Summary
Denne artikkelen demonstrerer utarbeidelsen av et skreddersydd bildevindu supplert med infusjonskanyle og implantasjon på CA1-regionen av hippocampus hos mus.
Abstract
Imaging neuronal aktiviteter ved encellet oppløsning i våken oppføre dyr er en svært kraftig tilnærming for undersøkelse av nevrale kretsfunksjoner i systemer nevrovitenskap. Imidlertid begrenser høy absorbans og spredning av lys i pattedyrvev intravital avbildning for det meste til overfladiske hjerneregioner, og etterlater dype hjerneområder, som hippocampus, utenfor rekkevidde for optisk mikroskopi. I denne videoen viser vi forberedelsen og implantasjonen av det skreddersydde bildevinduet for å muliggjøre kronisk in vivo-avbildning av dorsal hippocampal CA1-regionen i hodefaste oppførende mus. Det skreddersydde vinduet er supplert med en infusjonskanyle som tillater målrettet levering av virale vektorer og legemidler til bildeområdet. Ved å kombinere dette preparatet med bredfeltsavbildning utførte vi en langsiktig registrering av nevronaktivitet ved hjelp av en fluorescerende kalsiumindikator fra store undergrupper av nevroner i å oppføre seg mus over flere uker. Vi demonstrerte også anvendbarheten av dette preparatet for spenningsavbildning med enkeltspissoppløsning. Høytytende genetisk kodede indikatorer på nevronaktivitet og vitenskapelige CMOS-kameraer tillot tilbakevendende visualisering av subcellulære morfologiske detaljer av enkle nevroner ved høy temporal oppløsning. Vi diskuterer også fordelene og potensielle begrensningene ved den beskrevne metoden og dens kompatibilitet med andre avbildningsteknikker.
Introduction
Hippocampus er en viktig hjerneregion som er ansvarlig for læring og minne1, så vel som for romlignavigasjon 2. Hippocampal atrofi er forbundet med nevrologiske og psykiatriske lidelser som involverer hukommelsestap og kognitiv nedgang3,4,5. Hos mus er hippocampus en veldig veletablert modell for å studere romlig, kontekstuell og assosiativ læring og minnedannelse på celle- og nettverksnivå4,5. De mekanistiske studiene av læring og hukommelse krever langsgående forhør av nevronstruktur og funksjon i å oppføre seg mus. Fluorescensavbildning i kombinasjon med genetisk kodede sonder6 gir enestående evner til å registrere membranspenningsdynamikk7,8, kalsiumtransienter9, og strukturelle endringer10 over store undergrupper av nevroner intravitalt. Imidlertid er optisk tilgang til hippocampus hos mus blokkert av cortex, som kan nå over 1 mm i tykkelse. Her beskrev vi en prosedyre for montering av en skreddersydd bildebehandlingsenhet og dens kroniske implantasjon i musehodet for langsiktig optisk tilgang til CA1-underregionen av dorsal hippocampus i oppførende mus. Infusjonskanyle integrert i bildeimplantatet gjør det mulig å administrere virus eller legemidler direkte på nevronene innen synsfeltet. Det beskrevne preparatet i kombinasjon med bredfeltsmikroskopi muliggjør tilbakevendende avbildning av de store undergruppene av nevroner i å oppføre seg mus over lange perioder. Vi brukte dette preparatet til å uttrykke kalsium- og spenningsgenetisk kodede indikatorer i hippocampal CA1-regionen via målrettet injeksjon av rekombinant adeno-assosiert virus (rAAV) for nevronale aktivitetsopptak ved encellet oppløsning. Vi utførte også langsgående kalsiumavbildning av de tilsvarende nevronale undergruppene ved høy romlig oppløsning ved å oppføre seg dyr. I tillegg er dette preparatet kompatibelt med multifotonmikroskopi og mikroendoskopi, og utvider dermed verktøykassen for avbildningsteknikker ytterligere for å studere nevronnettverk på cellulære og subcellulære nivåer i å oppføre seg mus. Vi beskrev kritiske trinn og feilsøking av protokollen. Vi diskuterte også mulige fallgruver og begrensninger ved metoden.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Westlake University.
1. Montering av implantater
MERK: Montering av bildeimplantatet er teknisk enkelt og krever kun kommersielt tilgjengelige gjenstander (Figur 1, se også Materialtabell). Hodeplatene kan produseres på det lokale maskinverkstedet ved hjelp av rustfritt stål eller titanplater. Vi foreslår at du forbereder et lager av ferdigmonterte implantater før du starter operasjonene. Etter at in vivo eksperimenter er gjort, kan implantatene gjenopprettes og gjenbrukes flere ganger. I noen tilfeller kan det bare kreve reattaching infusjonskanylen ved lodding eller utskifting av dekkglasset.
- Klargjør alle de seks viktige maskinvarekomponentene for montering og installasjon av bildeimplantater (figur 1).
Figur 1: Seks viktige maskinvarekomponenter for montering og installasjon av bildeimplantatet. (A) Dummy kanyle. (B) Guide kanyle. (C) Bildekanyle. (D) Glass deksel glass. (E) Hodeplate. (F) Intern kanyle. Skalastang: 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Slå på sveisemaskinen og varm den opp til ønsket temperatur.
MERK: Temperaturen avhenger av sveiseformen som brukes. - Poler sideoverflaten på bildekanylen ved hjelp av fint sandpapir for å fjerne oksidasjonslaget og dermed lette sterkere lodding.
- Juster posisjonen til bildekanylen og injeksjonskanylen (føringskanyle med innsatt dummykanyle) ved hjelp av hjelpehender (Figur 2A, B).
