Summary
我们演示了一种通过过滤牙菌斑和与宿主细菌共同培养来隔离新型细菌植物（糖化物）难以生长的成员的方法。
Abstract
许多细菌物种不能在实验室中使用标准方法培养，这给研究地球上大多数微生物多样性造成了重大障碍。培养这些未培养的细菌需要新的方法，以便研究人员能够使用实验室中可用的强大工具有效地研究他们的生理和生活方式。候选菲拉辐射（CPR）是最大的未培养细菌群之一，占地球上生物多样性的15%。这个组的第一个分离体是糖化植物群的成员，即"纳米辛巴克特利库斯"菌株TM7x。 TM7x是一种异常小的细菌，它作为共生体与细菌宿主 夏利亚·奥东托利卡 直接接触，株XH001。利用异常小的细胞大小和它作为共生生物体的生活方式，我们开发了一个协议，从牙菌斑快速培养糖精。该协议将展示如何通过0.2μm过滤器过滤牙菌斑的悬浮，然后浓缩收集的糖精细胞，并感染宿主生物培养物。由此产生的共生可以通过任何正常的细菌培养和感染由PCR确认。由此产生的二元培养可以在实验室中保持，并用于未来的实验。虽然污染是有可能的，但可以通过进一步过滤和重新感染宿主，或电镀二元文化和对受感染的殖民地进行筛选来净化二元文化。我们希望此协议可以扩展到其他样本类型和环境，从而在 CPR 中培育出更多物种。
Introduction
培育新品种的细菌并把它们带进实验室，可以进行强有力的实验，以更好地了解它们的生理和微生物群落内更广泛的相互作用。虽然有无文化的方法来询问这些问题（例如，"元经济学"），但不同微生物群的复杂相互作用使得很难区分单一变量并得出有意义的结论。虽然培养细菌有很多好处，但分离细菌并在纯文化中生长细菌存在许多潜在的障碍。潜在的特定生长要求包括pH、氧张力、维生素、生长因子、信号分子，甚至直接接触细胞以引起生长1。然而，人们认为，特定的辅助营养素是培养新细菌的主要威慑力量。标准介质配方缺乏未培养的细菌所需的许多营养物质，如特定的维生素或碳来源。这些缺失的分子可能是未培养细菌生理学的关键，通常由微生物群落中的另一个生物体或宿主生物体提供。例如，复杂的碳水化合物，如粘液，可以由动物宿主提供。将这些添加到媒体已经允许从动物肠道培养出一些细菌，包括阿克曼西亚粘液和穆奇尼沃兰斯希鲁迪尼斯2，3，4。许多致病细菌已经进化出在动物细胞中使用与海明结合的铁的能力，包括口服病原体波菲罗莫纳斯银杏5。在实验室中，生长的波菲罗莫纳斯和其他生物体，可以通过添加海敏6来刺激。
最近，在培育细菌新分离物方面取得了许多突破，通过联合培养，利用"喂食者"生物体为未培养的细菌提供生长所必需的特殊因素。Vartoukian及其同事的一项优雅研究表明，由细菌产生的铁结合分子侧马刺激了几种新型口腔分离物的生长。皮奥弗丁斯，一种由伪莫纳德物种产生的侧磷， 被证明显著促进一个新的 普雷沃泰拉 物种7的生长。在同一项研究中，培育了第一个用于叶绿素的口腔分离物，也使用 F.核 作为帮助者，提供一些未知化合物7。最近，一种来自 鲁米诺科卡塞 属的细菌被分离使用 细菌作为 帮助生物体8。后来发现，伽马氨基丁酸（GABA）是一种抑制性神经递质，需要在实验室介质上生长。事实证明，使用支线生物体是模仿未培养细菌生长的特定微环境的关键策略，比用不同浓度的不同添加剂不断重新调节生长介质更有效。
最大的未培养细菌群之一是在"候选菲拉辐射"（CPR），一个由几个候选细菌植物组成的单物理组9，10。截至本文撰写时，只有CPR内的糖精植物成员在实验室中成功培养。第一种分离物，'纳米辛巴克特裂解剂'菌株TM7x，是使用抗生素链霉素分离的，据预测，这种链霉素将丰富未培养的TM711，12。这项工作的一个关键发现是，新的分离物生长为一种寄生虫，生长在与细菌宿主沙利亚奥冬利卡的直接接触中，显微镜显示这些寄生虫是超小细菌。
利用这些线索，我们设计了一种方法，通过0.2μm过滤器过滤牙菌斑和其他口腔样本，通过离心收集过滤液中的细胞，并利用它们感染候选宿主细菌的培养物，从而迅速建立糖精的二元共生。这种方法具有避免富集培养的优点，因为富集文化可能被快速增长的生物所淹没。它还避免使用抗生素，这可能阻止目标糖精物种或其宿主的生长。利用这里演示的方法，我们成功地培养了32个分离出糖精植物。
Protocol
在制定此协议时，寻求并批准 IRB 批准（#14-10），并征得所有主体的知情同意。
1. 准备
- 在与人类主体合作时，获得必要的 IRB 批准和知情同意。
- 开始培养宿主细菌，有足够的时间生长到早期静止阶段。例如，接种2-5毫升的试用大豆汤，加入0.1%酵母提取物（TSBY），加入 阿拉奇尼亚丙酸酯 ，在37°C孵育24小时。
- 用履带蚀刻的 0.2μm 滤膜组装滤芯支架。将装配件包裹在铝箔中，然后通过高压灭菌。
- 消毒离心管和盖组件。
