: https://www.eu-openscreen.eu/services/compound-collection/fragment-library.html (2020).
- Pearce, N. M., et al. A multi-crystal method for extracting obscured crystallographic states from conventionally uninterpretable electron density. Nature Communications. 8, 15123 (2017).
- Barthel, T., Huschmann, F. U., Wallacher, D., Klebe, G., Weiss, M. S., Wollenhaupt, J. Facilitated crystal handling using a simple device for evaporation reduction in microtiter plates. Journal of Applied Crystallography. 54, (2021).
- Mueller, U., et al. The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives. The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141 (2015).
- Oscarsson, M., et al. MXCuBE2: The dawn of MXCuBE collaboration. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (2), 393-405 (2019).
- Mueller, M., Wang, M., Schulze-Briese, C. Optimal fine φ-slicing for single-photon-counting pixel detectors. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (1), 42-56 (2012).
- Lima, G. M. A., et al. FragMAX: The fragment-screening platform at the MAX IV Laboratory. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 76 (8), 771-777 (2020).
- Sparta, K. M., Krug, M., Heinemann, U., Mueller, U., Weiss, M. S.
- Winter, G. xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (4), 235-242 (2011).
- Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (8), 915-922 (2006).
- Pearce, N. M., Krojer, T., Von Delft, F. Proper modelling of ligand binding requires an ensemble of bound and unbound states. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (3), 256-266 (2017).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- Collins, P. M., et al. Chapter Eleven - Achieving a Good Crystal System for Crystallographic X-Ray Fragment Screening. Methods in Enzymology. 610, 251-264 (2018).
- Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
- Cuttitta, C. M., et al. Acoustic transfer of protein crystals from agarose pedestals to micromeshes for high-throughput screening. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (1), 94-103 (2015).
- Moreno-Chicano, T., et al. High-throughput structures of protein-ligand complexes at room temperature using serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 6 (6), 1074-1085 (2019).