- Bruk en sprøyte med en nål, påfør en liten mengde passende type flux på koblingspunktet mellom avbildning og injisering av kanyler i 5 sekunder, og fjern deretter dråpen.
MERK: For dette preparatet brukte vi en kommersielt tilgjengelig flux som er spesifisert av produsenten for lodding av rustfrie ståldeler, da bilde- og infusjonskanyler er laget av rustfritt stål. Når det gjelder andre materialer som brukes til å produsere kanyler, bør sluttbrukeren velge flux som kan sveise det valgte materialet. - Smelt loddeformen og påfør den på koblingspunktet som behandles med fluss(figur 2).
MERK: Unngå overflødig loddeform, da det vil kreve unødvendig større kraniotomi under operasjonen.
Figur 2: Skjematisk for montering av injeksjonskanyle, bestående av føringskanyle med innsatt dummykanyle, med bildekanylen. (A) Vinkelen mellom injeksjonskanylen og bildekanylen skal være proksimalt 45 grader. (B) Spissen av injeksjonskanylen skal være rett på kanten av bildekanylen. (C) En passende størrelse på sveiseformen som brukes til loddeavbildning og injeksjonskanyler (rød linje indikerer omrisset av tinndråpen). (D) Upassende størrelse på sveiseformen som bør unngås under implantatforberedelse (rød linje indikerer omrisset av tinndråpen). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Vent til loddeformen er avkjølt. Vanligvis tar det flere sekunder.
- Bekreft at injeksjonskanylen ikke er blokkert ved å sette inn dummykanylen fra begge retninger.
- Påfør UV-herding optisk lim på undersiden av bildekanylen ved hjelp av en tannpirker eller 26 G sprøytenål.
- Bruk en fin pinsett for å forsiktig plassere et dekselglass av tilsvarende størrelse til bildekanylen.
MERK: Plasseringen av glasset må gjøres nøyaktig på bildekanylen uten å flytte glasset for mye når det har rørt det optiske limet. Ellers blir glasset skittent, og reduserer dermed kvaliteten på avbildningen. - Herd limet i minst en time med 350-400 nm UV-belysning fra en standard håndholdt UV-lampe.
MERK: Det brukte limet må være optisk gjennomsiktig. Ellers vil det redusere kvaliteten på bildevinduet.
FORSIKTIG: Unngå hud- og øyeeksponering ved å bruke UV-beskyttende briller, hansker og en labfrakk. - Vask kanylen i 70% etanol, lufttørk og oppbevar i en steril beholder til operasjonen.
MERK: Det er svært viktig å holde dekkglasset så rent og intakt som mulig. Det brukte optiske limet er kjemisk stabilt i 70% etanol.
2. Vindusimplantasjon
- Forberedelse trinn før operasjonen
- Steriliser alle kirurgiske instrumenter i en autoklav.
- Forbered 1x PBS og 70% etanol i to separate Petri-retter.
- Eventuelt: Desinfiser operasjonsområdet ved hjelp av UV-lys i minst 20 minutter før du starter den kirurgiske prosedyren.
MERK: Bruk under de mest sterile forholdene som er mulig, vil resultere i vellykkede og langvarige (så lenge som 6 måneder) glassdekte kranialvinduer. Forurensning kan føre til redusert vindusgjennomsiktighet eller alvorlig betennelse i de fleste tilfeller.
- Kirurgisk prosedyre
- Steriliser det kirurgiske området med 70% etanol rett før operasjonen.
- Vei dyret og administrer en pre-kirurgisk dose smertestillende subkutant i henhold til IACUC-godkjent dyreprotokoll.
- Bedøv en mus med isofluran (4% for induksjon, 1,5-2% for vedlikehold, 0,3-0,5 l / min lufthastighet). Bruk en hale-klemme og tå-klemme teknikk for å sikre at dyret er helt bedøvet. Vær oppmerksom på vitale tegn på dyret, for eksempel åndedrett, SpO2og hjertefrekvens så lenge prosedyren varer.
- Bruk en trimmer eller depilatorisk krem for å fjerne pelsen fra baksiden av nakken opp til øynene.
- Plasser musen i en stereotaxic ramme over en kirurgi oppvarming pad (opprettholde 37 °C). Fest hodet med ørestenger. Skyv hodet litt i alle retninger for å sikre at hodet er godt festet.
- Påfør øyesalve for å forhindre at dyrets øyne tørker ut under operasjonen.
- Steriliser operasjonsstedet med betadin etterfulgt av 70% etanol tre ganger før du gjør et snitt.
- Fjern huden over toppen av skallen, og start med et horisontalt kutt langs hodebunnen, etterfulgt av to kutt i rostralretningen, nesten når øyelokkene, deretter to skrå kutt som konvergerer ved midtlinjen.
- Med to sterile bomullspinne trekker du inn bindevevet, samt muskulaturen på baksiden av nakken, til kantene på skallen.
MERK: Prøv å unngå å skade blodårene (spesielt de som er skjult i muskelen) under manipulering. - Påfør en dråpe lidokainoppløsning (~ 0,1 ml) på overflaten av periosteum i 2 minutter for å unngå overdreven smerte. Eventuelt for å redusere hjernen fra hevelse etter fjerning av skallen, kan 0,1 ml 1% deksametason injiseres subkutant.
- Skrap forsiktig hele det eksponerte området av skallen med en skalpell for å skape en tørr og grov overflate som gjør at lim og tannsementen kan feste seg bedre og dermed resultere i kronisk implantasjon.
- Plasser spissen av nålen montert på den stereotaktiske stasjonen på bregmaen, sett alle tre koordinatene (AP: Anterior-Posterior; ML: Medial-Lateral; DV: Dorsal-Ventral) som 0.