2. 获取口腔细菌样本
注：虽然许多口腔样本中含有糖精（如唾液、扁桃体拭子、舌头刮伤），但牙菌斑通常是最成功的。
- 使用无菌纸点 Gracey curette 刮牌，或者，如果进行自采样，使用无菌牙签或移液器尖端。将斑块转移到合适的缓冲区，如最大恢复稀释剂（MRD，0.85%纳克，0.1%肽）或PBS。如果不立即处理，请将样品放在冰上，直到准备继续。
- 使用涡流和管道与小管道尖的组合，大力恢复 MRD 缓冲器中的牙菌斑。
- 将重复的斑块样品添加到额外的 9 mL MRD 缓冲区。
3. 从口服样品中准备过滤
- 使用无菌技术，拆解无菌过滤器组件。取消四分之一转弯并重新紧固过滤器支架，以确保线程正确接合，设备正确关闭。使用注射器，通过仪器通过 10 mL 的 MRD 缓冲器清洗膜。在此步骤中，流体从滤芯支架中泄漏出，从而暴露出装配不当。如果发生泄漏，获取另一个无菌过滤器组件并重复洗涤步骤。
- 将样品应用到已洗涤的过滤器中。从注射器中取出柱塞并将其连接到滤镜设备上。将分散的牙科样品（现在在 10 mL 的 MRD 缓冲器中）倒入注射器中，并将其加载到过滤器中。
- 在过滤器装置下方放置无菌离心管以捕获滤液，然后对柱塞施加光压，将样品推过过滤器。
- 用另一个 10 mL 的 MRD 缓冲器重复该过程以清洗膜，在与过滤样品相同的管中收集流经。怀疑地盖管。
4. 通过离心浓缩糖精细胞
- 在管子和盖子上做一个方向标记，并将管子放在高速离心机中，上面有标记。离心形成的颗粒通常是看不见的。当离心和从离心机中取出管子时，标记将有助于确定糖霉细胞的颗粒位于何处。
- 在 4 °C 下以 60，000 x g 的速度将样品以 1 小时的速度离心。
注意：这种力量和时间足以颗粒所有糖精细胞。然而，糖精细胞至少可以通过离心机在20，000 x g下进行20分钟的局部压 低。 - 小心地从离心机中取出管子。将液体从管子中倒出，将颗粒保持在管子的上侧。
- 通过剧烈的涡旋，将通常看不见的颗粒在 1-2 mL 的 MRD 缓冲器中恢复。
5. 用富含糖精的丝虫感染宿主文化
- 将 2 mL 的适当生长介质（如 TSBY、BHI 等）加入管中，准备培养管。
- 在每个管子中加入200μL的宿主生物的隔夜培养。将 100-200 μL 的再悬念、过滤样品添加到每个管中。
- 在 A. propionica的有氧大气中孵育适合宿主有机体的组合样品（例如，37 °C）。
- 通过将200μL的二元培养转移到新管中2mL的新鲜生长介质，每两到三天通过细胞。如果通道文化似乎没有增长（即，进入新鲜媒体后，文化的浊度/光密度不会增加），那么糖精可能会压倒或杀死所有宿主有机体。为了解决这个问题，在传递细胞时添加 200 μL 未受感染的宿主培养。重复至少5段。
6. 确认PCR感染
- 经过5段，确认感染PCR。五个通道将确保比任何非生长的糖精细胞已经耗尽超过检测极限使用25个周期的PCR。
- 准备 PCR 主混合。建议使用的配方如下，对于所需的每个管，准备 12.5 μL 2x PCR 缓冲器， 0.75 μL 10 μM 前进引言 （580F12 - AYT G CGT AAG TTG C）， 0.75 μL 10μM反向引言（1177R13- 广汽CTG ACA TCC CCT TCC），1μL 25m MgCl2 和 9 μL 水。通过漩涡混合。
- 将主混合的24μL报价放入0.2 mL PCR管中。在 PCR 反应中添加 1μL 的糖精感染文化。将管子放在恒温器中，执行以下协议：初始变性 95 °C 5 分钟，25 周期 95 °C 代表 30 秒，60 °C 代表 30 秒，72 °C 代表 30 秒，最终拉长在 72 °C 2 分钟，最后保持在 4 °C。
- 以 1% 的蔗糖凝胶装载和运行 PCR 产品。一个约600个碱基的频段将指示糖精的存在。
7. 检查纯度并去除污染物
- 通过将糖精的共生物质电镀在足以生长宿主有机体生长的营养物质上，确认正文化的纯度。在无菌缓冲区（如 MRD 或 PBS）中对培养进行 10 倍的连续稀释，并在 agar 板上传播 100 μL。进行稀释，以便在阿加板块上生长大约 20-200 个殖民地。
- 在适当的生长条件下孵化培养物，并观察污染物生物。
注：Axenic糖精菌群从未被观测到，因此只有宿主生物体生长在这些板块上。不止一种菌落类型通常表示污染。如果发生污染，应重新过滤培养物，以去除不需要的污染物，并重新接种到新鲜宿主。 - 偶尔会发生双重感染，其中两种糖精感染同一宿主。要分离糖精物种，请在 20μL 无菌 PBS 中恢复单个菌落，并在 PCR 反应中使用 1μL 悬浮物来检测有糖皮菌感染的菌落。