- Plasser spissen av nålen på lambdaen og se om AP-koordinaten er 0 for å bekrefte at hodeposisjonen er vertikal, samt om ML-koordinaten er 0 for å bekrefte at hodet er plassert horisontalt. Hvis ikke, juster tilsvarende knotter på stereotaxic-stasjonen, til AP- og ML-koordinatene begge er innenfor 0,1 mm.
- Flytt spissen av nålen for å finne de tilsvarende punktene for kraniotomi og merk deres posisjoner på skallen ved hjelp av en fin markør. Ved implantasjon for hippocampus er det 4 punkter med følgende koordinater (AP: -0,68, ML: -2,0) (AP: -3,68, ML: -2,0) (AP: -2,18, ML: -0,5) og (AP: -2,18, ML: -3,5)11, samt (AP: -4,0, ML: -2,0) for det mest kaudale punktet i injeksjonskanylen.
MERK: Markøren som brukes i dette trinnet må steriliseres ved hjelp av UV-belysning i minst en time før operasjonen. Koordinatene som vises her er for 6-8 uker gamle C57BL / 6J mus. Koordinatene kan variere på grunn av forskjellige aldre eller stammer av mus. - Tegn en sirkel basert på fire merkede punkter, samt omrisset av injeksjonskanyleområdet på den kaudale siden av sirkelen (figur 3).
- Bruk en pneumatisk drill med en hastighet på 10.000 rpm for å forsiktig "tegne" langs omrisset som er merket på skallen.
- Bor skallen til et veldig tynt lag med bein er igjen, som vanligvis begynner å vri seg under mild berøring i midten.
- Påfør en dråpe steril 1x PBS i midten av kraniotomien, løft beinklaffen fra skallen med veldig tynne spiss tang eller to 26 G nåler som nærmer seg fra motsatte sider.
MERK: PBS vil bidra til å fjerne skallen og forhindre mulig blødning av dura12. - Påfør PBS, etterfulgt av mild aspirasjon gjennom en 26G stump nål flere ganger for å rengjøre overflaten av dura.
- Fjern forsiktig dura, enten ved aspirasjon eller ved oftalmisk saks. Påfør mild sug (~ -60kPa) for å fyre opp cortex, samt corpus callosum over hippocampus.
MERK: Cortex er ofte mer gul enn corpus callosum, og corpus callosum er vanligvis hvitere enn hippocampus. Corpus callosum er vanligvis lett å skille mellom nevronale fibre som går i vertikale og horisontale retninger når de observeres fra toppen (Figur 3).
Figur 3: Stereotoksiske koordinater for hippocampusplassering og hjerneablasjonsprosess. (A) Fire koordinater for kantene på kraniotomiområdet. (B) Fullstendig kraniotomiområde. (C-E) Representative bilder ervervet under operasjonen (venstre) og deres skjematiske diagram (høyre) som indikerer de forskjellige farger og retninger av nevrale fibre av (A) Cortex (B) Corpus Callosum, og (C) Hippocampus synlig under cortex ablasjon. Skalastang: 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Blødning på dette punktet vil påvirke synligheten av hjernevevet i kraniotomien. Påfør 1x PBS, etterfulgt av mild sug, mens du aspirerer cortex for å kvitte seg med blodet.
MERK: Kontinuerlig blødning er uunngåelig i dette trinnet, og til en viss grad er kontinuerlig blødning et tegn på normalt blodtrykk. I motsetning til cortex bildevindu implantasjon, tilstedeværelsen av blod under det optiske vinduet er akseptabelt siden det vil bli ryddet flere dager etter operasjonen. Innsetting av bildekanylen til det opprettede hulrommet så snart som mulig etter ablating cortex er optimal. - Hvis kraniotomien er større med <0,5 mm enn bildekanylen, må du redde installasjonen av kanylen til en viss grad ved å bruke ekstra Kwik Sil-tetning før du fester implantatet med SuperBond.
- Hvis kraniotomien er mindre med <0,5 mm enn bildekanyle, må du redde den kirurgiske prosedyren til en viss grad ved å trimme kanten av kraniotomien ved hjelp av en fin pinsett eller et par oftalmiske saks siden det gjenværende beinet på kanten av kraniotomi er tynnere enn selve skallen som følge av boring.
MERK: Kraniotomier som overskrider områdene over 0,5 mm kan ikke reddes. De tilsvarende handlingene i disse tilfellene bør følge avslutningsprosedyren i henhold til dyreprotokollen.
- Sett implantatet forsiktig inn i kraniotomien.
- Trykk hardt på toppen av implantatet med den L-formede nålen for å plassere det optiske vinduet på implantatet så nært som mulig til den eksponerte overflaten av hippocampus. Bruk gjentatte ganger PBS på skallen rundt implantatet etterfulgt av sug for å fjerne blod så mye som mulig under innsetting av implantatet. Påfør deretter et tynt lag med Kwik Sil mellom implantatet og skallen for å forhindre at tannsement trer inn under skallen (figur 4).
- Forsikre deg om at plasseringen av implantatets optiske vindu er rett mot hippocampus for å unngå blod eller annen væskeakkumulering under.
MERK: Det kritiske punktet er å sørge for at dekselglasset på bildekanylen er plassert rett mot hippocampus, noe som kan kreve forsiktig trykk på toppen av kanylen under installasjon og tetningsprosess. Hvorvidt oversiden av bildekanylen er parallell med skallen er ikke kritisk for den endelige optiske tilgangen så lenge det optiske vinduet er plassert mot hippocampus. - I henhold til den gjennomsnittlige tykkelsen på cortex over CA1-området, hold den øvre overflaten av bildekanylen over skalleoverflaten med ~ 0,5 mm for å lette festingen av kanylen til skallen (Figur 4).
- Forsikre deg om at plasseringen av implantatets optiske vindu er rett mot hippocampus for å unngå blod eller annen væskeakkumulering under.
- Når Kwik Sil er herdet, som vanligvis ikke tar mer enn ~ 1 min, påfør Super-Bond C &B jevnt på overflaten av skallen, overflaten av Kwik-Sil og den øvre overflaten av implantatet.
- Når Super-Bond C &B er kurert, bruk protese base harpiks over Super-Bond C &B, samt huden rundt snittet laget i begynnelsen av operasjonen.
MERK: Alternative typer sement er tilgjengelige fra flere leverandører. Følg instruksjonene fra den tilsvarende produsenten. - Etter at protesebaseharpiksen er herdet, plasser hodeplaten på harpiksen rundt implantatet og gjør den konsentrisk med bildekanylen. Påfør mer protesebaseharpiks rundt og over hodeplaten for å fikse posisjonen. La det kurere i flere minutter.
- Unngå å bygge opp et tykt lag med sement rundt kanylen for å sikre bedre tilgang til bildevinduet med objektivlinsen (figur 4).
Figur 4: Skjematisk diagram over vindusimplantasjon i (A) coronal- og (B)-sagittalvisning. (a) Hodeplate; (b) Protese base harpiks; (c) Superbond; (d) Kwik-Sil; (e) Bildekanyle; (f) Injeksjonskanyle; (g) Loddeform. (C): Mus med det installerte implantatet etter operasjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Fortynn protesebaseharpiksen for å redusere viskositeten, slik at den kan fylle forbeholdene som er vanskelige å nå med en applikator.
- Plasser forsiktig et isolert gummibånd over vinduet for å beskytte vinduet mot mulig forurensning fra dyre sengetøy.
- Når operasjonen er ferdig, injiser antiinflammatorisk legemiddel subkutant for å forhindre en inflammatorisk respons.
- Plasser dyret i et varmt bur til det gjenoppretter fra anestesi.
- Sjekk helsestatusen til musen for 72 timer etter operasjonen ved å observere generell oppførsel. Antiinflammatorisk legemiddel og smertestillende injiseres subkutant i to-tre dager etter operasjonen hver 24.
MERK: Alternative overvåkingsprosedyrer, legemidler og doser er mulig for postoperativ behandling, se IUCAC-godkjent dyreprotokoll for den nøyaktige prosedyren. - Kontroller vinduet 5-7 dager etter operasjonen for å observere vaskulatur under vinduet. I tilfelle av et klart vindu er dyret klart for virusinjeksjon.
3. Virusinjeksjon
MERK: Virusinjeksjon gjøres vanligvis i 5-7 dager etter operasjonen. Før virusinjeksjon må det bekreftes at bildevinduet er klart, og det er mulig å observere hjernevaskulatur (Figur 5). I noen tilfeller kan det ta opptil 14-16 dager å rydde vinduet, noe som også er akseptabelt hvis ingen hjernebetennelse oppdages.
Figur 5: Representativt bilde av optisk vindu (A) før og (B) etter virusinjeksjon supplert med FastGreen fargestoff. Pil indikerer samme vaskulære struktur. Skalastang: 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Tilsett Rask grønn fargestoffløsning til virusløsning, fortynnet til ønsket titer, i forholdet 1:9 i et PCR-rør.
MERK: Raskt grønt fargestoff tilsetts for å lette visualisering av virusoppløsning under injeksjonen. - Koble polyetylenslangen med sprøyten, og fyll deretter slangen med mineralolje ved hjelp av en sprøytepumpe.
- Koble den indre kanylen til den andre enden av slangen, fyll og trekk mineraloljen noen ganger for å sikre at den indre kanylen ikke er tilstoppet.
- Bedøv dyret med isofluran (4% for induksjon, 1,5-2% for vedlikehold, 0,3-0,5 l / min lufthastighet), fest hodet i en stereotaxisk ramme over en varmepute (opprettholde 37 °C), påfør øyesalve.
- Trekk ut 600 nL av virusløsningen, fjern dummykanylen og sett den indre kanylen som er koblet til injeksjonssprøyten i føringskanylen, tilsett viruset med en hastighet på 50 nL / min i 10 minutter totalt.
MERK: Kontroller om fargestoffet er synlig gjennom vinduet ved hjelp av et stereomikroskop for å bekrefte vellykket virusinjeksjon (figur 5). - Etter injeksjon, hold den interne kanylen tilkoblet i 10 minutter for å la viruset spre seg under vinduet.
- Fjern forsiktig den indre kanylen fra føringskanylen og skap den med en dummy kanyle.
- Plasser dyret i et varmt bur til det gjenoppretter fra anestesi.
MERK: Vanligvis er mus klare til avbildning om 10-20 dager etter viral injeksjon. Uttrykksnivå og tid avhenger av virusets serotype og promotor som brukes til å drive genuttrykk.
4. Avbildning av våkne mus under bredfeltsmikroskop.
MERK: Den tilberedte hodeplaten gir ekstraordinær stabilitet av bildeimplantatet og gir dermed mulighet for langsgående avbildning i våken og oppførende mus med minimale bevegelsesartefakter.
- Induser musen med 4% isofluran i noen minutter, fest hodeplaten til hode gaffelen, og fest deretter hode gaffelen til tredemøllen.
MERK: Hode gaffelen og tredemøllen er tilpasset hodeplaten som brukes i denne studien, se Støttematerialer for de tilsvarende cad-filene. Induksjon av mus før hodefiksering er valgfritt, da det er mulig å habituate dyr for denne prosedyren. - Beveg tredemøllen under mikroskopstadiet og plasser det optiske vinduet under objektivlinsen.