- 将对增长媒介产生积极影响的暂停转移，以启动二元文化。成功率将取决于文化中每个糖精物种的滴定。可能需要筛选超过50个菌落，以找到受感染的菌落进行传播。
8. 文化储存
- 一夜之间培养出足够体积（10-50 mL）的二元文化。
- 通过离心（4，000 x g 10分钟）对颗粒细胞进行分化。
注意：这里不需要高速离心，因为糖精细胞将附着在宿主更大、更重的细胞上，并随它们一起颗粒。 - 在低温保护剂中恢复细胞。生长介质辅以 5% DMSO 或 20% 甘油通常就足够了。确保宿主有机体与低温保护介质兼容（例如 ，A. 丙酸酯 的生长受到甘油的抑制，冷冻库存可能不会恢复）。用低温保护剂测试未受感染的宿主文化的可行性，以确保库存能够在冻结中存活。
- 以相同的培养量（10-50 mL）重新喷射细胞颗粒。阿里报价 0.5 mL 到标记的低温。冻结在-80°C的细胞培养。
Representative Results
用于检测糖精的 PCR 在初始感染培养中可能出现阴性（即未看到任何产品），原因是糖精共生体数量少。然而，经过几段后，一个强大的PCR产品应该出现，表明已经发生了稳定的感染（图1A）。相反，一些感染最初会显示为 PCR 阳性，但在 1-4 段（未显示）后会减弱为检测不到。这表明，在最初的过滤中存在大量的糖精细胞，但通过通道稀释，没有一个能够与宿主培养物进入一个稳定的共生。测试几个宿主物种与相同的糖精过滤从口腔通常会有一个较低的成功率（图1B），因为共生宿主相互作用是非常具体的。研究人员还可以用来自几个不同受试者的滤丝测试同一主机。如果使用良好的宿主有机体（如阿拉契尼亚丙酸或夏利亚奥顿利蒂卡），成功率可以预期为50%。
PCR 的测试至关重要。经验丰富的研究人员试图通过显微镜确认感染，结果报告误报。糖精细胞很小，很难区分囊泡或不规则的细胞包络凸起。PCR 信号通过多个通道稳定是确认成功感染的关键。
随着受感染文化的生长，正常浊增长应该会出现。随着共生体的建立，受感染的文化将比未受感染的宿主生物体的培养物（图2A）显得不那么浑浊。在某些情况下，受感染的文化可能看起来完全停止生长，根本不会变得浑浊。这可能是由于一种感染，其中糖精细胞压倒宿主有机体。在这些文化中增加"新鲜"（未受感染）宿主应提供充足的宿主人口，以支持糖精寄生虫的持续生长。
过度生长或过度浑浊的培养物可能表明实验室污染物或其他能够通过 0.2 μm 过滤器的小口腔细菌污染。 坎皮洛菌 和 卡普诺西托法加 是这些实验的典型口服污染物。这可以通过电镀培养物和寻找宿主生物体的非典型殖民地，然后是16S rRNA测序来证实。如果发现污染，通过 0.2 μm 过滤器过滤这些培养物通常足以去除污染物。过滤中的糖精细胞可以通过离心浓缩，并用于重新感染纯宿主培养物。
净化受污染文化的另一种方法是从电镀受感染的文化中挑选受感染的菌落。与未受感染的殖民地（图2B-D）相比，受感染宿主的殖民地有时可以通过不规则的殖民地形状来识别。这些不规则的殖民地依赖于二元文化中的糖精滴定，如果滴定值较低，则小部分殖民地将显得不规则。这可以很容易地识别受感染的殖民地，可以挑选和用于启动纯粹的二元文化。如果在糖精受感染文化的电镀上看不到不规则的菌落，则共生体可能处于低滴度或不会导致形状不规则的菌落。在这种情况下，具有正常外观的 PCR 筛查菌落可以显示糖精感染，但感染率较低（占所有菌落的 2-10%）。
图1：宿主文化的糖精感染的典型PCR结果。 （A） 表明糖精存在的PCR产品可能不会在初始感染时出现，但随着共生文化的建立，在随后的通道中可能出现并变得更强。（B） 大多数感染富含糖精的纤维化物的宿主不会支持其生长，因为共生的特殊性。在此示例中，只有 A. 丙丙尼卡 成功感染。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：受感染的沙克丽西亚文化的生长特征。 （A） 显示受感染文化的 受 感染和未受感染文化的生长曲线不会增长到与未受感染的控制相同的密度，并且显得不那么浑浊。（B-D）合金的电镀可以产生不规则的殖民地，由糖精感染引起。与科文化中的糖精滴定相比，不规则菌落的比例将会降低。（B） 具有高水平的糖精主机。（C） 10 倍稀释的糖精（D） 未受感染的宿主文化。白箭头表示不规则殖民地的例子。缩放条形=1厘米。请单击此处查看此图的较大版本。
Discussion
我们过滤斑块并将其应用于宿主生物的纯种培养物的方法，主要基于早期对第一种培养糖精的观察，"纳米辛巴克特利蒂库斯"菌株TM7x 11、14、15。鉴于细胞体积小，我们推断它们可以使用过滤器与牙菌斑分离，并浓缩为离心。其次，由于这些生物体作为寄生虫生活，提供这些细胞纯正的宿主培养将允许它们进入共生并成长为二元文化。