- Bruk et objektiv med lav forstørrelse for å finne det beste synsfeltet (FOV) for funksjonell avbildning, og bytt deretter til et høyere NA-objektiv for å registrere nevronalaktivitetene med encellet oppløsning.
MERK: Hvis injeksjonskanylen fortsatt er et hinder for objektivlinsen for å oppnå arbeidsavstanden, bruker du en trådklipper til å kutte av injeksjonskanylen fra hodeplaten.
Representative Results
In vivo avbildning av nevronal aktivitet ved hjelp av en genetisk kodet kalsiumindikator. I gjennomsnitt starter in vivo-avbildning 3-4 uker etter implantasjon hvis et tilstrekkelig nivå av transgene uttrykk oppnås. På denne tiden er cerebral ødem og blødning vanligvis helt løst, og hjernevaskulatur kan lett observeres gjennom det optiske vinduet. Her benyttet vi det beskrevne preparatet for å utføre gjentatte opptak av nevronaktivitet i dorsal hippocampal CA1-regionen i å oppføre seg mus under fluorescens bredfeltmikroskop. For å registrere nevronal aktivitet brukte vi en lys genetisk kodet kalsiumindikator, kalt NCaMP713, som viser lignende kalsiumfølsomhet og temporal oppløsning som GCaMP6s14. For å uttrykke NCaMP7-indikatoren i hippocampus injiserte vi rAAV/DJ-CAG-NCaMP7-viruset ved hjelp av en infusjonskanyle og initierte lengdegradsavbildning etter 14 dager etter injeksjon. For å registrere nevronaktivitet brukte vi et 10x NA 0.3 luftmål objektiv og Hamamatsu OrcaFusion sCMOS-kamera som tillot avbildning ved ~ 1,5x1,5 mm FOV med opptil 100 Hz-frekvens. Grønn fluorescens ble begeistret av en kommersielt tilgjengelig 470 nm LED ved hjelp av et standard GFP-filtersett. Den gjennomsnittlige dybden av avbildning oppnådd i grønn kanal er ca 50-120 μm, noe som gjør det mulig å registrere nevronal aktivitet hovedsakelig i stratum oriens og stratum pyramidale. Bildedybden i nær-infrarøde kanaler kan være opptil 200 μm når de dypere lagene av hippocampus8. Gjennomsnittlig opptakstid per FOV var 6-12 min, selv om mye lengre bildebehandlingsøkter er mulig da NCaMP7 er preget av ekstremt høy fotostabilitet og ingen påviselig fototoksisitet ble observert (Figur 6).
Figur 6: Registrering av nevronaktiviteten i hippocampale nevroner ved hjelp av en grønn fluorescens genetisk kodet kalsiumindikator. (A) En valgt FOV avbildet under et vidfelt fluorescensmikroskop i grønn kanal. (B) De 15 ROIene som tilsvarer de enkelte nevronene vist i A og valgt ved hjelp av standardavviksprojeksjonen av hele opptaket. (C) Representativ fluorescens enkeltprøvespor av de 15 valgte nevronene i B. (D) En representativ zoom-in-visning av 2 kalsiumspor vist i tilsvarende fargebokser vist i C. Skala bar, 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
For å oppnå fluorescensspor ble interesseområdene (ROIer) som tilsvarer nevronale somas segmentert manuelt og analysert av ImageJ-programvare. Før bevegelseskorrigeringen av bildeanalysen var det ikke nødvendig med vanlige prosedyrer etter opptak hos våkne dyr, da de innsamvede datasettene ikke viste bevegelsesartefakter på grunn av den høye stabiliteten til bildeimplantatet. En representativ optisk registrering av nevronale aktiviteter fra hippocampus i en våken oppførende mus presenteres i figur 6. 15 ROIer som tilsvarer nevronale somaer, ble valgt manuelt fra samme FOV vist i figur 6B, og fluorescenssporene for enkeltforsøk i hver avkastning vises i figur 6C. Figur 6D viser to representative deler av fluorescensspor fra to forskjellige ROIer. Vi utførte 4 påfølgende bildebehandlingsøkter for samme FOV med 3-dagers intervaller. Det var mulig å identifisere og avbilde de samme nevronene i visse FOVer i minst to uker (de lengre bildebehandlingsøktene ble ikke utført for denne studien, men det samme preparatet har blitt brukt til opptil 6 måneder lang bildestudie hos mus tidligere7; Figur 7). I denne studien brukte vi AAV/DJ-CAG vektor, som drev et sterkt uttrykk for genet av interesse selv 21 dager etter viruslevering (Supplerende figur 1). Det kontinuerlige uttrykket kompliserte langsiktig identifisering av de samme nevronene på grunn av økt fluorescensbakgrunn og utseende av nye nevroner som uttrykker kalsiumindikatoren. Derfor bør valg av AAV-serotype og promotor for å drive målgenuttrykk være en av de viktige hensynene under eksperimentell design spesielt hvis langsgående avbildning av samme undergruppe av nevroner er nødvendig. Bildekvaliteten tillot å løse proksimale dendritter samt visualisere blodkar.
Figur 7: Bildesekvens av fire forskjellige FOVer fra hippocampalområdet sporet over 12 dager. Dyret ble implantert med vinduet på dag 0 og ble injisert med rAAV / DJ-CAG-NCaMP7-viruset på dag 7. Pilspisser angir nevronen som spores i FOV. Skalastenger: 80 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
In vivo-avbildning av nevronaktivitet ved hjelp av en genetisk kodet spenningssensor.
I denne studien brukte vi også en ny genetisk kodet spenningssensor, kalt SomArchon7, som muliggjør spenningsavbildning med encellet enkeltspissoppløsning i å oppføre dyr7,8. For å uttrykke SomArchon injiserte vi rAAV /DJ-CAG-SomArchon virus ved hjelp av en infusjonskanyle og utførte spenningsavbildning i en hodefast oppførselsmus flere dager etter injeksjon. For å registrere nevronaktivitet brukte vi en 40x NA 0.8 objektiv linse og Hamamatsu OrcaFusion sCMOS-kamera som tillot oss å bilde 150x40 μm FOV med opptil 830 Hz oppkjøpsgrad. GFP-proteinet, som er en del av SomArchon-konstruksjonen for å lette visualisering av uttrykk i det synlige spekteret, kan enkelt avbildes i den grønne kanalen (LED-eksitasjon ved 470/20 nm, utslipp 525/50 nm) for å finne celler av interesse for spenningsavbildning. Optiske spenningsopptak ble utført i den nær-infrarøde kanalen (lasereksitasjon 637 nm ved 3,4 W/mm2, utslipp 665 nm langpasning) med 4 x 4 binning ved 830 Hz oppkjøpshastighet. Vi registrerte den spontane aktiviteten til en hippocampal neuron i en våken mus med gjennomsnittlig SNR på 7 per handlingspotensial (figur 8).
Figur 8: Registrering av nevronaktiviteten i hippocampale nevroner ved hjelp av en nær-infrarød fluorescens genetisk kodet spenningsindikator SomArchon. (A) En valgt FOV avbildet under bredfelts fluorescensmikroskop i den nær-infrarøde kanalen. (B) Fluorescenssporing av nevronen i A. (C) En representativ zoom-in-visning av spenningssporet i den tilsvarende boksen vist i B. Skalalinje: 25 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Histologi
Etter at funksjonell bildestudie er gjort, brukes post-mortem analyse for å bekrefte riktig plassering av implantatet, området for virusuttrykk og lokalisering av et protein av interesse for avbildede nevroner. For histologisk verifisering av virusuttrykk og plassering av implantatet ble koronardeler av PFA fast hjerne undersøkt under et fluorescens bredt feltmikroskop (figur 9A, C). Et konfokalt mikroskop ble brukt til å skaffe høyoppløselige bilder av individuelle nevroner som uttrykker kalsiumindikatoren, samt spenningsindikatoren (Figur 9B, D). DAPI-farging ble brukt til å visualisere hjerneskivens generelle morfologi. I tillegg kan hjerneskivene vurderes ved hjelp av immunhiistokjemi for å verifisere astrogliose eller gliose forårsaket av vindusimplantasjon og viralt uttrykk. Våre tidligere studier viste at prosedyren ikke induserer merkbar gliose7.
Figur 9: Histologisk verifisering av den optiske vindusposisjonen og virusuttrykket. (A) Et representativt fluorescerende bilde av koronalseksjonens hjerneskive som viser plasseringen av det optiske vinduet fra en NCaMP-uttrykkende mus. Skalastang: 1 mm. (B) Et representativt konfokalt bilde av nevroner som uttrykker NCaMP7-indikatorene. Skalalinje: 25 μm. (C) Et representativt fluorescensbilde av koronaldelen hjerneskive som viser plasseringen av det optiske vinduet fra en SomArchon-uttrykkende mus. Skalastang: 1 mm. (D) Et representativt konfokalt bilde av nevroner som uttrykker SomArchon-indikatorene. Skalalinje: 25 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Mengdeanalyse av relativ fluorescensintensitet sammen med uttrykkstid. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Her beskriver vi en metode for langsiktig bildebehandling av hippocampus CA1-regionen i oppførende mus. Metoden er basert på kronisk implantasjon av et skreddersydd bildevindu, som også muliggjør målrettet administrering av virus eller legemidler direkte til nevronene av interesse. Den nåværende protokollen består av fire hoveddeler: i) montering av bildeimplantat; ii) installasjon av bildeimplantat; iii) virusinjeksjon via bildeimplantat; iv) funksjonell avbildning i å oppføre seg mus. Nedenfor beskriver og diskuterer vi kritiske trinn i protokollen, feilsøking, modifikasjoner og begrensninger av metoden. Vi diskuterer også betydningen av metoden og dens potensielle alternative anvendelser.
Det er flere kritiske trinn i den beskrevne protokollen som er ganske viktige for vellykket kirurgi: (i) forberedelse av et bildeimplantat av høy kvalitet; (ii) sterile kirurgiske forhold; (iii) aspirasjon av cortex; (iv) presis plassering av bildeimplantatet; (v) viral injeksjon. Som trinn 1.6 indikerer, vil overflødig loddeform kreve en større kraniotomi og dermed øke risikoen for betennelse. Det er også svært viktig å bruke en passende mengde lim optisk lim når du fester dekkglasset til bildekanylen, som angitt i trinn 1.11, da en utilstrekkelig mengde kan føre til lekkasje av cerebrospinalvæske i bildekanylen og gjøre den ugjennomsiktig. På den annen side kan overflødig optisk lim føre til redusert gjennomsiktighet av glassvinduet. Mulig kontaminering av bildeimplantatet kan føre til en aktiv spredning av bindevev under det optiske vinduet og/eller alvorlig betennelse, noe som vil føre til tidlig avslutning av eksperimentet. Derfor er avbildningsimplantatmontering og forberedelse før operasjonen nesten like viktig som selve kirurgiske prosedyren.