这种方法的一个优点是，它不需要丰富文化或选择性的压力。"纳米细胞裂解剂" 菌株TM7x是从一种富集培养培养而来，使用链霉素作为选择性剂，测序表明，这种菌株对糖精的丰富是有效的。偶然的是，"纳米辛巴克特利蒂库斯"的主持人夏利亚·奥东托利蒂卡，已知对链霉素16具有抗药性。使用抗生素作为选择性剂也可以阻止宿主有机体生长，这反过来又会阻止糖精的生长。
使用浓缩培养物的一个更大的问题是，快速生长的生物体将迅速取代感兴趣的生物体。例如，在口腔中， 链球菌 物种可以快速生长，如果生长介质中含有糖分，则产生足够的酸来酸化介质，从而进一步选择与感兴趣的生物体对抗。通过避免富集培养和选择性抗生素，我们的方法提供了一个通用的方法，可以应用于更广泛的糖精和潜在的宿主没有这些其他方法的并发症。
此处介绍的方法存在一些障碍。首先，这种方法假定糖精生活在二元文化中。我们还没有测试三元或三元培养物的组合来衡量它们的有效性，但很可能有糖精需要生长因子，而单个宿主有机体无法提供这些生长因子。测试能够支持糖精生长的口腔细菌的巨大组合将是一项艰巨的任务。其次，该方法假定所有糖精都足够小，足以通过 0.2 μm 过滤器。可能是其他糖精比相信的要大，过滤器正在针对这些生物体进行选择。可以使用孔径较大的过滤器，但这有让更多不需要的口腔细菌进入受感染的共培养的风险。最后，在已经发表的物种之外很难找到宿主物种。到目前为止，唯一成功的宿主是来自类Actinomyces，沙利亚，阿拉奇尼亚和纤维素菌的物种，所有成员的植物actino细菌15，17，18。然而，这些主机只支持特定的糖精的发展。为了培养更多的糖精物种，必须探索更多的宿主。
我们希望这里介绍的方法将有助于未来对糖精和其他心肺复苏生物的研究。元基因组测序表明，这些生物体也有小基因组，被怀疑是共生体或依靠当地微生物群落来供应代谢物和其他对其生存至关重要的因素。类似的过滤策略可以用来隔离这些生物体，只要它们足够小，并且它们的宿主生物可以培养。这里描述的方法是将实验室培养的强大工具带到这个庞大而多样化的细菌群体的第一步。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢安妮·坦纳、布鲁斯·帕斯特、海克·博伊斯弗特、何雪松和巴特比勒格·博尔的有益讨论和提供细菌菌株。我们感谢苏珊·约斯特和杰西卡·伍兹的微生物技术援助。本出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院国家牙科和颅面研究所的支持，奖励编号为R37 DE016937（FED）、R01 DE024468（FED）和T32 DE007327（AJC）。内容完全由作者负责，不一定代表国家卫生研究院的官方观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Alphaimager | Cell Biosciences | FluorChem HD2 | Or equivalent UV gel imaging system |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Brain Heart Infusion Broth (dehydrated powder) | Becton-Dickinson | 211059 | Or other growth media suitable for target organisms |
| Centrifuge Rotor 70-Ti | Beckman Coulter | 337922 | |
| Cryovials | Fisher Scientific | 12-567-500 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Electrophoresis Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Electrophoresis Rig | Bio-Rad | 1704467 | |
| Filter Forceps | Millipore Sigma | XX6200006P | Not essential, helps ensure filters are not punctured during handling |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| GoTaq Green Mastermix | Promega | M7122 | |
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | 950040025 | Or equivalent thermocycler for PCR |
| MgCl2 solution 25mM | Promega | A3513 | |
| Molecular Biology grade water | Fisher Scientific | BP2819100 | |
| O2 Control InVitro Glove Box | Coy Laoratories | 031615 | If needed for microaerobic organisms |
| Optima L-100 XP High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | |
| P-10 micro pipette | Gilson | F144802 | |
| P-1000 micro pipette | Gilson | F123601G | |
| P-2 micro pipette | Gilson | F144801 | |
| P-20 micro pipette | Gilson | F123600 | |
| P-200 micro pipette | Gilson | F123602G | |
| PBS | Fisher Scientific | BP399500 | |
| PCR tubes 0.2 mL | Fisher Scientific | 14-230-205 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
| Pipette tips - 10 μL | Fisher Scientific | 02-717-157 | |
| Pipette tips - 1000 μL | Fisher Scientific | 02-717-166 | |
| Pipette tips - 20 μL | Fisher Scientific | 02-717-161 | |
| Pipette tips - 200 μL | Fisher Scientific | 02-717-165 | |
| Polycarbonate filters - 47mm, 0.2 μm pore size | Millipore | GTTP04700 | |
| Screw-cap conical centrifuge tubes 15 mL | Falcon | 352096 | Or other tube suitable for bacterial culture |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Swin-Lok Filter - 47mm | Whatman | 4200400 | |
| SYBR Safe DNA Gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Syringes - 20 mL | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
| TAE Buffer (50x) concentrate | Fisher Scientific | P1332500 | |
| Thickwall Polycarbonate 25 x 89 mm (26.3mL capacity) centrifuge tubes with caps | Beckman Coulter | 355618 | |
| Tryptic Soy Blood Agar Plates | Northeast Laboratory Services | P1100 | Or other agar plate sufficient for growth of host organisms |
| Tryptic Soy Broth (dehydrated powder) | Becton-Dickinson | 211825 | Or other growth media suitable for target organisms |
| Vinyl Anaerobic Chamber | Coy Laboratories | 032714 | If needed for anaerobic organisms |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 |
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