Under operasjonen er den delen av cortex under kraniotomi ablated av mild aspirasjon, noe som resulterer i uunngåelig blødning. Blod på operasjonsstedet reduserer synligheten av hjernevevet som må fjernes betydelig. Dette kompliserer den nøyaktige vurderingen av den nødvendige dybden av vevsablasjon. Forsiktig skylling av operasjonsstedet med PBS hver gang før påføring av sug for å fjerne neste del av vevet gir bedre kontroll over dybden. Hjernevevet bør alltid fjernes i små porsjoner trinn for trinn som bekrefter dybden av ablated vev før du fortsetter med mer sug. Finere kontroll av sug kan også oppnås med en tynnere stump nål. Vi foreslår at du bruker en 26 G nål, men mindre enn 26 G diameter er mer utsatt for tilstopping. Videre tar det vanligvis mye øvelse å bestemme den nøyaktige aspirasjonsdybden som kreves for hvert dyr, da fargen på cortex, corpus callosum og hippocampus kan variere fra mus til mus (figur 3).
Innsetting og sikring av bildeimplantatet bør gjøres veldig presist for å sikre nærmeste mulige posisjon av bildevinduet til dorsale overflate. Størrelsen på den tilberedte kraniotomien bør samsvare nøye med implantatet og tillate innsetting uten betydelig motstand. Samtidig bør det ikke være noe synlig gap mellom skallen og implantatet for å sikre riktig forsegling og unngå eksponering av hjernevev. Forsiktig og stabilt trykk skal påføres toppen av implantatet under forseglingen til skallen. Det er nesten uunngåelig å ha blod under bildevinduet under implantatinstallasjonen. Hvis den kirurgiske prosedyren er gjort riktig, bør vinduet rydde ut om 3-7 dager, og hjernevaskulaturen blir tydelig synlig. Det er også viktig å sikre at virus injiseres riktig under vinduet. Ved mislykket uttrykk kan virus injiseres på nytt flere ganger.
Den store komplikasjonen vi opplevde i noen tilfeller er redusert synlighet av bildevinduet. Det er flere mulige årsaker til dårlig bildekvalitet: i) pågående betennelse; ii) utvekst av bindevev på glasset; iii) stort gap mellom vinduet og hippocampus. Betennelse er vanligvis forårsaket av forurensning under operasjonen eller ved ikke riktig sterilisert bildeimplantat. Vi foreslår autoklavering av kirurgiske instrumenter før og etter hver operasjon, desinfiserer operasjonsområdet rett før prosedyren, og bruker rent personlig verneutstyr under operasjonen. Bildeimplantater bør rengjøres etter montering, sterilisert og oppbevares under sterile forhold. Utveksten av bindevev på glasset av bildeimplantat kan skyldes mekanisk forurensning på overflaten av glasset eller overdreven traumer i hjernevevet under cortex ablasjon. Etter montering av implantatet er det viktig å bekrefte at glassoverflaten er ren og glatt. Også alle biter av skadet hjernevev må fjernes forsiktig før du setter inn bildeimplantat i kraniotomien. I visse tilfeller resulterer gapet mellom glassvinduet og hippocampus i opphopning av cerebrospinalvæske, noe som reduserer kvaliteten på avbildningen. Derfor, under implantatinstallasjon, er det viktig å sette det helt inn for å sikre god kontakt mellom hippocampus og glassvindu. Noen ganger er det vanskelig å identifisere den eksakte årsaken til ugjennomsiktig bildevindu. Vi foreslår at du utfører post-mortem analyse for å avsløre forholdene under det optiske vinduet og tilsvarende justere påfølgende operasjoner.
Metoden har flere grunnleggende og tekniske begrensninger som bør tas i betraktning før og under in vivo-avbildning. En av de viktigste begrensningene er cortex ablasjon. En del av den visuelle og sensoriske cortex fjernes under operasjonen. Selv om det er vanskelig å nøyaktig evaluere virkningen av cortex ablasjon, som fjernet hjernevev ikke direkte projiserer på hippocampus, flere studier viste ingen merkbar svekkelse av hippocampal-avhengig læring eller andre relevante hippocampus funksjoner15,16. De optiske begrensningene bør også vurderes, spesielt når høye NA objektive linser brukes. For eksempel brukte vi i denne studien en 1,75 mm lang kanyle med en 1,9 mm indre diameter. Geometrien i denne kanylen vil ikke bevare hele NA av luftmålet med NA mer enn ~ 0,5 eller vannmål med NA mer enn ~ 0,6 som det vil klippe noe av lys. En annen begrensning, vanlig for alle hjerneavbildningsimplantater, er at en del av hjernen blir utsatt, og dermed fremmer varmetap17,18. Imidlertid kan fysiologisk hjernetemperatur lett gjenopprettes under avbildning ved perfusjon av en varm buffer.
Den beskrevne metoden kan enkelt endres eller justeres for andre applikasjoner. For eksempel kan preparatet tilpasses for avbildning av striatum7. Ettersom striatum ligger litt dypere enn hippocampus, bør den lengre bildekanylen brukes til montering av bildeimplantat. Vi foreslår at du bruker 2,0 mm bildekanyle. Koordinatene til kraniotomien bør justeres tilsvarende (AP: +0,8 mm, ML: −1,8 mm). I tillegg gjør virusinjeksjon via infusjonskanyle det mulig å oppnå uttrykket av en transgene i et tynt lag av nevroner når du bruker AAV-serotype med begrenset spredning19,20. Det er spesielt gunstig for en-foton bildebehandling på grunn av redusert out-of-focus fluorescens fra dypere lag og som et resultat forbedret encellet oppløsning bildebehandling. Videre kan injeksjonskanyle også brukes under funksjonell avbildning for administrering av legemidler eller andre kjemikalier direkte på nevronene i FOV (Figur 5B). Generell infusjonskanyle tilfører nyttige funksjoner til bildeimplantatet, forbedrer bildekvaliteten på grunn av det målrettede virale uttrykket og muliggjør farmakologisk stimulering av nevroner i FOV. Den brukte hodeplaten gir ekstraordinær stabilitet av bildeimplantat som minimerer bevegelsesartefakter selv i aktivt bevegelige dyr på en tredemølle. Hodeplaten er liten og lett, forårsaker minimal ubehag for dyr, og forblir stabil i flere måneder etter installasjon. Bildeimplantatet er også kompatibelt med multifotonavbildning15,16,21 og kan kombineres med mikro-endoskop22,23. Et lignende bildeimplantat ble også brukt til flerfotonavbildning av de dypere hippocampusstrukturene, inkludert stratum radiatum, stratum laktunose og dentate gyrus16,24,25,26,27. Imidlertid kan målretting av de dypere hippocampusstrukturene med AAVs via infusjonskanyle kreve ytterligere optimalisering av AAV-serotypen og volum19.
Vi tror at den beskrevne protokollen vil lette studier som tar sikte på å undersøke nevronal aktivitet med høy romlig oppløsning i hippocampus av oppføre seg mus ved hjelp av enkle og rimelige one-photon bildeoppsett.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke alle medlemmene av Molecular BioEngineering Group ved Westlake University for all hjelp og nyttig diskusjon. Vi takker også Jinze Li og Jie-Min Jia fra Westlake University for hjelpen med å filme den kirurgiske prosedyren.
Dette arbeidet ble støttet av oppstartsfinansiering fra Foundation of Westlake University, 2020 BBRF Young Investigator Grant, og National Natural Science Foundation of China grant 32050410298 alle til K.D.P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover glass | Deckgläser | 72296-03 | |
| Denture Base Resin | ShangHai New Centery Dentel Material | N/A | Type I, self-solidifying |
| Dummy Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62102 | OD 0.30mm |
| Guide Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62003 | 26G |
| Head Fork | N/A | N/A | Custom made |
| Head Plate | N/A | N/A | Custom made |
| Imaging Cannula | N/A | N/A | Custom Made; OD 3mm, ID 2.7mm, Height 1.8mm, #108 stainless steel |
| Internal Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62203 | 0.30*0.14 (OD*ID, mm) |
| Kwik Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | |
| SuperBond C&B | SUN MEDICAL | N/A | SuperBond C&B kit |
| Treadmill Kit | N/A | N/A | Custom made |
| UV-cured Adhesive | NORLAND PRODUCTS | NOA 60 |
References
- Leutgeb, S., et al. Independent Codes for Spatial and Episodic Memory in Hippocampal Neuronal Ensembles. Science. 309 (5734), 619-623 (2005).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
- Polanco, J. C., et al. Amyloid-β and tau complexity - towards improved biomarkers and targeted therapies. Nature Reviews Neurology. 14 (1), 22-39 (2018).
- Henneman, W. J. P., et al. Hippocampal atrophy rates in Alzheimer disease. Added value over whole brain volume measures. 72 (11), 999-1007 (2009).
- Camicioli, R., et al. Parkinson's disease is associated with hippocampal atrophy. Mov Disord. 18 (7), 784-790 (2003).
- Piatkevich, K. D., Murdock, M. H., Subach, F. V. Advances in Engineering and Application of Optogenetic Indicators for Neuroscience. Applied Sciences. 9 (3), 562 (2019).
- Piatkevich, K. D., et al. Population imaging of neural activity in awake behaving mice. Nature. 574 (7778), 413-417 (2019).
- Fan, L. Z., et al. All-Optical Electrophysiology Reveals the Role of Lateral Inhibition in Sensory Processing in Cortical Layer 1. Cell. 180 (3), 521-535 (2020).
- Shemesh, O. A., et al. Precision Calcium Imaging of Dense Neural Populations via a Cell-Body-Targeted Calcium Indicator. Neuron. 107 (3), 470-486 (2020).
- Villa, K. L., et al. Inhibitory Synapses Are Repeatedly Assembled and Removed at Persistent Sites In Vivo. Neuron. 89 (4), 756-769 (2016).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. Paxinos and Franklin's The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2013).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
- Subach, O. M., et al. Novel Genetically Encoded Bright Positive Calcium Indicator NCaMP7 Based on the mNeonGreen Fluorescent Protein. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1644 (2020).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice. Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Kalmbach, A. S., Waters, J. Brain surface temperature under a craniotomy. Journal of neurophysiology. 108 (11), 3138-3146 (2012).
- Roche, M., et al. In vivo imaging with a water immersion objective affects brain temperature, blood flow and oxygenation. eLife. 8, 47324 (2019).
- Watakabe, A., et al. Comparative analyses of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 8 and 9 in marmoset, mouse and macaque cerebral cortex. Neuroscience Research. 93, 144-157 (2015).
- Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Gene Therapy for Neurological Disorders: Methods and Protocols. Manfredssonn, F. P. , Springer. New York. 133-149 (2016).
- Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), (2016).
- Yashiro, H., Nakahara, I., Funabiki, K., Riquimaroux, H. Micro-endoscopic system for functional assessment of neural circuits in deep brain regions: Simultaneous optical and electrical recordings of auditory responses in mouse's inferior colliculus. Neuroscience Research. 119, 61-69 (2017).
- Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus. Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).
- Mizrahi, A., Crowley, J. C., Shtoyerman, E., Katz, L. C. High-Resolution In Vivo Imaging of Hippocampal Dendrites and Spines. The Journal of Neuroscience. 24 (13), 3147 (2004).
- Busche, M. A., et al. Critical role of soluble amyloid-β for early hippocampal hyperactivity in a mouse model of Alzheimer's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8740 (2012).
- Attardo, A., et al. Long-Term Consolidation of Ensemble Neural Plasticity Patterns in Hippocampal Area CA1. Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).
- Castello-Waldow, T. P., et al. Hippocampal neurons with stable excitatory connectivity become part of neuronal representations. PLOS Biology. 18 (11), 3000928 (2020).
